馬艷蕊，王順明，李學(xué)震，王 華，和法濤，劉光鵬**

（1.中華供銷合作總社濟南果品研究院，山東 濟南 250200；2.安丘市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東 濰坊 262100；3.北京京東乾石科技有限公司，北京 102600）

桑黃（Phellinus igniarius）屬擔(dān)菌子門（Basidiomycota）傘菌綱 （Agaricomycetes）銹革孔菌目（Hymenochaetales）銹革孔菌科 （Hymenochaetaetaceae）桑黃屬（Phellinus），是一種珍貴的藥用真菌，子實體多呈黃褐色，是生長于多種樹木上的硬質(zhì)大型真菌。根據(jù)寄生樹種的不同，桑黃的顏色、形狀和成分也略有差異，目前世界上已知的桑黃菌種有15種，在中國境內(nèi)有10種[1]，其中人們所熟知的主要有桑樹桑黃（Inonotus hispidus）、東北桑黃（Sanghuangprous vaninii）等。桑黃始載于《藥性論》，具有活血、止血、化飲、止瀉等功效；隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，桑黃更多的藥理作用也逐漸被發(fā)掘。最新的研究表明，桑黃具有明顯的抗癌、抗腫瘤作用，能夠有效抑制腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移，且不會對人體造成任何毒副作用[2-8]。目前，桑黃多以子實體形式被人們所食用，食用方式單一且口感不佳，因此亟需開發(fā)出一種桑黃精深加工產(chǎn)品使其為更多的消費人群所接受。

冠突散囊菌（Eurotium cristatum）屬子囊菌門（Ascomycota）散囊菌綱 （Eurotiomycetes）散囊菌目（Eurotiales）發(fā)菌科 （Trichocomaceae）散囊菌屬（Eurotium），是我國傳統(tǒng)茯磚茶中的優(yōu)勢菌種，能賦予茯磚茶特殊的香氣，且具有降脂降糖、改善人體消化道功能、抗菌和抗氧化等作用[9-10]。隨著微生物學(xué)和發(fā)酵工程的發(fā)展，人們越來越清楚的認識到冠突散囊菌在改善發(fā)酵茶品質(zhì)、提升食品生物技術(shù)應(yīng)用水平，尤其在腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)劑方面的應(yīng)用價值具有廣闊的前景[11]。

茶葉作為一種中國傳統(tǒng)飲品，具有廣泛的消費群體。當(dāng)前國內(nèi)以冠突散囊菌為優(yōu)勢菌種的茯磚茶加工工藝已經(jīng)比較成熟，而有關(guān)桑黃茶的研究鮮有報道，因此本研究擬以桑葉紅茶為培養(yǎng)基底，分別接種桑黃菌和冠突散囊菌，對比研究其中不同功能成分的變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種來源

發(fā)酵菌株東北桑黃D（Phellinus igniarius）由山東省臨清市哲碩農(nóng)產(chǎn)品有限公司提供，冠突散囊菌（Aspergillus chevalier）i由市售安化黑茶中篩選純化得到。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

PDA培養(yǎng)基，購自青島賓得生物技術(shù)有限公司；PDB培養(yǎng)基，購自北京索萊寶科技有限公司；1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH），購自梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；無水乙醇，購自天津富宇精細化工有限公司；碳酸鈉，購自天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；福林酚，購自上海麥克林生化科技有限公司；亞硝酸鈉，購自天津市大茂化學(xué)試劑廠；硝酸鋁，購自天津市大茂化學(xué)試劑廠；氫氧化鈉，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

桑葉紅茶培養(yǎng)基：桑葉紅茶由山東省臨清市哲碩農(nóng)產(chǎn)品有限公司提供，桑葉紅茶復(fù)水后稱取15 g置于培養(yǎng)皿中，經(jīng)高壓蒸汽滅菌制成桑葉紅茶培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

BSC-150恒溫培養(yǎng)箱、YXQ-LX-100A高壓蒸汽滅菌鍋，上海博迅實業(yè)有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；UV1000紫外分光光度計，上海天美儀器有限公司；HH-4恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種活化及種子液制備

取實驗室保藏的桑黃斜面菌種，在超凈工作臺中用接種鏟取約0.5 cm2接到PDA固體培養(yǎng)基上，置于28℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)7 d～10 d，待菌種長滿整個平板，保存在4℃冰箱備用。

取上述活化后的菌種平板，在超凈工作臺中用打孔器取相同大小的菌塊接種于滅菌后的PDB培養(yǎng)基中，置于恒溫搖床培養(yǎng)箱中28℃、180 r·min-1條件下?lián)u培72 h。

冠突散囊菌菌種活化及種子液制備同桑黃菌種。

1.3.2 發(fā)酵桑葉紅茶的制備

取上述活化后的桑黃和冠突散囊菌菌種平板，在超凈工作臺中用打孔器取相同大小的菌塊接種于滅菌后的桑葉紅茶培養(yǎng)基中，置于28℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)7d～10 d，直至菌種長滿茶葉表面。將發(fā)酵好的桑葉紅茶置于45℃培養(yǎng)箱中過夜烘干。

1.3.3 羥自由基清除率測定

采用Xia等[12]的方法對羥自由基的清除率進行測定，略做改進。將烘干后的發(fā)酵紅茶研磨成粉，用60%的乙醇按30∶1的比例加入到樣品粉末中，30℃超聲提取30 min后，再置于離心機中3 500 r·min-1離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中，向沉淀中再次加入60%的乙醇，同樣條件下再提取一次，合并2次的提取液，得到發(fā)酵桑葉紅茶的醇提物。

取 8 mmol·L-1的FeSO4溶液和水楊酸溶液各1 mL混勻，取上步制得的醇提物0.1 mL，加入混合液中震蕩搖勻，之后再加入3%的H2O2溶液1 mL，震蕩搖勻使其充分反應(yīng)。將混合液放置于水浴鍋中，37℃條件下保溫30 min，之后在510 nm處測定吸光度值。羥自由基清除率（P，%）的計算公式為：

式中：A1為樣品反應(yīng)體系的吸光度值；A2為去離子水代替H2O2反應(yīng)體系的吸光度值；A0為去離子水代替醇提物反應(yīng)體系的吸光度值。

1.3.4 DPPH自由基清除率測定

采用Jin等[13]的方法對DPPH自由基的清除率進行測定，略做改進。準確稱取DPPH試劑5 mg，溶于250 mL無水乙醇中，配置成濃度為0.02 mg·mL-1的DPPH溶液；取上步中制備好的醇提物0.1 mL與DPPH溶液3.9 mL混合均勻，常溫下避光20 min，之后于517nm處測吸光度。最終DPPH自由基清除率（Z，%）的計算公式為：

Z=[1-（A1-A2）/A0]× 100% （2）式中：A1為樣品反應(yīng)體系的吸光度值；A2為無水乙醇代替DPPH溶液反應(yīng)的吸光度值；A0為無水乙醇代替醇提物反應(yīng)體系的吸光度值。1.3.5 多酚含量的測定

取1 mL醇提物置于試管中，添加福林酚試劑1 mL，漩渦混勻，室溫放置3 min；隨后添加10%的Na2CO3溶液1 mL，漩渦混勻，置于恒溫水浴鍋中30℃條件下反應(yīng)30 min，漩渦混勻；于760 nm處測定吸光度值。

1.3.6 黃酮含量的測定

取1 mL醇提物置于10 mL的刻度試管中，加入質(zhì)量濃度為5%的亞硝酸鈉溶液0.3 mL，隨后放置6 min；加入質(zhì)量濃度為10%的硝酸鋁溶液0.3 mL，放置6 min；加入濃度1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液4 mL，并用60%的乙醇稀釋至刻度，在避光條件下放置15 min，隨后于510 nm處測吸光度值。

1.3.7 多糖含量測定

取1 g發(fā)酵茶樣品，置于50 mL離心管中，加入濃度為80%的乙醇25 mL，超聲30 min后在4 000 r·min-1條件下離心10 min，棄上清。向沉淀中加入40 mL蒸餾水，在沸水浴中提取2 h，之后進行抽濾，殘渣水洗2次～3次，將濾液定容到100 mL備用。

將樣品稀釋2倍后吸取1 mL加入試管中，加入濃度為5%的苯酚1 mL，快速加入5 mL濃硫酸，靜置10 min后漩渦震蕩，于30℃水浴中反應(yīng)20 min，隨后于490 nm處測吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 功能性成分及抗氧化活性分析

多糖是桑黃的主要生物活性物質(zhì)，具有抗腫瘤、降血糖、護肝、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等生物活性[14]。而茶葉中含有豐富的多酚類物質(zhì)，組成成分達30多種，主要包括黃酮類、苷類、黃烷醇類、黃酮醇類等，且絕大多數(shù)具有藥理作用。此外，茶多酚具有極強的抗氧化活性，能與茶葉中的VE和VC等抗氧化劑產(chǎn)生明顯的增效作用[15]。因此以多糖、多酚、黃酮含量、DPPH·清除率以及羥自由基清除率為指標，對比桑黃發(fā)酵桑葉紅茶和冠突散囊菌發(fā)酵紅茶的優(yōu)劣，其統(tǒng)計結(jié)果見圖1～圖5。

圖1 桑黃與冠突散囊菌發(fā)酵桑葉紅茶中多糖含量對比Fig.1 Comparison of polysaccharide content in mulberry leaf black tea fermented by Phellinus igniarius and Eurotium cristatum

圖2 桑黃與冠突散囊菌發(fā)酵桑葉紅茶中多酚含量對比Fig.2 Comparison of polyphenol content in mulberry leaf black tea fermented by Phellinus igniarius and Eurotium cristatum

圖3 桑黃與冠突散囊菌發(fā)酵桑葉紅茶中黃酮含量對比Fig.3 Comparison of flavone content in mulberry leaf black tea fermented by Phellinus igniarius and Eurotium cristatum

圖4 桑黃與冠突散囊菌發(fā)酵桑葉紅茶的DPPH·清除率對比Fig.4 Comparison of DPPH·scavenging rates of mulberry leaf black tea fermented by Phellinus igniarius and Eurotium cristatum

圖5 桑黃與冠突散囊菌發(fā)酵桑葉紅茶的羥自由基清除率對比Fig.5 Comparison of hydroxyl radical scavenging rates of mulberry leaf black tea fermented by Phellinus igniarius and Eurotium cristatum

由圖1～圖5數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，桑黃發(fā)酵桑葉紅茶后產(chǎn)生了較多的多糖類物質(zhì)，其多糖含量是對照桑葉紅茶的2.69倍，達到0.410 mg·mL-1，且相應(yīng)的具有較高的羥自由基清除率，羥自由基清除率為60.31%，這也與前人研究中多糖是桑黃的主要生物活性物質(zhì)的結(jié)論相一致[16]。然而，桑黃發(fā)酵桑葉紅茶中的多酚類物質(zhì)與對照桑葉紅茶和冠突散囊菌發(fā)酵桑葉紅茶相比大幅下降，較對照桑葉紅茶下降63.18%，只有30.55 μg·mL-1，黃酮含量較桑葉紅茶下降24.55%，為27.38 μg·mL-1，可能是由于桑黃菌在生長過程中消耗了較多的木質(zhì)素，同時DPPH·的清除率高低與茶中多酚含量具有相關(guān)性。冠突散囊菌發(fā)酵桑葉紅茶后多糖類物質(zhì)含量較對照桑葉紅茶提升約83.17%，達到0.279 mg·mL-1，多酚類物質(zhì)含量下降 14.75%，為 70.74 μg·mL-1，黃酮含量提升 67.13%，達到 60.65 μg·mL-1。

2.2 感官分析

接種不同菌種發(fā)酵對桑葉紅茶的外觀、香氣會產(chǎn)生較大的影響。3種不同桑葉紅茶的感官對比分析見表1。

表1 桑黃與冠突散囊菌發(fā)酵桑葉紅茶的感官對比分析Tab.1 Sensory comparative analysis of mulberry leaf black tea fermented by Phellinus igniarius and Eurotium cristatum

由表1所示，桑黃發(fā)酵后的桑葉紅茶沖泡后顏色較淺，呈橙紅色，且略渾濁，不透亮，香氣相對較淡，但口感相對厚重；冠突散囊菌發(fā)酵后的桑葉紅茶沖泡后色澤與未發(fā)酵桑葉紅茶類似，呈棕紅色，且茶湯清亮，香氣比未發(fā)酵的桑葉紅茶更加濃郁。

3 結(jié)論

分別用桑黃和冠突散囊菌發(fā)酵桑葉紅茶，對比2種發(fā)酵茶和原茶的功能成分和抗氧化活性。結(jié)果表明與原茶相比，桑黃發(fā)酵桑葉紅茶產(chǎn)生了更多的多糖類物質(zhì)，且具有更高的羥自由基清除率；冠突散囊菌發(fā)酵桑葉紅茶與原茶相比產(chǎn)生了更多的黃酮類物質(zhì)，多糖類物質(zhì)產(chǎn)量也有所提升。但2種發(fā)酵茶中的多酚類物質(zhì)含量相比于原茶都有所降低，可能是菌種生長消耗了茶中的木質(zhì)素所致。結(jié)合感官分析，冠突散囊菌發(fā)酵茶的茶香最為濃郁，顏色清亮，桑黃發(fā)酵茶的茶香較淡，口感比較醇厚，但顏色較淺略渾濁。綜上所述，桑黃和冠突散囊菌發(fā)酵桑葉紅茶在不同的功能性成分指標上都有所提升，香氣和口感上也都各有優(yōu)勢，具有一定的研究價值和市場前景。