頜骨缺損是口腔臨床治療中的常見疾病，研究發(fā)現(xiàn)相較于常規(guī)使用的骨移植物和純生物材料支架，攜帶生長因子的細(xì)胞復(fù)合支架材料，能夠更好地誘導(dǎo)骨組織再生

。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）經(jīng)不同的刺激或誘導(dǎo)后可分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等，因此BMSCs 在骨組織工程中經(jīng)常作為種子細(xì)胞被用于相應(yīng)研究

。課題組前期將miRNA-378a 以慢病毒載體的形式轉(zhuǎn)入BMSCs 中研究其成骨及成血管性能，驗(yàn)證了骨髓間質(zhì)干細(xì)胞為良好的種子細(xì)胞

。環(huán)狀RNA（circluar RNA，circRNA）小腦變性相關(guān)蛋白1 的反義轉(zhuǎn)錄物（antisense to the cerebellar degeneration-related protein 1 transcript，CDR1as），是一種特殊的非編碼RNA，在骨組織修復(fù)中起到調(diào)控作用

。研究發(fā)現(xiàn)在股骨頭壞死患者中，circRNA CDR1as通過cirRNA-miR-7-5p-Wnt5B 通路在BMSCs 的成脂/成骨分化中發(fā)揮關(guān)鍵作用

。本實(shí)驗(yàn)將過表達(dá)與低表達(dá)的circRNA CDR1as 慢病毒轉(zhuǎn)染至小鼠BMSCs，檢測(cè)BMSCs 中相關(guān)成骨、成血管因子的表達(dá)水平，以探究circRNA CDR1as 對(duì)BMSCs 成骨及成血管作用的影響，并判斷其能否為后期修復(fù)骨缺損奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要材料及儀器

4 周齡SPF 級(jí)Balb/C 小鼠，雌雄不限，15～25 g，購于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SCXK（新）2016-0003，實(shí)驗(yàn)經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（動(dòng)物倫理審核項(xiàng)目編號(hào)：IACUC20170706-04）。

由表2可見，在D7，各用藥組AGP效價(jià)明顯高于疫苗對(duì)照組，但差異不顯著(P>0.05)；在D14，中藥復(fù)方多糖AGP效價(jià)顯著高于疫苗對(duì)照組(P<0.05)；在D 21和D28，中藥復(fù)方多糖組AGP抗體效價(jià)顯著高于黃芪多糖組和疫苗對(duì)照組(P<0.05)；在D35中藥復(fù)方多糖組AGP效價(jià)顯著高于疫苗對(duì)照組(P<0.05).

北方的冬天，充滿了快樂。下雪了，鵝毛般的大雪紛紛揚(yáng)揚(yáng)地飄了下來，落在地上、樹枝上、屋頂上……不多時(shí)，到處已經(jīng)是白茫茫的一片。

低糖DMEM 培養(yǎng)基（Gibco，美國）；胎牛血清（Gibco，美國）；Balb/C 小鼠BMSCs 成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基（Cyagen，中國）；實(shí)時(shí)定量PCR 引物合成（上海生物工程公司，中國）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，日本）；Real-Time PCR 試劑盒（Takara，日本）；增強(qiáng)型CCK-8（Bioss，北京）；熒光定量PCR 儀（QuantStudio

6Flex，Thermo，美國）；流式細(xì)胞儀（BD facsaria，美國）；高速離心機(jī)（5810R，Eppendorf，德國）；酶標(biāo)儀（Thermo，美國）；激光共聚焦顯微鏡（Olympus，日本）；倒置相差顯微鏡（萊卡，德國）。CCK-8試劑盒（Bioss，中國），茜素紅（北京索萊寶公司，中國），堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）（北京索萊寶公司，中國），慢病毒（上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司，中國）。

（2）整合業(yè)務(wù)流程及數(shù)據(jù)信息，實(shí)現(xiàn)跨部門協(xié)同服務(wù)。開放式流程平臺(tái)打破了各部門、各系統(tǒng)間的壁壘，以先進(jìn)的流程服務(wù)理念，將分散在各領(lǐng)域的業(yè)務(wù)流程及數(shù)據(jù)信息有效的整合起來，使高校各部門真正協(xié)同服務(wù)成為可能。

過表達(dá)circRNA CDR1as 慢病毒來自circbase數(shù)據(jù)庫的mmu_circ_0001878 過表達(dá)的序列，使用的載體元件順序：CMV-circRNA-EF1-ZsGreen1-T2Apuromycin，過表達(dá)陰性對(duì)照組的載體元件順序MVcircRNA-EF1-ZsGreen1-T2A-puromycin，是一個(gè)空載體。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率 各組細(xì)胞培養(yǎng)72 h 后，胰酶消化收集細(xì)胞，流式檢測(cè)各組慢病毒載體轉(zhuǎn)染后增強(qiáng)綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）表達(dá)效率。同時(shí)將各組細(xì)胞收集后按照1 × 10

個(gè)/mL 的細(xì)胞密度分別接種到激光共聚焦小皿培養(yǎng)24 h，共聚焦顯微鏡觀察EGFP 熒光數(shù)量。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定 麻醉Balb/C 小鼠后頸椎脫臼處死，75%乙醇溶液浸泡5 min，無菌條件下分離肱骨和股骨，剪去兩端干骺端，用低糖DMEM 完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、0.5%鏈霉素、0.5%青霉素及1%谷氨酰胺）沖出骨髓，離心（5 min，1 000 r/min，22 ℃）后加入完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中，置入恒溫培養(yǎng)箱，每72 h 換液，待細(xì)胞密度長至85%～90%時(shí)，0.25%胰酶消化傳代。取第3 代BMSCs 加入特異性表達(dá)抗體CD29 和CD31 上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

過表達(dá)實(shí)驗(yàn)組ALP 染色面積多于過表達(dá)對(duì)照組，而低表達(dá)實(shí)驗(yàn)組ALP 染色面積少于其對(duì)照組，隨著成骨誘導(dǎo)天數(shù)的增加，各組的ALP 染色面積逐漸增大（圖5）。

各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h 后，采用激光共聚焦顯微鏡觀察攜帶EGFP 綠色熒光的細(xì)胞，DAPI 染色后細(xì)胞核鏡下呈藍(lán)色熒光；明場(chǎng)圖觀察細(xì)胞數(shù)量，各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染率無明顯差異；使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)EGFP 表達(dá)效率，過表達(dá)實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染率為88.7%，過表達(dá)對(duì)照組為77.3%；低表達(dá)實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染率為81.9%，低表達(dá)對(duì)照組為68.8%，四組轉(zhuǎn)染率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

＞0.05）（圖2）。

根據(jù)所測(cè)OD 值，繪制4 組細(xì)胞生長曲線圖，類似“S”形，4 組細(xì)胞1 d、2 d 增殖速率較緩和，各組細(xì)胞增殖活性無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（

＞0.05），7 d 時(shí)增至最高，8 d 時(shí)細(xì)胞增殖速率開始減緩；3～10 d，過表達(dá)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖活性高于過表達(dá)對(duì)照組（

＜0.05），而低表達(dá)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖活性低于低表達(dá)對(duì)照組（

＜0.05）（圖3）。

低表達(dá)組和低表達(dá)對(duì)照組，使用的載體元件順序hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin，低表達(dá)circRNA CDR1as 慢病毒靶點(diǎn)序列1：5’-TCTGCCGTATCC AGGGTTT - 3’，低表達(dá) circRNA CDR1as 慢病毒靶點(diǎn)序列2：5’-TATCCAGGGTTT CCAGTGG-3’；低表達(dá)對(duì)照組序列：5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’。

隨著成骨誘導(dǎo)天數(shù)的延長，每組紅色鈣結(jié)節(jié)數(shù)量相應(yīng)增多，由單一鈣結(jié)節(jié)變?yōu)閳F(tuán)塊狀鈣結(jié)節(jié)。同一時(shí)間段內(nèi)，過表達(dá)實(shí)驗(yàn)組紅色鈣化區(qū)域大于過表達(dá)對(duì)照組；而低表達(dá)實(shí)驗(yàn)組紅色鈣化區(qū)域少于其對(duì)照組（圖4）。

1.2.5 茜素紅染色 各組BMSCs 轉(zhuǎn)染72 h 后，加入成骨誘導(dǎo)液，成骨誘導(dǎo)14、21 d 后染色。多聚甲醛固定，超純水洗滌，茜素紅染液染色，超純水洗滌，倒置相差顯微鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)區(qū)域。

1.2.6 堿性磷酸酶染色 各組BMSCs 轉(zhuǎn)染72 h 后，成骨誘導(dǎo)14、21 d 后染色。2 mL 4%多聚甲醛固30 min，蒸餾水洗3 遍，按比例加入堿性磷酸酶染色液，避光孵育20～30 min，直至顯色至預(yù)期深淺，蒸餾水洗2 遍，倒置相差顯微鏡下觀察鈣沉淀區(qū)域。

1.2.7 qRT-PCR檢測(cè)成骨成血管相關(guān)基因表達(dá) BMSCs 轉(zhuǎn)染72 h 后，Trizol 法提取各組總RNA，測(cè)量濃度與純度。使用Takara 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒兩步法將RNA 逆轉(zhuǎn)為cDNA，以20 μL 體系進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)條件：95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃34 s，40 個(gè)循環(huán)。檢測(cè)各組circRNA CDR1as 基因，成骨分化特異標(biāo)志物ALP、Runt 相關(guān)基因2（runt-related transcription factor 2，RUNX2）、骨鈣素（osteocalcin，OCN）、骨橋素（osteopontin，OPN）、鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子（osterix，OSX）、Ⅰ型膠原蛋白（collagen-I，COL-1），以及成血管特異標(biāo)志物血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial grown factor，VEGF）、血管生成素-1（angiogenin-1，Ang-1）的mRNA 表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次。qRT-PCR 所用引物見表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 25.0 進(jìn)行分析，符合正態(tài)性，選用兩獨(dú)立樣本

檢驗(yàn)，各組基因的表達(dá)量通過2

計(jì)算，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，

＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，統(tǒng)計(jì)圖使用GraphPad Prism 軟件繪制。

2 結(jié) 果

2.1 BMSCs 培養(yǎng)及鑒定

生長良好的3 代細(xì)胞多為長梭狀，生長密集呈旋渦狀；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面特異性抗體CD29陽性表達(dá)（93.1%），而CD31陰性表達(dá)（2.4%），符合BMSCs 的表型特點(diǎn)（圖1）。

2.2 BMSCs 轉(zhuǎn)染效率

1.2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs 將3 代BMSCs 按細(xì)胞密度為5 × 10

個(gè)/孔接種于6 孔板，細(xì)胞長至60%左右時(shí)，根據(jù)說明書確定轉(zhuǎn)染時(shí)病毒滴度，按照轉(zhuǎn)染慢病毒載體的不同分為circRNA CDR1as 過表達(dá)組（過表達(dá)實(shí)驗(yàn)組）和circRNA CDR1as 低表達(dá)組（低表達(dá)實(shí)驗(yàn)組）以及分別相對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照組，每孔轉(zhuǎn)染液體總量1 mL，放入培養(yǎng)箱中，24 h 后換液，2 mL/孔培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，熒光顯微鏡觀察72～96 h 轉(zhuǎn)染情況。

2.3 CCK-8 細(xì)胞毒性檢測(cè)

倘若能將我們的設(shè)想與現(xiàn)實(shí)結(jié)合，將會(huì)吸引來大批高校學(xué)生的向往，在互聯(lián)網(wǎng)時(shí)代，什么都很便利了，人們的生活質(zhì)量提高，對(duì)于服務(wù)的追求越來越高，只有以客戶為中心，才能為我們引來更多的人流量，進(jìn)而才能實(shí)現(xiàn)共贏，客戶得到了美的體驗(yàn)，商家得到了利益。然而在這過程中，應(yīng)當(dāng)對(duì)商家進(jìn)行嚴(yán)格的要求，切勿追捧蠅頭小利，而送走了客戶。

2.4 茜素紅染色結(jié)果

1.2.4 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞毒性 各組BMSCs 轉(zhuǎn)染72 h后，按照1 000 個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種至96 孔板，培養(yǎng)24 h 后，棄去原培養(yǎng)基，每孔加入10 μL CCK-8液孵育，2 h 后測(cè)OD

值，每隔24 h 檢測(cè)1 次，連續(xù)測(cè)10 d，檢測(cè)病毒轉(zhuǎn)染后對(duì)BMSCs 增殖的影響。

2.5 ALP 染色結(jié)果

4.2.5 標(biāo)本放反 在觀察細(xì)胞形態(tài)時(shí)，如白細(xì)胞分類通常使用油鏡觀察，但血涂片經(jīng)染色后，有的學(xué)生會(huì)把標(biāo)本反放在載物臺(tái)上。因?yàn)橛顽R頭鏡口率較小，需要標(biāo)本非常接近油鏡頭，如果放反，物體超出了顯微鏡工作距離，無論如何也找不到物像。解決方法：（1）發(fā)現(xiàn)載玻片放反，直接翻轉(zhuǎn)過來；（2）在制作載玻片時(shí)在其一端做標(biāo)記，防止觀察時(shí)放反。

2.6 各組成骨及成血管相關(guān)基因mRNA 表達(dá)

circRNA CDR1as 的mRNA 表達(dá)水平，在低表達(dá)實(shí)驗(yàn)組中circRNA CDR1as 的表達(dá)顯著降低（

＜0.001），在過表達(dá)實(shí)驗(yàn)組中顯著增高（

＜0. 001）。RUNX2、ALP、VEGF、Ang-1、OSX、COL-1、OCN 和OPN 的mRNA 表達(dá)水平在過表達(dá)實(shí)驗(yàn)組中高于其對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

＜0.001）；RUNX2、ALP、VEGF、Ang-1、OSX、COL-1、OCN 和OPN 的mRNA 表達(dá)水平在低表達(dá)實(shí)驗(yàn)組中低于其對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

＜0.001）（圖6）。

3 討 論

近年在組織工程骨的研究中，circRNA 為骨組織疾病及干細(xì)胞成骨分化方面注入了新的“血液”

。研究發(fā)現(xiàn)，在人類和小鼠的神經(jīng)元細(xì)胞中，circRNA CDR1as 被微小RNA（microRNA，miRNA）-7 和miRNA-671 所調(diào)控，兩者通過敲除circRNA CDR1as 的基因片段而對(duì)細(xì)胞發(fā)揮不同的刺激作用

。本實(shí)驗(yàn)通過以慢病毒載體的方式，轉(zhuǎn)染circRNA CDR1as 至小鼠BMSCs 中以檢測(cè)circRNA CDR1as 對(duì)骨髓干細(xì)胞成骨和成血管基因表達(dá)的影響，為后期轉(zhuǎn)染過circRNA CDR1as 的BMSCs 膜片包裹生物支架材料修復(fù)骨缺損奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，以探索circRNA CDR1as 在骨組織工程中的研究價(jià)值。本研究中，分別將過表達(dá)與低表達(dá)circRNA CDR1as 基因和空載慢病毒轉(zhuǎn)染至BMSCs 中，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組的轉(zhuǎn)染效率，四組轉(zhuǎn)染效率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。激光共聚焦顯微鏡觀察到BMSCs轉(zhuǎn)染72 h 后，細(xì)胞貼壁生長且形態(tài)規(guī)則，呈扁梭角形且觸角短小，由此可知慢病毒對(duì)細(xì)胞的形態(tài)無明顯影響。同時(shí)CCK-8 生長曲線結(jié)果顯示，circRNA CDR1as 過表達(dá)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖率3～10 d高于其對(duì)照組，而circRNA CDR1as 低表達(dá)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖率3～10 d 低于其對(duì)照組，提示過表達(dá)circRNA CDR1as 可促進(jìn)BMSCs 增殖，而低表達(dá)circRNA CDR1as 可抑制BMSCs 增殖。

骨缺損修復(fù)的過程中往往伴隨著成骨和成血管因子的基因變化，課題組前期左新慧等

通過在BMSCs 中過表達(dá)與低表達(dá)低氧誘導(dǎo)因子，發(fā)現(xiàn)了相關(guān)成骨和成血管基因的不同表達(dá)水平。Peng等

的研究指出，在上頜竇膜干細(xì)胞的成骨分化期間，OSX 的mRNA 表達(dá)水平隨著circRNA_33287 的過表達(dá)或沉默而增加或降低。Xu 等

在骨質(zhì)疏松癥患者中構(gòu)建了circRNA_0011269-miRNA 靶標(biāo)結(jié)合的網(wǎng)絡(luò)，并在該網(wǎng)絡(luò)中探尋到miR-122；利用雙熒光素酶報(bào)告驗(yàn)證了miR-122 與circRNA_0011269/RUNX2 的靶向關(guān)系；并證實(shí)circRNA_0011269 的過表達(dá)可以促進(jìn)RUNX2 的表達(dá)并抑制骨質(zhì)疏松癥。ALP 和RUNX2 是成骨細(xì)胞的早期標(biāo)志物，反映了成骨細(xì)胞的分化能力，同時(shí)可以將BMSCs 的相關(guān)成骨基因進(jìn)行定向分化、轉(zhuǎn)錄和翻譯

。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示當(dāng)過表達(dá)或低表達(dá)circRNA CDR1as 作用于BMSCs 時(shí)，ALP 和RUNX2 的mRNA 的表達(dá)水平分別呈升高和下降趨勢(shì)。OCN 是細(xì)胞骨向分化的晚期標(biāo)志物，能靈敏反映成骨細(xì)胞活性和骨轉(zhuǎn)換狀況

。OPN 廣泛存在于骨細(xì)胞中，充當(dāng)催化劑作用，加速類骨質(zhì)的礦化和成骨細(xì)胞的形成

。OSX 是一種特殊的成骨分化轉(zhuǎn)錄因子，其特殊性是只在骨組織細(xì)胞中表達(dá)，是骨形成所必需的相關(guān)因子

。COL-1 由成骨細(xì)胞分泌，在成骨細(xì)胞早期形成階段表現(xiàn)活躍，其表達(dá)活性持續(xù)至骨成熟階段

。本實(shí)驗(yàn)OCN、OPN、OSX、COL-1 的mRNA表達(dá)水平過表達(dá)組呈增高趨勢(shì)，而低表達(dá)組呈下降趨勢(shì)，提示過表達(dá)circRNA CDR1as 促進(jìn)BMSCs的成骨分化。VEGF 可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生和新生血管形成，是成血管的關(guān)鍵指標(biāo)

。Ang-1 在吸引血管周細(xì)胞、促進(jìn)血管重塑和成熟等方面具有重要作用，可進(jìn)一步增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞屏障的完整性

。本實(shí)驗(yàn)中，成血管標(biāo)志物VEGF、Ang-1 隨著circRNA CDR1as 的過表達(dá)和低表達(dá)而分別增高和降低，提示當(dāng)過表達(dá)或低表達(dá)circRNA CDR1as 作用于BMSCs 時(shí)，可以調(diào)節(jié)BMSCs 中的成骨-血管生成偶聯(lián)過程。Li 等

發(fā)現(xiàn)當(dāng)過表達(dá)或敲低circRNA CDR1as 作用于牙周膜干細(xì)胞時(shí)，觀察到過表達(dá)的circRNA CDR1as 促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，而敲低的circRNA CDR1as 抑制了ALP 的活性和成骨基因的表達(dá)，以及ALP 和茜素紅礦物沉積的減少，證實(shí)了circRNA CDR1as 參與了牙周膜干細(xì)胞成骨分化的調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)各組的茜素紅染色和ALP染色結(jié)果證明了circRNA CDR1as 對(duì)BMSCs 的成骨分化具有調(diào)節(jié)作用。

《背影》是朱自清先生寫于1925年的一篇回憶性散文，講述了普通小人物的平凡小事。文章以“我”的視野記錄了1917年離開南京前往北京大學(xué)求學(xué)，父子二人車站送別的情景。在人物描寫方面本文不同于一般的抒情散文，它沒有做過多的人物神情、心理、外貌的描寫，而是細(xì)致刻畫了父親的“背影”。對(duì)于《背影》這一經(jīng)典敘事性散文的研究，大致分為兩種類型：一種是從文本解讀的角度分析課文的主題、情感、人物形象等內(nèi)容，《背影》隨著時(shí)代的變遷，人們對(duì)其主題的解讀也是日漸不同。另一種則是從課堂教學(xué)的角度探討教學(xué)技巧，教學(xué)方式，研究課堂實(shí)錄。本文主要研究黃厚江《背影》的課堂實(shí)錄，對(duì)他的教學(xué)語言風(fēng)格做一個(gè)解析。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建慢病毒載體的方式，將過表達(dá)和低表達(dá)的circRNA CDR1as 轉(zhuǎn)染至BMSCs 中，證實(shí)了circRNA CDR1as 對(duì)BMSCs 的成骨及成血管基因起到一定的調(diào)控作用，為circRNA結(jié)合干細(xì)胞修復(fù)骨缺損提供了新思路。但本實(shí)驗(yàn)僅限于體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，后期將復(fù)合生物支架進(jìn)行動(dòng)物回植實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)circRNA CDR1as 在體內(nèi)的成骨及成血管的能力，以期更好的使其應(yīng)用于組織工程中。

【Author contributions】 Yang WZ performed the experiments and wrote the article. Zheng MJ performed the experiments. Han XZ and Zhou QQ revised the article. He HY designed the study and reviewed the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.

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