李全,張健,王琪,周妍妍*
(1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院,黑龍江 哈爾濱 150040)
阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)即老年性癡呆,是一種以認知功能障礙進行性加重為臨床表現(xiàn)的退行性神經(jīng)病[1-2],其病理改變主要以β-淀粉樣蛋白(amyloid-β, Aβ)沉積、Tau蛋白過度磷酸化所導致的神經(jīng)纖維纏結(neurofibrillary tangle,NFT)為特征[3]。中醫(yī)認為腎精虧虛、痰蒙腦竅是AD的基本病機,地黃飲子出自《黃帝素問·宣明論方》,有補腎、化痰、開竅之功用,現(xiàn)代臨床、實驗研究發(fā)現(xiàn)地黃飲子防治神經(jīng)退行性疾病有著顯著的療效[4]。課題組前期實驗研究證實地黃飲子APP/PS1雙轉基因癡呆小鼠具有提高學習記憶能力、抑制氧化應激[5]及神經(jīng)炎癥等作用[6],為進一步探討地黃飲子對APP/PS1雙轉基因癡呆小鼠工作記憶及海馬超微結構的影響,故而進行了本次實驗研究。
選取6月齡的雄性APP swe/PS1dE9雙轉基因癡呆小鼠60只,體質量(25±4)g,同月齡同背景的陰性小鼠30只,體質量(23±5)g,購自常州卡文斯實驗動物有限公司(江蘇),編號:SCXK(蘇)2016-0010,于室溫(22±3)℃、相對濕度(45±5)%的SPF級實驗動物飼養(yǎng)室中適應性飼養(yǎng),自由飲食、自由飲水。
地黃飲子藥物組成:熟地黃、山茱萸、肉蓯蓉、石斛、麥冬、五味子、石菖蒲、遠志、茯苓、肉桂、炮附子和巴戟天各20 g,生姜、大棗、薄荷各5 g,由黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院提供,將上述飲片浸泡1 h、煎煮1 h后濾出藥液,再次加水煎煮1 h,將2次藥液混合分裝, 4 ℃冷藏備用。
多聚甲醛、戊二醛(北京雷根);鹽酸戊巴比妥鈉(上海斯信);甲苯胺藍(美國SIGMA)。Y迷宮、Su-P erMaze行為學測試軟件(上海欣軟);透射電鏡(日本HITACHI);倒置光學顯微鏡(日本NIKON);超薄切片機(德國LEICA)。
Y迷宮行為學測試于實驗第1、2、3個月地黃飲子或蒸餾水灌胃結束后進行。正式實驗開始前進行適應性訓練,將小鼠放入迷宮中央?yún)^(qū)任其自由活動8 min,每只小鼠活動結束后用75%消毒酒精噴撒宮臂以消除小鼠氣味,適應周期為1 d。正式實驗時,將小鼠頭部朝向起始臂末端擋板,將其放入起始臂自由探索8 min,同時記錄進臂總次數(shù);計算小鼠正確自發(fā)交替率,小鼠身體完全進入宮臂記為有效進臂次數(shù),每3次進入不同的宮臂則記為一次正確的自發(fā)交替,自發(fā)交替率=[正確進臂次數(shù)/(總進臂次數(shù)-2)]×100%,試驗周期為1 d[7]。
透射電鏡檢測于行為學實驗結束后進行,從各實驗月份的空白組、模型組、地黃組隨機選取3只小鼠,以1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后,以4%多聚甲醛(pH=7.4)、生理鹽水心臟灌流至肝臟變?yōu)榘咨?,斷頭取腦并依照腦立體定位圖譜剝離海馬后放入2.5%戊二醛中下固定2 h,將海馬組織樣本修飾成1 mm3小塊,丙酮梯度脫水、包埋、半薄切片處理后甲苯胺藍染色,倒置光鏡定位后制作超薄切片,經(jīng)醋酸雙氧鈾、枸椽酸鉛雙染色[8],透射電鏡1 200~4 000倍觀察小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞超微結構并抓拍照片。
應用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件將所得數(shù)據(jù)處理分析,數(shù)據(jù)結果以均數(shù)±標準誤表示,對實驗所得數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(one-way ANOVA),P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。
3.1.1 實驗第1個月地黃飲子對APP/PS1小鼠自發(fā)交替率的影響
實驗第1個月的各組小鼠進臂總次數(shù)無差異,不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05);與B1組相比,M1組小鼠正確自發(fā)交替率顯著降低,具有統(tǒng)計學意義(P<0.01);與M1組相比,D1組小鼠正確自發(fā)交替率顯著提高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表1。
表1 給藥1個月Y迷宮測試結果比較
3.1.2 實驗第2個月地黃飲子對APP/PS1小鼠自發(fā)交替率的影響
實驗第2個月的各組小鼠進臂總次數(shù)無明顯差異,不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05);與B2組相比,M2組小鼠正確自發(fā)交替率顯著降低,具有統(tǒng)計學意義(P<0.01);與M2組相比,D2組小鼠正確自發(fā)交替率顯著提高,具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見表2。
表2 給藥2個月Y迷宮測試結果比較
3.1.3 實驗第3個月地黃飲子對APP/PS1小鼠自發(fā)交替率的影響
應做到真正合理有效的利用現(xiàn)有的資源,結合水利信息工程建設自身的特點,有針對性地制訂與其相關的標準,逐步實現(xiàn)水利信息化建設的標準。
實驗第3個月的各組小鼠進臂總次數(shù)無明顯差異,不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05);與B3組相比,M3組小鼠正確自發(fā)交替率顯著降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01);與M3組相比,D3組小鼠正確自發(fā)交替率顯著提高,具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見表3。
此外,M3組與M1組小鼠相比正確自發(fā)交替率顯著降低,具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),M3組與M2組小鼠相比正確自發(fā)交替率顯著降低,具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而各給藥月份地黃組小鼠正確自發(fā)交替率無明顯差異,不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
表3 給藥3個月Y迷宮測試結果比較
3.2.1 實驗1個月地黃飲子對APP/PS1小鼠病理特征的影響
鏡下觀察B1組小鼠海馬CA1區(qū)可見神經(jīng)細胞數(shù)目較多、結構完整、分布密集,見圖1A。與B1組相比,M1組海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞結構相對完整,但內(nèi)質網(wǎng)減少且伴有不同程度的擴張,線粒體腫脹,線粒體嵴呈畸形樣改變,鏡下觀察細胞電子密度不均,散見少量的溶酶體與脂褐素,見圖1B。與M1組相比,D1組海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞結構完整,線粒體輕度腫脹,結構相對完整,形態(tài)較為規(guī)則,見圖1C。
3.2.2 實驗2個月地黃飲子對APP/PS1小鼠病理特征的影響
至實驗第2個月,B2組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞器結構完整,見圖1D。M2組與B2組相比小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞染色質邊集,可見細胞凋亡現(xiàn)象,見圖1E。而地黃飲子組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞數(shù)量較多且分布密集,結構完整,可見少數(shù)脂褐素,見圖1F。
3.2.3 實驗3個月地黃飲子對APP/PS1小鼠病理特征的影響
至實驗第3個月,B3組小鼠海馬CA1區(qū)少數(shù)線粒體輕度腫脹,鏡下可見散在少量溶酶體,見圖1G。與B3組相比,M3組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞破裂、分散,細胞固化萎縮后可見凋亡小體,內(nèi)質網(wǎng)減少且伴有不同程度的擴張,線粒體腫脹、破裂,溶酶體與脂褐素并見,見圖1H。而D3組小鼠CA1區(qū)線粒體形態(tài)結構規(guī)則,與空白組神經(jīng)元細胞鏡下形態(tài)已較為接近,見圖1I。
圖1 各實驗月份各組小鼠海馬CA1區(qū)超微結構
AD是一種起病隱匿并且呈進行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,AD病在中醫(yī)上被歸為“癡呆”“呆癥”范疇,腎精虧虛,痰蒙腦竅是其基本病機,經(jīng)典名方地黃飲子在方劑學中被歸為陰陽雙補之劑[9],具有補腎、化痰、開竅之功效,符合AD的中醫(yī)發(fā)病機制,無論是古代醫(yī)家還是現(xiàn)代醫(yī)家運用地黃飲子防治老年性癡呆都有著顯著療效,故本實驗選用地黃飲子探討其對APP/PS1雙轉基因癡呆小鼠工作記憶及海馬超微結構的影響。
通過對Y迷宮實驗結果的分析發(fā)現(xiàn),各實驗月份的各組小鼠的進臂總次數(shù)并無明顯差異(P>0.05),說明小鼠視力及運動能力正常,排除體力及視力對小鼠探索迷宮的影響。隨著實驗月份的增加,模型組APP/PS1小鼠自發(fā)交替率逐漸降低,尤其是M3組與M1、M2組相比,APP/PS1小鼠工作記憶能力顯著降低;而經(jīng)地黃飲子干預的APP/PS1小鼠自發(fā)交替率逐漸上升,這表明地黃飲子能夠提高APP/PS1小鼠的工作記憶能力,并且隨著給藥時間的增加呈逐漸上升的趨勢。
本課題組基于前期HE染色、尼氏染色、免疫熒光染色等實驗[10],探討了光鏡下APP/PS1小鼠海馬區(qū)的病理改變,為進一步觀察APP/PS1小鼠海馬區(qū)的超微結構改變,本實驗采用了透射電鏡呈像技術。經(jīng)透射電鏡鏡下觀察顯示,隨著實驗月份的增加,模型組小鼠海馬CA1區(qū)線粒體逐漸發(fā)生腫脹、變形、破裂,神經(jīng)細胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象,并隨著小鼠月齡的增加凋亡小體逐漸增多;而經(jīng)地黃飲子干預的APP/PS1小鼠海馬CA1區(qū)線粒體只是輕度腫脹,同時神經(jīng)細胞也未發(fā)生凋亡現(xiàn)象,并且隨著給藥時間的增加神經(jīng)細胞形態(tài)結構已與空白組相接近。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)在B3組小鼠海馬CA1區(qū)線粒體出現(xiàn)了輕度的腫脹、變形的改變,這表明即使是陰性空白組小鼠也會隨著月齡的增長線粒體結構出現(xiàn)改變,而地黃飲子能夠顯著保護神經(jīng)細胞,抑制細胞的凋亡,改善線粒體形態(tài)結構,這與課題組既往研究[11]的地黃飲子含藥腦脊液可減輕細胞的受損程度,提高細胞活力,抑制細胞凋亡的實驗結果相符。
綜上,各實驗月份的各組小鼠的病理學改變與行為學改變相一致,APP/PS1小鼠隨著月齡增加工作記憶能力呈進行性下降,線粒體發(fā)生腫脹變形,并且至小鼠9月齡時出現(xiàn)大量的凋亡小體;地黃飲子可改善APP/PS1小鼠隨月齡增長而下降的工作記憶能力,并抑制神經(jīng)細胞凋亡,改善線粒體形態(tài)結構。