響應(yīng)面法優(yōu)化烏飯樹葉總黃酮的提取及抗腫瘤活性研究

謝俊俊，陳海清，尹偉

1.江西省藥品檢查員中心，江西 南昌 330029；2.合肥職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 合肥 238010

烏飯樹（Vaccinium bratetum）Thunb.為杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬常綠灌木，在我國江西、湖南、湖北、安徽及廣東等地廣泛分布，其樹葉中含有廣泛的營養(yǎng)成分和藥物活性成分。有研究表明［1］，烏飯樹葉中的營養(yǎng)成分和藥物活性成分在抗疲勞、延緩衰老、增強(qiáng)免疫力、抗氧化、抗菌、抗病毒等方面有明顯作用，尤其是烏飯樹葉總黃酮在抑制腫瘤方面具有較好的應(yīng)用前景［2］。本研究采用響應(yīng)面分析方法優(yōu)化烏飯樹葉總黃酮的提取工藝，并考察了其體內(nèi)抗腫瘤活性，旨在發(fā)現(xiàn)烏飯樹葉的藥用價值。

1 材料

1.1 材料與試劑

烏飯樹葉（干燥品，購自樟樹市藥材市場，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)王道群教授鑒定其為烏飯樹葉），蘆丁對照品（青島泰東制藥有限公司，批號：10082-2021707），乙醇（分析純，東莞市勛業(yè)化學(xué)試劑有限公司）。4T1（小鼠乳腺癌細(xì)胞）荷瘤小鼠（BALB/c）、A549（人肺癌細(xì)胞）荷瘤小鼠（BALB/c）（安徽盛鵬實(shí)驗(yàn)動物科技有限公司）。甲氨蝶呤（湖北興銀河化工有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外分光光度計(jì)（上海默威生物科技有限公司）、電子天平（江蘇金壇三金實(shí)驗(yàn)器材有限公司）、BK 型超聲波萃取器（納博科超聲波有限公司）、離心機(jī)（浙江三聯(lián)環(huán)?？萍脊荆?。

2 提取方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將蘆丁對照品在120 ℃干燥至恒重，精密稱定10.0 mg 置100 mL 量瓶中，用80%乙醇溶解并定容至刻度，精密量取上述對照品溶液0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，分別置于25 mL 量瓶中，室溫靜置20 min，最終濃度分別為：0 mg/mL、0.004 mg/mL、0.008 mg/mL、0.012 mg/mL、0.016 mg/mL、0.020 mg/mL。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程縱坐標(biāo)為吸光度（y），橫坐標(biāo)為蘆丁對照品濃度值（x），回歸方程為：y=13.32x-0.64（r=0.999 7），線性濃度范圍為：0～0.020 mg/mL。

2.2 烏飯樹葉總黃酮提取工藝及含量測定

烏飯樹葉冷風(fēng)干燥后粉碎過200 目篩，精密稱取一定量的粉碎樣品置100 mL 燒瓶中，加入適量80%乙醇，用超聲波萃取器進(jìn)行加熱回流、超聲萃取、抽濾，充分提取3 次［3］，所得提取液在3 000 r/min下離心，取上清液定容，室溫放置20 min，用紫外分光光度計(jì)測定提取液吸光度，計(jì)算總黃酮含量和提取收得率。

3 提取單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)及結(jié)果

3.1 提取單因素實(shí)驗(yàn)及結(jié)果

3.1.1 提取時間的影響恒定提取工藝中的超聲功率和液料比，考察不同提取時間對總黃酮含量的影響，考察的提取時間分別為30 min、60 min、90 min、120 min、150 min。從圖1（A）可見，總黃酮含量在120 min 時達(dá)到峰值，總體表現(xiàn)為先升后降趨勢；總黃酮含量在提取120 min 后開始下降，可能為其發(fā)生了降解，且降解速度與提取時間呈現(xiàn)正比關(guān)系［4］。

3.1.2 液料比的影響恒定提取工藝中的提取時間和超聲功率，考察不同液料比（10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1）與總黃酮含量之間的關(guān)系。從圖1（B）可見，當(dāng)液料比在40∶1 時，總黃酮含量達(dá)到峰值后，持續(xù)增加提取溶劑的比例，烏飯樹葉總黃酮含量并未持續(xù)增加。

圖1 各單因素實(shí)驗(yàn)對烏飯樹葉總黃酮的影響：A.提取時間；B.液料比；C.提取超聲功率：

3.1.3 超聲波功率的影響恒定提取工藝中的提取時間和液料比，考察不同提取超聲波功率（30、60、120、240、360 W）對總黃酮含量的影響。從圖1（C）可見，總黃酮含量在提取功率240 W 時達(dá)到峰值，總體表現(xiàn)為先升后降趨勢，可能原因?yàn)檫^高超聲波功率會破壞并分解黃酮成分。

3.2 響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝

3.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果將上述“3.1”的單因素實(shí)驗(yàn)，作為提取工藝優(yōu)化的基礎(chǔ)，利用Box-Benhnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)法［5］對烏飯樹葉總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，將提取時間等單因素作為自變量，烏飯樹葉總黃酮提取率作為應(yīng)變量，考察了單因素不同水平的影響，通過Design-Expert 8.0.6 軟件，得到響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的方案以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果，具體數(shù)據(jù)詳見表1、表2。

表1 提取因素與水平設(shè)計(jì)表

表2 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

3.2.2 響應(yīng)面回歸擬合結(jié)果實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)過Design-Expert 8.0.6 軟件回歸擬合，烏飯樹葉總黃酮各因素回歸方程：Y（總黃酮百分量）=42.85+0.072A+0.11B+0.060C-0.50AB+0.16AC-0.11BC-1.33A2-0.61B2-0.79C2。方程式將3 個單因素（提取時間、液料比、提取超聲功率）都進(jìn)行編碼處理，由表3 可知，單因素二次項(xiàng)多元回歸擬合結(jié)果表明單因素交互項(xiàng)對總黃酮提取工藝有顯著影響（P＜0.001）。

表3 回歸分析結(jié)果

3.2.3 響應(yīng)面圖及等高線分析將不同交互項(xiàng)分別做出三維響應(yīng)面圖和對應(yīng)二維等高線，響應(yīng)面圖和對應(yīng)等高線均能直觀反映單因素和響應(yīng)值（Y）三者之間的交互作用關(guān)系。從圖2 中可見，當(dāng)某個單因素保持一定時，烏飯樹葉總黃酮提取率會隨著其他兩個單因素的增加，表現(xiàn)出先升后降趨勢，此結(jié)果表明單因素兩兩之間交互作用顯著，且對烏飯樹葉總黃酮的提取收率呈顯著影響關(guān)系。

圖2 兩單因素交互作用對含量影響的響應(yīng)面和等高線圖：I.提取時間與液料比；II.提取時間與超聲波功率；III.液料比與超聲波功率

3.2.4 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)經(jīng)過對實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行驗(yàn)證分析，烏飯樹葉總黃酮提取最佳工藝參數(shù)為提取時間（120 min）、提取超聲功率（240 W）、液料比（40∶1），最佳提取工藝的總黃酮理論收率為41.3 mg/g。為驗(yàn)證提取工藝效果，按照上述工藝參數(shù)進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，3 次平行實(shí)驗(yàn)的總黃酮收率平均值為40.7 mg/g，與理論預(yù)測值對比的RSD＜5%。

4 烏飯樹葉總黃酮的體內(nèi)抗腫瘤活性

4.1 烏飯樹葉總黃酮的制備

按照上述響應(yīng)面優(yōu)化方法提取烏飯樹葉總黃酮，并采用硝酸鋁法測定總黃酮純度（對照品為蘆?。罱K測得總黃酮純度為86.34%。

4.2 烏飯樹葉總黃酮的體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

分別選取25 只4T1（小鼠乳腺癌細(xì)胞）和25只A549（人肺癌細(xì)胞）的BALB/c 荷瘤小鼠作為實(shí)驗(yàn)對象，稱重后兩種小鼠均隨機(jī)分為5 組。5 組分別為空白對照組（相同體積PBS：磷酸鹽緩沖生理鹽水）、MTX 組（甲氨蝶呤，腹腔注射，20 mg/kg，隔日1 次）、烏飯樹葉總黃酮低、中、高劑量組（灌胃給藥50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg，1 次/d），連續(xù)給藥12 d 后，處死小鼠，稱重分離出腫瘤組織。抑瘤率公式：抑瘤率（%）=（C-T）/C×100%（C：對照組腫瘤質(zhì)量，T：給藥組腫瘤質(zhì)量）。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS18.0 軟件處理，采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，當(dāng)P＜0.05 時表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表4。

表4 烏飯樹葉總黃酮對荷瘤小鼠腫瘤的抑制效果（）

表4 烏飯樹葉總黃酮對荷瘤小鼠腫瘤的抑制效果（）

由表4 可知，小鼠在烏飯樹葉總黃酮給藥后體重正常，烏飯樹葉總黃酮給藥組小鼠與空白對照組的體重相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。烏飯樹葉總黃酮高劑量組腫瘤質(zhì)量比空白對照組小，高劑量組、MTX 組的抑瘤率與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

5 討論

近年來，烏飯樹葉中化學(xué)成分的藥用價值［6-7］，受到藥學(xué)工作者的廣泛關(guān)注，尤其是烏飯樹葉中含有的黃酮類化學(xué)成分，逐漸成為研究熱點(diǎn)。因?yàn)檠芯勘砻鳎?］，烏飯樹葉中的總黃酮成分，在治療腫瘤上有較好的作用，如人體前列腺癌細(xì)胞株等，Barbara 等［9］的研究證實(shí)了這點(diǎn)。本研究通過Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法及對響應(yīng)面資料分析，建立了烏飯樹葉總黃酮提取工藝的數(shù)據(jù)模型，通過建立的回歸擬合方程分析了單因素交互項(xiàng)對提取工藝的影響，采用響應(yīng)面分析法繪制了響應(yīng)面圖和對應(yīng)等高線，并描述了單因素和響應(yīng)值（Y）三者之間的交互作用關(guān)系，最終得出提取工藝的最佳參數(shù)。通過3 次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，總黃酮收率與理論預(yù)測值相符性良好。

本研究為進(jìn)一步觀察烏飯樹葉總黃酮的抗腫瘤活性，選擇4T1 和A549 的BALB/c 荷瘤小鼠作為實(shí)驗(yàn)對象，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，烏飯樹葉總黃酮高劑量組腫瘤質(zhì)量明顯低于空白對照組，高劑量組抑瘤率與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)烏飯樹葉總黃酮具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，進(jìn)一步完善了烏飯樹葉總黃酮的抗瘤譜［10］，為提高烏飯樹植物資源的綜合利用，從天然動植物中尋找更加高效、低毒的抗腫瘤藥物奠定了一定基礎(chǔ)。