許丁帆 劉艷軍 何遠(yuǎn)秦 黃俊軒 武春霞 李建科

摘 要：為建立金銀木松散型胚性愈傷組織培養(yǎng)體系，該文研究金銀木不同外植體、不同植物激素配比對(duì)金銀木松散型胚性愈傷組織誘導(dǎo)與繼代保持的影響。結(jié)果表明，金銀木葉片為誘導(dǎo)愈傷組織最適外植體;葉片在MS（Murashige & Skoog Basal Medium，MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基）+0.5 mg/L BA（Benzylaminopurine，芐氨基腺嘌呤）+1.0 mg/L 2，4-D（2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸，）培養(yǎng)基上可誘導(dǎo)出松散型愈傷組織，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)100%;將松散型愈傷組織轉(zhuǎn)接到MS+0.5 mg/L BA+0.25 mg/L 2，4-D培養(yǎng)基上，每20 d繼代培養(yǎng)一次，繼代培養(yǎng)2～3次后可獲得金銀木松散型胚性愈傷組織。

關(guān)鍵詞：金銀木;葉片;松散型胚性愈傷組織;培養(yǎng)基;激素

中圖分類號(hào)：S793.9? ????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A?? 文章編號(hào)：1006-8023（2022）02-0027-07

Induction of Loose Embryogenic Callus of Lonicera maackii

XU Dingfan， LIU Yanjun*， HE Yuanqin， HUANG Junxuan， WU Chunxia， LI Jianke

（College of Horticulture and Landscape， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300392， China）

Abstract：In order to establish the culture system of loose embryogenic callus of Lonicera maackii， the effects of different explants and different plant hormone ratio on the induction and subculture maintenance of loose embryogenic callus were studied. The results showed that the leaf of L.maackii was the most suitable explant for callus induction; loose callus could be induced from the leaf of L.maackii on the medium of MS （Murashige & Skoog Basal Medium） +0.5 mg/L BA （Benzylaminopurine） +1.0 mg/L 2，4-D （2，4-Dichlorophenoxyacetic acid）， and the callus induction rate reached 100%; the loose callus were transferred to the medium of MS+0.5 mg/L BA+0.25 mg/L 2，4-D， and subcultured every 20 days， the loose embryogenic callus were obtained after subculture for 2-3 times.

Keywords：Lonicera maackii; leaf; loose embryogenic callus; culture medium; hormones

0 引言

金銀木（Lonicera maackii （Rupr.） Maxim.）又名金銀忍冬，忍冬科（Caprifoliaceae）忍冬屬（Lonicera）落葉灌木或小喬木，生性強(qiáng)健，耐旱、耐寒，適應(yīng)性強(qiáng)，對(duì)土壤要求不嚴(yán)，具有較強(qiáng)的重金屬富集能力和空氣凈化能力，被廣泛應(yīng)用于園林綠化中，是華北地區(qū)重要的觀花、觀果樹種之一。此外，金銀木在醫(yī)療、食品及化妝品等產(chǎn)業(yè)均有較高的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。當(dāng)前，金銀木苗木繁殖主要以播種和扦插繁殖為主，也可通過壓條和嫁接等方式進(jìn)行繁殖。但常規(guī)繁殖方式速度慢、效率低。

隨著植物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，體細(xì)胞胚胎發(fā)生已逐漸成為植物大規(guī)模繁殖的主要方式，具有繁殖系數(shù)高、遺傳穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，利用體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)和胚性愈傷組織的超低溫保存技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)優(yōu)良種質(zhì)資源的規(guī)?；a(chǎn)和長期保存。而優(yōu)質(zhì)的胚性愈傷組織是體細(xì)胞胚胎發(fā)生的關(guān)鍵，是大規(guī)模植株再生的基礎(chǔ)，是遺傳轉(zhuǎn)化的重要材料，也是研究植物單細(xì)胞分化和基因全能性表達(dá)的理想材料。

目前國內(nèi)外對(duì)金銀木的研究主要集中在有效成分提取和栽培等方面，對(duì)金銀木組織培養(yǎng)方面的研究報(bào)道較少，僅在組培快繁方面進(jìn)行了一定的研究，未見金銀木愈傷組織誘導(dǎo)的相關(guān)研究報(bào)道。關(guān)于忍冬屬植物的愈傷組織研究報(bào)道較多，如金銀花（Lonicera japonica）、灰氈毛忍冬（Lonicera macranthoides Hand.-Mazz）等已開展細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及其次生代謝物生產(chǎn)的相關(guān)研究，但至今尚未見忍冬屬植物胚性愈傷組織的有關(guān)研究報(bào)道。本試驗(yàn)以金銀木不同外植體類型，通過調(diào)整培養(yǎng)基中激素的配比和用量，建立金銀木松散型胚性愈傷組織誘導(dǎo)體系，為進(jìn)一步誘導(dǎo)金銀木體細(xì)胞胚胎發(fā)生奠定基礎(chǔ)，為金銀木體細(xì)胞離體誘變育種及次生代謝物生產(chǎn)等研究提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 外植體制備與消毒

選取天津農(nóng)學(xué)院東校區(qū)內(nèi)生長健壯、無病蟲害的金銀木植株，于4月上旬晴天的早晨，剪取腋芽未萌發(fā)的半木質(zhì)化枝條，去除葉片和頂芽，保留葉柄，保濕帶回實(shí)驗(yàn)室。將枝條置于自來水下沖洗10 min后，在超凈工作臺(tái)中，將枝條剪成2～3 cm 的帶腋芽莖段，70%乙醇溶液浸泡20 s，再用2%有效氯的次氯酸鈉溶液消毒4 min，消毒時(shí)不斷搖動(dòng)。消毒后用無菌水浸泡3次，每次5 min，其間不斷搖晃。用無菌濾紙吸干莖段表面水分，并剪去兩端消毒損傷部分，接種至1/2MS（Murashige & Skoog Basal Medium）+2.5 mg/L GA3（赤霉素）培養(yǎng)基上誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)。

1.2 松散型愈傷組織誘導(dǎo)外植體的篩選

在金銀木腋芽快速生長期，剪取長約0.5 cm的幼嫩莖段，莖段不帶生長點(diǎn);選擇初展葉的葉片，剪成約0.5 cm×0.5 cm的小塊;葉柄帶葉片基部，長約0.5 cm，將外植體平置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基表面。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸），每種外植體接種6瓶，每瓶接種5個(gè)外植體，重復(fù)3次。每天對(duì)接種材料進(jìn)行觀察記錄，30 d后統(tǒng)計(jì)形成愈傷組織的外植體數(shù)，并計(jì)算愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.3 松散型愈傷組織誘導(dǎo)激素配比的篩選

將葉片接種到不同的松散型愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同質(zhì)量濃度BA（芐氨基腺嘌呤）、2，4-D。每種誘導(dǎo)培養(yǎng)基接種6瓶，每瓶接種5個(gè)外植體，試驗(yàn)重復(fù)3次。30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.4 松散型胚性愈傷組織的誘導(dǎo)與繼代保持

選取誘導(dǎo)的松散型愈傷組織外部易剝離的部分，從外植體上切下，大小約為0.25 cm3，選擇生長狀態(tài)基本一致的接種至不同的胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基采用MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同質(zhì)量濃度的BA、2，4-D。試驗(yàn)重復(fù)3次，每次重復(fù)接種10瓶，每瓶接種5塊愈傷組織。每20 d繼代培養(yǎng)一次，每次繼代培養(yǎng)時(shí)選擇結(jié)構(gòu)松散、質(zhì)地硬脆的新生愈傷組織，5次繼代培養(yǎng)后記錄愈傷組織生長速度、結(jié)構(gòu)質(zhì)地與顏色。每次繼代培養(yǎng)后鑒定愈傷組織胚性情況。

1.5 胚性愈傷組織細(xì)胞學(xué)的鑒定

取少量愈傷組織用卡寶品紅染液（Carbol fuchsin）或1%碘-碘化鉀溶液染色后壓片，使用Leica DM4000顯微鏡觀察愈傷組織的胚性情況。

胚性愈傷組織細(xì)胞較小，細(xì)胞核大，胞質(zhì)濃，部分細(xì)胞可見分裂相;1%碘-碘化鉀溶液染色淀粉粒積累多。非胚性愈傷組織細(xì)胞大，形狀為圓形、橢圓形或不規(guī)則形狀，細(xì)胞核常偏向一側(cè)且細(xì)胞核較小，無分裂相細(xì)胞;1%碘-碘化鉀溶液染色淀粉粒積累少或沒有淀粉粒積累。

1.6 培養(yǎng)條件

以上培養(yǎng)基均采用100 mL廣口三角瓶為容器，每個(gè)三角瓶加入約40 mL的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基均添加瓊脂 7.0 g/L、蔗糖30 g/L，滅菌前調(diào)節(jié)pH為5.8～6.0，121 ℃、0.1 MPa下滅菌20 min。培養(yǎng)溫度為25 ℃±2 ℃，24 h光照，光照強(qiáng)度1 000～1 500 lx。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

愈傷組織誘導(dǎo)率=（形成愈傷組織的外植體數(shù)/外植體總數(shù)）×100%。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用excel 2013和SPSS Statistic 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外植體類型對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

接種6～8 d后，大部分外植體傷口處出現(xiàn)黃白色愈傷組織，30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率見表1。由表1可知，從愈傷組織結(jié)構(gòu)與質(zhì)地看，在MS+1.0 mg/L 2，4-D上，不同外植體誘導(dǎo)的愈傷組織無明顯差異。但從愈傷組織誘導(dǎo)率看，不同外植體類型形成愈傷組織的能力存在差異，其中葉片的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，表明金銀木葉片的脫分化能力明顯高于莖段和葉柄。同時(shí)，葉片誘導(dǎo)的愈傷組織生長速度也快于莖段和葉柄誘導(dǎo)的愈傷組織。因此，葉片是誘導(dǎo)金銀木愈傷組織的理想外植體類型。不同外植體誘導(dǎo)愈傷組織情況如圖1所示。

2.2 不同激素配比對(duì)松散型愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表2可知，不添加植物激素的對(duì)照很難誘導(dǎo)出愈傷組織，葉片外植體在培養(yǎng)基中逐漸褐化，僅少數(shù)外植體邊緣出現(xiàn)極少量的點(diǎn)狀綠色愈傷組織。當(dāng)培養(yǎng)基中添加一定質(zhì)量濃度的2，4-D后，金銀木葉片愈傷組織誘導(dǎo)率顯著提高，說明2，4-D對(duì)金銀木愈傷組織的誘導(dǎo)影響顯著。同時(shí)，2，4-D能夠提高愈傷組織的生長速度，愈傷組織生長速度隨著2，4-D質(zhì)量濃度的提高而加快。當(dāng)2，4-D在較低質(zhì)量濃度0.5 mg/L時(shí)，愈傷組織生長速度較快，結(jié)構(gòu)松散但質(zhì)地較軟，顏色呈白色，如圖2（a）所示;當(dāng)2，4-D質(zhì)量濃度為1.0 mg/L時(shí)，愈傷組織生長速度變快，但誘導(dǎo)的愈傷組織仍為結(jié)構(gòu)松散、質(zhì)地較軟的白色愈傷組織;當(dāng)2，4-D質(zhì)量濃度增大至2.0 mg/L時(shí)，愈傷組織生長速度快，為質(zhì)地稀軟的白色愈傷組織，如圖2（b）所示，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，愈傷組織出現(xiàn)部分褐化現(xiàn)象。當(dāng)培養(yǎng)基中BA配合2，4-D使用時(shí)，愈傷組織質(zhì)地與顏色發(fā)生較大變化。當(dāng)0.5 mg/L BA配合較低質(zhì)量濃度 0.5 mg/L 2，4-D時(shí)，愈傷組織結(jié)構(gòu)松散，質(zhì)地較硬，顏色呈黃色，如圖2（c）所示;當(dāng)0.5 mg/L BA配合1.0 mg/L 2，4-D的激素時(shí)，愈傷組織結(jié)構(gòu)松散，質(zhì)地較硬，生長速度變快;當(dāng)0.5 mg/L BA配合2.0 mg/L 2，4-D時(shí)，愈傷組織生長速度快、結(jié)構(gòu)松散、質(zhì)地較軟，如圖2（d）所示，說明當(dāng)0.5 mg/L BA配合 2，4-D使用時(shí)，愈傷組織質(zhì)地會(huì)隨著2，4-D質(zhì)量濃度的增加而變軟。當(dāng)0.5 mg/L 2，4-D配合不同質(zhì)量濃度BA時(shí)，愈傷組織結(jié)構(gòu)會(huì)隨著BA質(zhì)量濃度的增加而變緊密，愈傷組織質(zhì)地則隨BA質(zhì)量濃度的增加而變硬。當(dāng)激素質(zhì)量濃度為0.5 mg/LBA+1.0mg/L 2，4-D時(shí)，葉片外植體誘導(dǎo)得愈傷組織結(jié)構(gòu)松散、質(zhì)地較硬，生長速度較快，愈傷組織組織誘導(dǎo)率達(dá)100%，為理想的金銀木松散型愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方。

2.3 不同激素配比對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)與胚性保持的影響

將上步誘導(dǎo)的松散型愈傷組織轉(zhuǎn)接到胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，5次繼代培養(yǎng)時(shí)不同激素配比對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)與胚性保持效果不同，見表3。由表3可知，2，4-D對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)與胚性保持影響顯著，不添加2，4-D或2，4-D質(zhì)量濃度過高或過低均不利于胚性愈傷組織誘導(dǎo)與胚性保持。培養(yǎng)基中只添加0.5 mg/L BA時(shí)，5次繼代培養(yǎng)均不能獲得胚性愈傷組織，且隨著愈傷組織繼代次數(shù)

的增加，愈傷組織結(jié)構(gòu)變致密、質(zhì)地變硬，顏色為深綠色，繼代培養(yǎng)1次如圖2（e）所示，繼代培養(yǎng)5次如圖2（f）所示。當(dāng)0.5 mg/L BA配合1.0 mg/L 2，4-D時(shí)，經(jīng)5次繼代培養(yǎng)，未能誘導(dǎo)出胚性愈傷組織，且愈傷組織質(zhì)地隨著繼代次數(shù)的增加而逐漸變軟，顯微鏡觀察為無明顯細(xì)胞核結(jié)構(gòu)的薄壁細(xì)胞，如圖3（b）所示。降低2，4-D質(zhì)量濃度，愈傷組織逐漸向著胚性愈傷組織轉(zhuǎn)變，但胚性愈傷組織的胚性化程度與胚性保持情況差異明顯。當(dāng)0.5 mg/L BA配合0.5 mg/L 2，4-D時(shí)，2次繼代培養(yǎng)后可誘導(dǎo)出胚性愈傷組織，但愈傷組織不能完全保持胚性，部分胚性愈傷組織細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)闊o明顯細(xì)胞核結(jié)構(gòu)的薄壁細(xì)胞。當(dāng)0.5 mg/L BA配合0.25 mg/L 2，4-D時(shí)，可誘導(dǎo)出胚性愈傷組織，2次繼代培養(yǎng)后經(jīng)顯微鏡觀察均為胚性愈傷組織細(xì)胞，且在此激素配比的培養(yǎng)基上，經(jīng)過5次繼代培養(yǎng)，松散型胚性愈傷組織可以穩(wěn)定增殖且保持胚性。當(dāng)0.5 mg/L BA配合0.1 mg/L 2，4-D時(shí)，5次繼代培養(yǎng)均是胚性愈傷組織與非胚性愈傷組織同時(shí)存在，愈傷組織不能完全胚性化。因此，理想的金銀木松散型胚性愈傷組織誘導(dǎo)與胚性保持培養(yǎng)基配方為：MS+0.5 mg/L BA+0.25 mg/L 2，4-D。

3 結(jié)論與討論

植物的體細(xì)胞經(jīng)過重編程過程形成胚性愈傷組織，再從胚性愈傷組織細(xì)胞分化形成體細(xì)胞胚，這一過程為體細(xì)胞胚的間接發(fā)生途徑。胚性愈傷組織是體細(xì)胞胚間接發(fā)生途徑的前提。胚性愈傷組織的誘導(dǎo)受到母株基因型、外植體類型、培養(yǎng)基、激素和培養(yǎng)條件等諸多因素的影響。選擇適宜的外植體類型是誘導(dǎo)胚性愈傷組織的關(guān)鍵因子之一。蔣娜等誘導(dǎo)灰氈毛忍冬愈傷組織，得出其葉片的愈傷組織誘導(dǎo)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于莖段的誘導(dǎo)率，且剛剛萌發(fā)的外植體更適合誘導(dǎo)愈傷組織。因此，不同類型或同一類型處于不同發(fā)育階段的外植體會(huì)直接影響愈傷組織誘導(dǎo)的結(jié)果。有研究表明，分生組織細(xì)胞和胚性細(xì)胞在組織學(xué)、形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)上有許多相似之處。因此，含分生組織細(xì)胞多的外植體相對(duì)更容易誘導(dǎo)胚性愈傷組織。

植物生長調(diào)節(jié)劑是胚性愈傷組織誘導(dǎo)與保持的關(guān)鍵，其種類、質(zhì)量濃度及配比決定了細(xì)胞發(fā)育的方向。在胚性愈傷組織誘導(dǎo)與增殖過程中往往同時(shí)添加生長素和細(xì)胞分裂素，適宜質(zhì)量濃度的生長素與細(xì)胞分裂素配比能有效促進(jìn)胚性愈傷組織的形成。本試驗(yàn)以BA 配合2，4-D使用可誘導(dǎo)金銀木胚性愈傷組織，并發(fā)現(xiàn)2，4-D對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)與胚性保持影響顯著，不添加2，4-D及2，4-D質(zhì)量濃度過高或過低均不利于胚性愈傷組織誘導(dǎo)與胚性保持。龔雪琴等認(rèn)為，2，4-D和6-BA在誘導(dǎo)朱頂紅試管小鱗莖形成胚性愈傷組織和增殖繼代中起關(guān)鍵作用。而張煥玲等認(rèn)為誘導(dǎo)栓皮櫟胚性愈傷組織最適宜的激素組合是NAA與BA 配合使用。說明不同植物對(duì)激素的反應(yīng)不同。

本試驗(yàn)在誘導(dǎo)金銀木胚性愈傷組織過程中發(fā)現(xiàn)，在胚性愈傷組織誘導(dǎo)的初始階段，大多數(shù)愈傷組織細(xì)胞不具備胚性，需要幾次繼代培養(yǎng)后才逐漸分化為胚性愈傷組織。這與李爽等發(fā)現(xiàn)荔枝葉片愈傷組織需進(jìn)行繼代培養(yǎng)后才能誘導(dǎo)出胚性愈傷組織的結(jié)果相一致，可能是愈傷組織胚性化過程需要充足的養(yǎng)分和遺傳物質(zhì)積累。

同時(shí)，非胚性愈傷組織與胚性愈傷組織之間可以相互轉(zhuǎn)換，其取決于所添加的激素種類及其質(zhì)量濃度和愈傷組織本身的狀態(tài)。而非胚性細(xì)胞在生長上容易占據(jù)優(yōu)勢(shì)，因此每次繼代培養(yǎng)時(shí)需結(jié)合愈傷組織的細(xì)胞學(xué)鑒定，選擇胚性愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

本試驗(yàn)建立了金銀木松散型胚性愈傷組織誘導(dǎo)與保持體系，為金銀木大規(guī)模繁殖、體細(xì)胞離體誘變育種及遺傳轉(zhuǎn)化等研究奠定基礎(chǔ)。關(guān)于金銀木胚性愈傷組織的體細(xì)胞胚胎發(fā)生和超低溫保存等有待進(jìn)一步研究。

【參 考 文 獻(xiàn)】

鄭志勇，石進(jìn)朝，王德芳.長綠期金銀木耐寒性與葉片組織結(jié)構(gòu)的關(guān)系.華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2009，24（S1）：331-333.

ZHENG Z Y， SHI J C， WANG D F. Studies on blade tissue structure and its relations to cold resistance of Lonicera maackii ‘Changlvqi. Acta Agriculturae Boreali-Sinica， 2009， 24（S1）： 331-333.

張祺超，桂炳中，馬濤，等.華北地區(qū)金銀木蟲害綜合防治.中國花卉園藝，2018（12）：50-53.

ZHANG Q C， GUI B Z， MA T， et al. Integrated control of insect pests of Lonicera maackii in North China. China Flowers & Horticulture， 2018（12）： 50-53.

聶江力，孟令寧.金銀忍冬葉的解剖學(xué)初步研究.植物研究，2010，30（1）：126-128.

NIE J L， MENG L N. Preliminary anatomy study on leaf of Lonicera maackii. Bulletin of Botanical Research， 2010， 30（1）： 126-128.

李萍.金銀忍冬3種種質(zhì)資源超低溫保存的研究.哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2018.

LI P. Study on cryopreservation of three germplasm resources of Lonicera maackii. Harbin： Northeast Forestry University， 2018.

GAO F， PENG C X， WANG H， et al. Selection of culture conditions for callus induction and proliferation by somatic embryogenesis of Pinus koraiensis. Journal of Forestry Research， 2021， 32（2）： 483-491.

STEINER N， FARIAS-SOARES F L， SCHMIDT E C， et al. Toward establishing a morphological and ultrastructural characterization of proembryogenic masses and early somatic embryos of Araucaria angustifolia （Bert.） O. Kuntze. Protoplasma， 2016， 253（2）： 487-501.

石進(jìn)朝，陳蘭芬.長綠期金銀木的組織培養(yǎng)研究.西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，24（4）：97-100.

SHI J C， CHEN L F. Tissue culture of the Lonicera maackii ‘Changlvqi. Journal of Northwest Forestry University， 2009， 24（4）： 97-100.

石進(jìn)朝，陳蘭芬，王晶，等.變?nèi)~金銀木組織培養(yǎng)研究.中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，31（6）：116-121.

SHI J C， CHEN L F， WANG J， et al. Tissue culture of Lonicera maackii ‘Bian ye. Journal of Central South University of Forestry & Technology， 2011， 31（6）： 116-121.

左利娟，石進(jìn)朝，陳蘭芬，等.‘傲雪金銀木組培快繁技術(shù)研究.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，41（4）：701-705.

ZUO L J， SHI J C， CHEN L F， et al. Establishment of an in vitro propagation system for Lonicear macckii ‘Aoxue. Journal of Anhui Agricultural University， 2014， 41（4）： 701-705.

張健，建德鋒.金銀忍冬腋芽離體培養(yǎng)技術(shù)研究.吉林農(nóng)業(yè)，2017（1）：72-73.

ZHANG J， JIAN D F. Research on the technology of axillary buds culture for Lonicera maackii in vitro. Agriculture of Jilin， 2017（1）： 72-73.

HU M， HU Z J， DU L D， et al. Establishment of cell suspension culture of Lonicera japonica Thunb and analysis its major secondary metabolites. Industrial Crops and Products， 2019， 137： 98-104.

李群，譚韻雅，梁紅英，等.不同外源激素對(duì)灰氈毛忍冬‘渝蕾1號(hào)愈傷組織生物量生長和綠原酸含量的影響.廣西植物，2015，35（5）：692-696，655.

LI Q， TAN Y Y， LIANG H Y， et al. Effects of different exogenous hormones on chlorogenic acid content and the growth of biomass in callus of Lonicera macranthoides ‘Yulei 1. Guihaia， 2015， 35（5）： 692-696， 655.

霍俊偉，薛曉曉，秦棟，等.不同植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)藍(lán)果忍冬葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，49（6）：50-58.

HUO J W， XUE X X， QIN D， et al. Effect of different plant growth regulators on callus induction of blue honeysuckle leaves. Journal of Northeast Agricultural University， 2018， 49（6）： 50-58.

許智宏，張憲省，蘇英華，等.植物細(xì)胞全能性和再生.中國科學(xué)：生命科學(xué)，2019，49（10）：1282-1300.

XU Z H， ZHANG X S， SU Y H， et al. Plant cell totipotency and regeneration. Scientia Sinica （Vitae）， 2019， 49（10）： 1282-1300.

吳麗芳，魏曉梅，陸偉東.白刺花胚性愈傷組織誘導(dǎo)及體細(xì)胞胚發(fā)生和萌發(fā).生物技術(shù)通報(bào)，2019，35（4）：13-19.

WU L F， WEI X M， LU W D. Embryonic callus induction of Sophora davidii and their somatic embryogenesis and germination. Biotechnology Bulletin， 2019， 35（4）： 13-19.

蔣娜.灰氈毛忍冬離體快繁及愈傷組織乙醇提取物抑菌效應(yīng)的初步研究.成都：四川師范大學(xué)，2009.

JIANG N. Rapid propagation in vitro and the primary study of antifungal activity of the alcohol extract of callus from Lonicera macranthoides hand.-mazz. Chengdu： Sichuan Normal University， 2009.

唐麗蘋，李興國，張憲省，等.體細(xì)胞胚胎發(fā)生：植物體細(xì)胞命運(yùn)的重塑.植物生理學(xué)報(bào)，2020，56（8）：1664-1680.

TANG L P， LI X G， ZHANG X S， et al. Somatic embryogenesis： remodeling of plant somatic cells. Plant Physiology Journal， 2020， 56（8）： 1664-1680.

杜一鳴，鐘原，尚宏芹，等.“鳳丹”牡丹花絲愈傷組織誘導(dǎo)及分化研究.植物研究，2020，40（4）：514-522.

DU Y M， ZHONG Y， SHANG H Q， et al. Callus induction and differentiation from the filaments of Paeonia ostii ‘Feng Dan. Bulletin of Botanical Research， 2020， 40（4）： 514-522.

裘曉梅.論不同生長調(diào)節(jié)劑對(duì)蒙古櫟嫩枝扦插生根的影響.林業(yè)科技情報(bào)，2020，52（1）：14-15.

QIU X M. Effects of different growth regulators on the cutting roots of Quercus mongolica. Forestry Science and Technology Information， 2020， 52（1）： 14-15.

陳士剛，秦彩云，王聰慧，等.紅松5個(gè)家系未成熟種子的胚性愈傷組織誘導(dǎo)研究.森林工程，2021，37（1）：13-17.

CHEN S G， QIN C Y， WANG C H， et al. Embryogenic callus induction of Korean pine immature seeds from five families. Forest Engineering， 2021， 37（1）： 13-17.

龔雪琴，由翠榮，曲復(fù)寧，等.朱頂紅體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生研究.園藝學(xué)報(bào)，2012，39（2）：381-386.

GONG X Q， YOU C R， QU F N， et al. Somatic embryogenesis and plant regeneration in Hippeastrum hybridum. Acta Horticulturae Sinica， 2012， 39（2）： 381-386.

張煥玲，張存旭，賈小明.栓皮櫟胚性愈傷組織誘導(dǎo)及增殖體系的建立.西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，20（1）：74-77.

ZHANG H L， ZHANG C X， JIA X M. Embryogenic callus induction and proliferation lines construction of Quercus variabilis. Journal of Northwest Forestry University， 2005， 20（1）： 74-77.

李爽，金峰，向旭.荔枝葉片胚性愈傷組織誘導(dǎo)及其繼代增殖研究.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，48（2）：41-49.

LI S， JIN F， XIANG X. Induction of embryogenic callus and subculture proliferation of Litchi chinensis leaves. Guangdong Agricultural Sciences， 2021， 48（2）： 41-49.

許丁帆，劉艷軍，陶則滿，等.絲棉木松散型胚性愈傷組織的誘導(dǎo)與增殖.西部林業(yè)科學(xué)，2021，50（4）：74-79.

XU D F， LIU Y J， TAO Z M， et al. Induction and proliferation of loose embryogenic callus in Euonymus maackii. Journal of West China Forestry Science， 2021， 50（4）： 74-79.

陳敏敏，楊柳燕，楊貞，等.‘鳳丹白成熟胚愈傷誘導(dǎo)、增殖及組織學(xué)觀察.經(jīng)濟(jì)林研究，2021，39（1）：9-16.

CHEN M M， YANG L Y， YANG Z， et al. Callus induction， proliferation and histological observation of Paeonia ostii cv. ‘Phoenix White mature embryo. Non-Wood Forest Research， 2021， 39（1）： 9-16.