宋惠子，山寶琴*，張永濤，楊曉軍，王 超

（1.延安大學(xué)石油工程與環(huán)境工程學(xué)院；2.延安大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，陜西延安 716000）

子午嶺國家級自然保護(hù)區(qū)位于陜西省延安市南部富縣境內(nèi)，地處中國暖溫帶落葉闊葉林的西端［1］，保護(hù)對象主要是黃土高原稀有的天然次生林生態(tài)系統(tǒng)及野生動植物資源［2］。其中刺五加（Acant h opanax senticosus）是子午嶺國家保護(hù)區(qū)珍稀保護(hù)植物之一，也是中國一直利用的珍貴藥用植物資源。刺五加的干燥根及根莖，有益氣健脾、補(bǔ)腎安神的功效［3］，大多分布于中國東北地區(qū)。刺五加體內(nèi)含有多種苷類、多糖和黃酮類等化學(xué)活性成分，其根、莖和葉均可入藥，藥用價值十分廣泛［4］。其中刺五加苷具有抗疲勞、抗衰老、止血等功效，多糖成分能夠抗腫瘤、降血糖、調(diào)節(jié)免疫等，黃酮類還可調(diào)控心腦血管系統(tǒng)［5］。因此，對于刺五加化學(xué)活性成分含量的研究有助于對其藥理作用的進(jìn)一步發(fā)掘［6］。

目前針對刺五加化學(xué)活性成分的研究主要側(cè)重于含量、藥理作用等方面，研究樣地集中于東北、甘肅和寧夏等地區(qū)，陜北地區(qū)的資源分布及藥用價值等少見報道。因此，以陜北子午嶺保護(hù)區(qū)野生刺五加的莖干、新枝及嫩葉等為研究材料，測定刺五加不同部位中紫丁香苷、多糖及黃酮含量，分析陜北地區(qū)刺五加不同部位紫丁香苷、多糖和黃酮含量與其他地區(qū)差異，對其不同部位質(zhì)量進(jìn)行綜合評價，旨在揭示陜北地區(qū)野生刺五加潛在藥用價值，并為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究地概況

采樣點位于陜北子午嶺國家級自然保護(hù)區(qū)，陜西省富縣境內(nèi)，林區(qū)呈南北走向?？偯娣e為4.06×108m2，森林覆蓋率為88.3%，年平均氣溫為7.4℃，全年降水量平均為500~600 mm，海拔為920~1 680 m，地貌為陜北黃土高原丘陵溝壑的典型類型。

1.2 樣品采集與處理

2021年6月在子午嶺保護(hù)區(qū)槐樹莊周邊，東經(jīng)108°43′，北緯35°51′，海拔1 260 m，經(jīng)野外調(diào)查后選取典型分布區(qū)中長勢均勻的標(biāo)準(zhǔn)刺五加10株，分別采集刺五加莖、枝和嫩葉等不同部位樣品，裝入紙質(zhì)包裝袋。以上選材經(jīng)自然風(fēng)干、粉碎后過60目篩，備用。

1.3 研究方法

采取高效液相色譜法［7］來測定刺五加紫丁香苷含量。刺五加樣品與95%工業(yè)酒精1∶4混合，并用超聲波儀在水溫25℃下萃取8 h，隨后過濾得到刺五加提取液。分析時，選取流動相甲醇∶水=1∶1、C18反向柱、進(jìn)樣量10μL、升流速0.5 mL/min、柱溫25℃，采用UV檢測器（265 nm）進(jìn)行檢測。所用甲醇為色譜純，水為超純水，且經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾。

采用苯酚-硫酸法［8］測定刺五加多糖含量。取1.0 g刺五加不同部位樣品，以料液比1∶10，在功率480 W、頻率40 kHz、溫度55℃條件下，超聲提取30 min制成供試品溶液，另外配制0.15 mg/mL的葡萄糖對照品溶液。分別吸取葡萄糖對照品溶液、刺五加不同部位供試品溶液各2.0 mL，置于10 mL具塞試管中，然后加入1.0 mL苯酚，充分混勻后加入5.0 mL濃硫酸，混勻放置30 min后，在490 nm波長下進(jìn)行全波長掃描比色并記錄吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出刺五加不同部位多糖含量，公式如下：

式中，C為測得的葡萄糖樣品質(zhì)量濃度（mg/mL）；V為供試液體積（mL）；M為供試品質(zhì)量（mg）。

采用紫外分光光度法［9］測定刺五加黃酮含量。取1.25 g刺五加不同部位樣品，同時加入80%乙醇溶液50 mL放置于錐形瓶中，超聲提取40 min制成供試品溶液，另外配置0.634 mg/mL蘆丁對照品溶液。分別吸取刺五加不同部位供試品溶液1.0 mL，置于10 mL具塞試管中，加入0.3 mL的5%亞硝酸鈉，混勻靜置6 min后加入0.3 mL的10%硝酸鋁，混勻靜置6 min后再加入4 mL的4%NaOH，用蒸餾水稀釋至刻度，混勻放置12 min后，在512 nm波長下進(jìn)行全波長掃描比色并記錄吸光值，根據(jù)回歸線方程Y=0.556 4X-0.01，R2=0.988 6（Y為吸光度，X為對照品濃度），計算出刺五加不同部位黃酮含量，公式如下：

式中，Y為吸光度值；M為供試品質(zhì)量（mg）；A為稀釋倍數(shù)；V為供試液體積（mL）。

1.4 重復(fù)性試驗

取刺五加不同部位樣品，平行3次取樣用于制備供試品溶液，進(jìn)行紫丁香苷、多糖及黃酮含量的測定，結(jié)果取平均值。

1.5 精密度試驗

精密量取刺五加供試樣品各5份，按照測定多糖和黃酮方法操作顯色，測定吸光度值。

1.6 穩(wěn)定性試驗

分別取刺五加不同部位供試樣品，按苯酚-濃硫酸和亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色方法顯色后，每隔10 min測定一次吸光度并記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 刺五加紫丁香苷含量

通過高效液相色譜法分別對刺五加的莖干、新枝和嫩葉3個部位的紫丁香苷含量進(jìn)行測定。在相同的色譜分析條件下，紫丁香苷標(biāo)品的出峰保留時間為8.38 min，峰面積為701.957 mAu·min（見圖1A），其對應(yīng)紫丁香苷濃度為8.383 mg/L。經(jīng)測定分析，由色譜圖1B~1D可見，刺五加的莖干、新枝和嫩葉在保留時間為8.30 min處均存在吸收峰，其對應(yīng)峰面積分別為0.369、0.049和0.015 mAu·min，利用單點外標(biāo)法計算刺五加的莖干、新枝和嫩葉中紫丁香苷濃度分別為0.004 4、0.000 59和0.000 18 mg/L，換算后得到刺五加莖干、新枝、嫩葉中紫丁香苷含量分別為0.001 8%、0.000 2%和0.000 1%，莖干中紫丁香苷含量最高，新枝次之，嫩葉含量最少，其中莖干分別高出新枝800%，高出嫩葉1 700%。從以上分析可知，子午嶺刺五加紫丁香苷活性成分含量主要集中于莖干，體現(xiàn)出了其莖干較高的藥用價值。子午嶺保護(hù)區(qū)刺五加不同部位紫丁香苷含量為莖干＞新枝＞嫩葉，與劉芳芳［10］的研究結(jié)果相一致，刺五加紫丁香苷含量低于吉林省露水河、河北霧靈山國家級自然保護(hù)區(qū)和遼寧省本溪市［11］的紫丁香苷含量。曹建國等［12］發(fā)現(xiàn)刺五加新枝中紫丁香苷含量最高，平均達(dá)到2.94%，通過對比不同季節(jié)刺五加紫丁香苷含量發(fā)現(xiàn)刺五加中紫丁香苷由于產(chǎn)地不同，季節(jié)差異不同含量存在明顯差異，春、秋季含量較高，夏季含量較低。不同地區(qū)刺五加紫丁香苷含量可能與周圍環(huán)境、所處地理位置以及遺傳學(xué)有關(guān)。張崇禧等［13］對刺五加不同采收期野生與仿生根、莖中紫丁香苷含量進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)刺五加野生根中紫丁香苷含量最多，平均達(dá)到0.204%。與其他地區(qū)相比較，子午嶺保護(hù)區(qū)刺五加紫丁香苷含量僅處于較低水平。

圖1 刺五加高效液相色譜圖

2.2 刺五加多糖含量

分析刺五加莖干、新枝、莖韌皮和嫩葉4個部位的多糖含量，結(jié)果表明不同部位多糖含量差異較大。其中莖干中含量最高為7.53%，嫩葉中含量最少為3.43%，莖干含量約是嫩葉含量的2.2倍（見表1）。精密稱取已知多糖含量的刺五加莖干粉末1.000 g，按照苯酚-濃硫酸顯色法顯色，精密度試驗結(jié)果表明，測定平均值為7.53%，RSD=0.356 1%。穩(wěn)定性試驗經(jīng)50 min內(nèi)，吸光度基本趨于穩(wěn)定，RSD=0.563 2%。

表1 刺五加不同部位多糖含量測定結(jié)果

子午嶺保護(hù)區(qū)刺五加不同部位多糖含量莖干＞莖韌皮＞新枝＞嫩葉，這與程昆木等［14］研究結(jié)果相一致。莖干部位多糖平均含量最大為7.53%，由此可知，可首選刺五加莖干作為刺五加多糖類藥品的提取原料。刺五加多糖含量在不同采集樣地均不同，葦沙河、貓耳山及老岑界碑葉中總多糖平均含量分別為2.1%、1.8%和1.98%，吉林省臨江市老嶺基地刺五加葉柄部位平均多糖含量為5.07%，莖干部位平均多糖含量為4.21%，根皮部位平均多糖含量為1.75%，葉片部位平均多糖含量為0.417%［15］。李俊萍［8］選取了14個不同產(chǎn)地刺五加對其多糖含量進(jìn)行測定，多糖含量最高的地區(qū)為黑龍江省七臺河市勃利福興林場（7.91%），多糖含量最低的地區(qū)為黑龍江省雙鴨山市饒河大頂子山（4.26%）。孟繁磊等［16］研究表明，不同采樣點刺五加多糖含量明顯不同，對于同一采樣點，采收時間的推遲也會導(dǎo)致多糖含量變化，多糖含量在6—8月呈上升趨勢，9月份后開始下降。這也進(jìn)一步說明不同采樣地刺五加多糖含量均受濕度、溫度、土壤條件、地理位置及光照時間的影響。子午嶺保護(hù)區(qū)刺五加多糖含量與大多地區(qū)相比含量較大，處于較高分布水平。這得益于子午嶺保護(hù)區(qū)大陸暖溫帶季風(fēng)氣候及1 000 m以上的平均海拔，為刺五加提供了適宜的生態(tài)環(huán)境。

2.3 刺五加黃酮含量

刺五加不同部位黃酮含量呈顯著差異，如表3所示。其中嫩葉中含量最多為5.12%，莖韌皮含量最少為0.45%，嫩葉含量約是莖韌皮含量的11.38倍。準(zhǔn)確稱取已知黃酮含量的刺五加莖干粉末1.000 g，按照亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法顯色，精密度試驗結(jié)果表明，測定平均值為1.53%，RSD=0.364 8%。穩(wěn)定性試驗經(jīng)50 min內(nèi)，吸光度基本趨于穩(wěn)定，RSD=0.535 8%。

表3 刺五加不同部位黃酮含量測定結(jié)果

子午嶺保護(hù)區(qū)刺五加莖干、新枝、嫩葉中均含有黃酮類化合物，不同部位黃酮含量為嫩葉＞莖干＞新枝＞莖韌皮，這與代吉瑞等［9］研究一致。嫩葉部位黃酮平均含量最高為5.12%，與黑龍江省蘿北縣［17］和東北林業(yè)大學(xué)老山人工林試驗站相比較高［18］。曹建國等［19］研究了3種不同生境下刺五加嫩葉的黃酮含量，發(fā)現(xiàn)不同生境下刺五加嫩葉中黃酮含量存在較大差異，其中林緣生境中的刺五加黃酮含量（2.9%）＞林隙生境中的刺五加黃酮含量（2.2%）＞林內(nèi)生境中的刺五加黃酮含量（1.6%），均低于子午嶺自然保護(hù)區(qū)刺五加嫩葉黃酮含量；吉林省露水河刺五加根、葉、果、莖干、新枝、莖韌皮及莖皮7個部位總黃酮含量分別是1.56%、5.46%、1.97%、1.41%、0.89%、0.59%和1.02%，與子午嶺國家級自然保護(hù)區(qū)不同部位黃酮含量相當(dāng)［10］。另有研究發(fā)現(xiàn)刺五加黃酮含量差異不但受采樣地區(qū)影響，還受季節(jié)變化、溫度的影響。黃酮含量會隨著季節(jié)動態(tài)發(fā)生變化，5—8月期間呈逐漸降低的趨勢，卻在9月份有較大回轉(zhuǎn)［19］。由于黃酮類物質(zhì)具有多方面的藥用功效，季節(jié)差異導(dǎo)致該地區(qū)黃酮含量變化的研究更有助于我們在合適的時機(jī)提取刺五加黃酮類藥用活性成分。子午嶺保護(hù)區(qū)刺五加黃酮含量與大多地區(qū)相比含量處于中等分布水平。因此，可首先選擇刺五加嫩葉作為制造黃酮類藥物的提取原料。本研究表明陜北刺五加嫩葉具有很好的黃酮類藥物提取價值。

3 結(jié)論

陜北子午嶺保護(hù)區(qū)刺五加不同提取部位其化學(xué)活性成分含量存在較大差異，紫丁香苷和多糖主要分布在植物莖干，黃酮主要分布在植物嫩葉。陜北子午嶺保護(hù)區(qū)刺五加紫丁香苷、多糖和黃酮含量與其它地區(qū)相比，紫丁香苷處于較低水平，多糖處于較高分布水平，黃酮處于中等水平，多糖和黃酮具有較大開發(fā)價值，值得進(jìn)一步深入研究。