草海桐銅鋅超氧化物歧化酶基因的克隆及序列分析

張靜文，張力文，嚴(yán)云香，常 義，陳 艷，李欣勇

(1.海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/熱帶島嶼生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?571158；2. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州 571737)

【研究意義】植物受到逆境脅迫，如干旱、高鹽、低溫等，會(huì)誘導(dǎo)活性氧(ROS)的大量累積，ROS可導(dǎo)致生物分子損傷、凋亡或壞死、影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育[1]。超氧化物歧化酶(Super oxide dismutase，SOD)是一種重要的抗氧化酶，在清除自由基、維持活性氧代謝平衡、保護(hù)膜結(jié)構(gòu)的功能及延遲衰老、保護(hù)組織和細(xì)胞免受氧化損傷方面起著重要作用。草海桐 (ScaevolasericeaL.) 作為一種鹽生植物，因其抗逆性強(qiáng)而廣泛分布于沿海沙灘、石礫地。研究表明伴隨著鹽濃度的升高，草海桐可通過(guò)增加抗氧化酶活性清除活性氧，降低鹽脅迫對(duì)植物的傷害[2-3]。因此，本研究運(yùn)用生物技術(shù)方法從草海桐中克隆銅鋅超氧化物歧化酶基因，可為草海桐耐鹽脅迫相關(guān)分子機(jī)制及超氧化物歧化酶的深入研究提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】SOD是一類金屬酶，根據(jù)酶的輔因子的不同可分為4類：銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)、錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、鐵超氧化物歧化酶(Fe-SOD)和鎳超氧化物歧化酶(Ni-SOD)[4]。該家族可催化超氧化物陰離子歧化為過(guò)氧化氫，進(jìn)一步被過(guò)氧化氫酶和過(guò)氧化物酶消除，轉(zhuǎn)化為無(wú)毒害作用的水和氧分子。Mn-SOD和Fe-SOD存在于線粒體、過(guò)氧化物酶體和葉綠體中。其中，Cu/Zn-SOD主要存在于葉綠體、細(xì)胞質(zhì)和過(guò)氧化物酶體中,是活性氧清除酶系統(tǒng)中含量最豐富、最重要的酶，具有降低膜脂過(guò)氧化的作用[5]。前人研究表明，增強(qiáng)植物體內(nèi)抗氧化酶活性有助于提高植物的抗逆性[6]。目前，研究人員已從秋茄[7]、水稻[8]、馬鈴薯[9]等植物中克隆得到Cu/Zn-SOD，經(jīng)過(guò)逆境脅迫，發(fā)現(xiàn)均可誘導(dǎo)該基因的表達(dá)，提高植物的抗逆性。草海桐主要分布在我國(guó)華南沿海沙灘、石礫地，尤其是在我國(guó)的西沙群島分布有大量的草海桐林。西沙群島由于形成較晚，地貌主要是由珊瑚石灰?guī)r和沙壤土組成，由此說(shuō)明草海桐具有較強(qiáng)的抗逆性[10]。進(jìn)一步研究表明，低鹽下可促進(jìn)草海桐生長(zhǎng)；伴隨著鹽濃度的升高，草海桐可通過(guò)增加抗氧化酶活性和可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)清除活性氧，降低鹽脅迫對(duì)植物的傷害[2-3]。此外，草海桐還可響應(yīng)干旱脅迫，通過(guò)對(duì)草海桐的形態(tài)解剖學(xué)特征發(fā)現(xiàn)：葉片及上表皮厚、氣孔密度小、導(dǎo)管直徑大，有利于適應(yīng)干旱環(huán)境[11]。【本研究切入點(diǎn)】目前，對(duì)草海桐主要進(jìn)行了在原生境下的抗逆生物學(xué)特性研究，尚未有關(guān)于抗逆功能基因的克隆與分析?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以鹽脅迫草海桐葉片為材料，運(yùn)用RACE技術(shù)克隆獲得草海桐Cu/Zn-SOD全長(zhǎng)序列，并借助生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)獲得的Cu/Zn-SOD進(jìn)行序列分析，并成功構(gòu)建了pBinGlyRed-SsCSD重組質(zhì)粒。研究結(jié)果有助于揭示草海桐對(duì)鹽堿環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制，以期為草海桐的開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論與實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

草海桐(ScaevolasericeaL.)種子采自三亞鐵爐港紅樹(shù)林自然保護(hù)區(qū)(18°15′N，109°42′E)。將浸種后的草海桐種子播種在沙床上，待種子萌發(fā)長(zhǎng)出子葉后移植到裝有黃沙、泥炭土(體積比為3∶1)的育苗袋里，隨后放入人工氣候箱 (10 h光照, 14 h黑暗)，每天噴灑一定量的水，培養(yǎng)溫度為25 ℃。待草海桐長(zhǎng)出4～6片真葉時(shí)，用含有200 mmol/L NaCl的1/2 Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液處理24 h，處理結(jié)束后分別剪取草海桐的葉片和根，蒸餾水沖洗干凈，濾紙擦拭后液氮速凍保存樣品。

1.2 RNA提取及cDNA鏈的合成

稱取0.1 g草海桐的葉片，根據(jù)EASYspinplus多糖多酚復(fù)雜植物RNA快速提取試劑盒 (艾德萊生物公司, 北京)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。RNA溶于30 μL RNase Free Water中，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，超微量核酸蛋白測(cè)定儀(Thermo)檢測(cè)所提總RNA的濃度，合格的樣品用于下一步分析。以草海桐總RNA為模板，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (全式金，北京)說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成 cDNA 第一鏈。使用內(nèi)參基因SsActin1進(jìn)行cDNA第一鏈檢測(cè)[12]。

1.3 草海桐SsCSD基因保守片段的克隆

下載已報(bào)道的擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)、秋茄(Kandeliacandel)、苦瓜(MomordicacharantiaL.)、向日葵(Helianthusannuus)、黃花蒿(Artemisiaannua)、萵苣(Lactucasativa)、麻風(fēng)樹(shù)(Jatrophacurcas)、三裂葉薯(Ipomoeatriloba)、香瓜(Cucumismelo)等植物中的Cu/Zn-SOD氨基酸序列，運(yùn)用ClustalW在線比對(duì)，根據(jù)同源序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物(表1)以擴(kuò)增草海桐SsCSD的保守片段。以草海桐 cDNA 為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃ 3 min； 95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s(35個(gè)循環(huán))；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物檢測(cè)回收后與pEASY-Blunt 載體 (全式金，北京)連接并轉(zhuǎn)入到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，隨機(jī)挑取陽(yáng)性菌落送到廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司測(cè)序。

1.4 草海桐SsCSD全長(zhǎng)cDNA的克隆

對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行 Blast 在線分析，確認(rèn)為CSD的同源片段后，根據(jù)獲得的中間片段序列設(shè)計(jì) 3′RACE的正向引物3′RACE OP和3′RACE IP(表1)，接頭引物使用試劑盒提供的 UPM，參照 RACE試劑盒 (Takara，日本) 說(shuō)明，進(jìn)行草海桐SsCSD基因 3′末端的擴(kuò)增。同樣的，設(shè)計(jì)5′RACE的引物5′RACE OP和5′RACE IP，接頭引物使用 UPM，進(jìn)行草海桐SsCSD基因 5′末端的擴(kuò)增。利用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)含有接頭的引物進(jìn)行ORF擴(kuò)增。

表1 草海桐SsCSD基因克隆及表達(dá)分析的引物

1.5 草海桐SsCSD基因的生物信息學(xué)分析

利用Vector NTI軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，得到全長(zhǎng)cDNA；運(yùn)用NCBI的 ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)識(shí)別開(kāi)放閱讀框并翻譯成氨基酸序列。根據(jù)尹明華等[13]的方法對(duì)草海桐的SsCSD序列進(jìn)行氨基酸序列分析、理化性質(zhì)分析、結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、亞細(xì)胞定位和功能分析等。

1.6 草海桐SsCSD植物表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

使用無(wú)縫克隆法構(gòu)建pBinGlyRed-SsCSD載體。根據(jù)NCBI的預(yù)測(cè)的ORF序列，利用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)含有接頭的特異性引物，上、下游分別添加EcoRⅠ和XmaⅠ內(nèi)切酶位點(diǎn)：SsCSDORF FP和SsCSDORF RP(表1)，進(jìn)行ORF擴(kuò)增。PCR的擴(kuò)增程序：95℃ 3 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s 35個(gè)循環(huán))；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)回收。同時(shí)植物表達(dá)載體pBinGlyRed經(jīng)過(guò)EcoRⅠ和XmaⅠ雙酶切，將回收基因片段與線性化載體采用無(wú)縫克隆法進(jìn)行連接，經(jīng)熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證和測(cè)序，提取質(zhì)粒并采用凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101, 對(duì)菌液 PCR 鑒定為陽(yáng)性的克隆即可用于遺傳轉(zhuǎn)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 草海桐SsCSD全長(zhǎng)cDNA序列的獲取

使用簡(jiǎn)并引物CSD FP和CSD RP進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增獲得約280 bp的保守片段(圖1)。將該片段進(jìn)行Blast分析，發(fā)現(xiàn)該序列同其他物種的銅鋅超氧化物歧化酶高度同源。根據(jù)此片段序列設(shè)計(jì)特異性引物3′RACE OP，3′RACE IP，5′RACE OP和5′RACE IP，利用RACE技術(shù)獲得了草海桐SsCSD基因的3′末端和5′末端cDNA片段，長(zhǎng)度分別為650和700 bp。將上述3個(gè)核苷酸序列拼接后，獲得了草海桐SsCSD基因的全長(zhǎng)cDNA序列，其長(zhǎng)度為1148 bp，5′端和3′端分別存在 92和370 bp 的非翻譯區(qū)(圖2)。

M: Trans 2K DNA marker; 1～2: CSD 保守片段M: Trans 2K DNA marker; 1-2: Conserved sequence of CSD圖1 簡(jiǎn)并PCR凝膠電泳Fig.1 Degenerate PCR gel electrophoresis

圖2 草海桐SsCSD的ORF框及氨基酸序列Fig.2 ORF and amino acid sequence of SsCSD in S.sericea

2.2 草海桐SsCSD基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

草海桐SsCSD含完整編碼區(qū)，從起始子到終止子共編碼228個(gè)氨基酸(圖2)，分子量為23.260 kDa，理論等電點(diǎn)為5.55，脂溶指數(shù)為85.18。利用ExPASy Proteomics Server的ProtScale程序分析該蛋白的親水性和疏水性，總平均疏水性為-0.14，推測(cè)為親水性脂溶蛋白(圖3)。

圖3 SsCSD蛋白疏水性/親水性預(yù)測(cè)和分析Fig.3 Protein hydrophobicity/hydrophilicity prediction and analysis of SsCSD

利用NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)對(duì)上述所得的蛋白序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，由圖4可知,草海桐SsCSD屬于Cu/Zn-SOD家族。利用softberry網(wǎng)站對(duì)克隆得到的基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，預(yù)測(cè)表明定位于葉綠體的可能性最大。采用Signal P 3.0 Server預(yù)測(cè)表明，SsCSD含有信號(hào)肽序列。TMHMM結(jié)果顯示，該蛋白無(wú)跨膜區(qū)，為非跨膜蛋白(圖5)。采用SOPMA結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)草海桐SsCSD蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示無(wú)規(guī)則卷曲(Random coil，47.37%)和延伸鏈(Extended strand，28.95%)占比最高，其次是α-螺旋(Alpha helix，16.67%)和β-轉(zhuǎn)角(Beta turn，7.02%)(圖6)。

圖4 草海桐SsCSD蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.4 Conserved domain analysis of SsCSD in S. sericea

2.3 草海桐SsCSD基因編碼蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

為進(jìn)一步了解SsCSD的生物學(xué)功能，采用MEGA7對(duì)草海桐和10個(gè)物種的CSD氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析。經(jīng)過(guò)比對(duì)分析，草海桐與雙子葉植物向日葵、萵苣、黃花蒿的CSD蛋白在同一大分支下，表明草海桐的SsCSD蛋白在進(jìn)化上與向日葵、萵苣、黃花蒿的親緣關(guān)系最近(圖7)。進(jìn)一步聚類發(fā)現(xiàn)，Cu/Zn-SOD蛋白成員聚成2個(gè)大類，草海桐與擬南芥(AtCSD2)、秋茄(KcCSD)、麻風(fēng)樹(shù)(JcCSD)和向日葵(HaCSD)的葉綠體型CSD蛋白同處于一個(gè)分支；水稻(OsCSD1和OsCSD2)與擬南芥(AtCSD1)的細(xì)胞質(zhì)型CSD蛋白同處于另一個(gè)分支。結(jié)合之前分析的SsCSD定位于葉綠體，該進(jìn)化分析系統(tǒng)樹(shù)表明草海桐SsCSD蛋白也聚類到葉綠體CSD蛋白，推測(cè)草海桐SsCSD蛋白定位于葉綠體。

圖5 草海桐SsCSD蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析Fig.5 Protein transmembrane structure analysis of SsCSD in S. sericea

藍(lán)色：α-螺旋；紅色：延伸鏈; 紫色：無(wú)規(guī)則卷曲；綠色：β-轉(zhuǎn)角Blue represents α-helix; Red represents extended strand; Purple represents irregular curl; Green represents β-turn圖6 草海桐SsCSD蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.6 Protein secondary structure prediction of SsCSD in S. sericea

圖7 草海桐與其他植物CSD氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.7 Phylogenetic analysis of CSD in S. sericea and other plants

2.4 草海桐SsCSD基因的植物表達(dá)載體構(gòu)建

以草海桐的cDNA為模板，用引物對(duì)CSD ORF FP和CSD ORF RP擴(kuò)增SsCSD基因的ORF序列，凝膠電泳顯示擴(kuò)增得到一條約700 bp的條帶，通過(guò)無(wú)縫克隆的方法將目的基因與線性化載體進(jìn)行連接，篩選并測(cè)序正確后，重新提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101。菌落PCR鑒定顯示均在750 bp左右有目的條帶(圖8)，表明重組載體pBinGlyRed-SsCSD已成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，可用于下一步的植物遺傳轉(zhuǎn)化，以驗(yàn)證基因功能。

M: Trans 2K DNA marker; 1:陰性對(duì)照；2：陽(yáng)性對(duì)照；3～9：陽(yáng)性菌落M: Trans 2K DNA marker; 1: Negative control；2: Positive control；3-9: Screening for positive colonies for pBinGlyRed-SsCSD圖8 草海桐SsCSD基因的表達(dá)載體陽(yáng)性克隆鑒定Fig.8 The Positive clone identification for gene expression vector of SsCSD in S.sericea

3 討 論

植物不同于動(dòng)物，它以一種固著的生活方式以面對(duì)各種環(huán)境脅迫，諸如高溫、低溫、干旱、水澇及高鹽等的影響。當(dāng)植物面臨非生物脅迫時(shí)，表現(xiàn)為葉片中葉綠素的含量減少，光合速率下降；氧離子(O2-)、過(guò)氧化氫(H2O2) 和羥基(-OH)等活性氧物質(zhì)(ROS)積累，ROS的積累會(huì)引起膜系統(tǒng)的過(guò)氧化，從而造成細(xì)胞脂膜系統(tǒng)的破壞，而脂膜過(guò)氧化產(chǎn)物會(huì)對(duì)植物細(xì)胞造成毒害[14-15]。為了減輕ROS的毒害作用，植物配有一系列酶和非酶抗氧劑分子以清除ROS，超氧化物歧化酶作為一種抗氧化酶，具有清除活性氧的功能，保護(hù)植物體免受活性氧的危害[16]。Cu/Zn-SOD是3種歧化酶中含量最豐富的一種酶，是活性氧清除酶系統(tǒng)中最重要的酶，參與植物的耐鹽堿、抗旱及耐高溫等逆境脅迫，且易受到多種逆境因子的誘導(dǎo)表達(dá)[4]。草海桐是一種濱海植物，耐鹽性強(qiáng)，且在一定范圍內(nèi)超氧化物歧化酶活性隨著鹽濃度的增大而提高，在此基礎(chǔ)上，本研究通過(guò)RACE技術(shù)成功克隆了草海桐Cu/Zn-SOD。

近年來(lái)，對(duì)Cu/Zn-SOD研究較為廣泛，如在白菜[17]、茶樹(shù)[18]、絲瓜[5]、秋茄[7]中均克隆了Cu/Zn-SOD。按照其在細(xì)胞內(nèi)的分布位置可分為細(xì)胞內(nèi)Cu/Zn-SOD (ic Cu/Zn-SOD)和細(xì)胞外Cu/Zn-SOD(ec Cu/ZnSOD)，細(xì)胞內(nèi)Cu/Zn-SOD主要定位在細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中，而細(xì)胞外Cu/Zn-SOD則多見(jiàn)于動(dòng)物細(xì)胞中[19-20]。本研究通過(guò)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)SsCSD定位于葉綠體，結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化分析草海桐SsCSD與其他植物葉綠體Cu/Zn-SOD聚在一個(gè)分支，推測(cè)草海桐SsCSD定位于葉綠體。研究表明，鹽堿脅迫會(huì)誘導(dǎo)水稻的葉綠體Cu/Zn-SOD轉(zhuǎn)錄水平提高，SOD酶活性高于對(duì)照，過(guò)表達(dá)OsCu/Zn-SOD可顯著提高水稻的耐鹽性，且轉(zhuǎn)基因株系的根長(zhǎng)、株高和鮮重均高于對(duì)比水稻；隨著鹽脅迫加深，會(huì)加劇體內(nèi)丙二醛的含量，通過(guò)生理指標(biāo)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)植株中的MDA含量顯著低于對(duì)照株，表明過(guò)表達(dá)OsCu/Zn-SOD增強(qiáng)了植物清除活性氧的能力，降低了氧化脅迫傷害[8]。鹽生植物具有更強(qiáng)的耐鹽能力，秋茄在短期鹽脅迫下，可通過(guò)根部有效排出Na+；而在長(zhǎng)期鹽脅迫下，可將Na+向上運(yùn)輸至葉片，導(dǎo)致葉片中H2O2含量提高，通過(guò)提高體內(nèi)KcCSD的轉(zhuǎn)錄水平緩解鹽脅迫，直接表現(xiàn)為葉片中的SOD活性增強(qiáng)[21]。研究人員克隆到了秋茄的CSD基因，分析顯示為葉綠體型Cu/Zn-SOD，在煙草中過(guò)表達(dá)KcCu/Zn-SOD，鹽脅迫情況下，轉(zhuǎn)基因煙草葉綠體中的H2O2積累遠(yuǎn)低于野生型煙草，表明煙草葉綠體中光合電子傳遞鏈形成超氧陰離子，作為信號(hào)反饋調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)，激活逆境下的防御機(jī)制，減少葉綠體中活性氧的積累，緩解鹽脅迫[7]。

4 結(jié) 論

本研究以鹽脅迫草海桐為材料，運(yùn)用RACE技術(shù)克隆到了草海桐Cu/Zn-SOD基因，命名為SsCSD，該基因全長(zhǎng)共1148 bp。生物信息學(xué)分析表明SsCSD編碼蛋白含有228個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為23.26 kDa，等電點(diǎn)5.55，為親水性蛋白；其二級(jí)結(jié)構(gòu)由無(wú)規(guī)則卷曲(47.37%)、延伸鏈(28.95%)、α-螺旋(16.67%)和β-轉(zhuǎn)角(7.02%)組成；氨基酸保守結(jié)構(gòu)域分析表明該序列具有銅鋅超氧化物歧化酶保守結(jié)構(gòu)域，屬于SOD家族。草海桐Cu/Zn-SOD在進(jìn)化上與向日葵、萵苣、黃花蒿葉綠體型Cu/Zn-SOD親緣關(guān)系更近，結(jié)合生物信息學(xué)分析，推測(cè)SsCSD定位于葉綠體。在此基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建了SsCSD植物過(guò)表達(dá)載體，有助于基因功能分析。為此，后續(xù)研究將對(duì)SsCSD的亞細(xì)胞定位，基因與草海桐耐鹽能力的相關(guān)性進(jìn)行分析，有助于揭示草海桐適應(yīng)鹽生境的分子機(jī)制。