胰激肽原酶緩解心肌缺血再灌注損傷大鼠氧化應(yīng)激和纖維化

盧迎宏王 丹井海云王夢(mèng)超李智慧

(鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院心血管內(nèi)科,鄭州 450007)

心肌缺血再灌注損傷是指心肌缺血一定時(shí)間后得到正常灌注,心肌組織損傷卻呈進(jìn)行性加重的病理過程,嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致猝死[1-2]。 研究表明,心肌缺血再灌注損傷是由心肌組織細(xì)胞中大量產(chǎn)生氧自由基、鈣離心超負(fù)荷及白細(xì)胞的炎癥作用等所引起的,具體的發(fā)病機(jī)制有待進(jìn)一步研究[3]。 目前,臨床上治療心肌缺血再灌注損傷的方法主要有基因治療、缺血后適應(yīng)治療和藥物靶向治療等[4-6]。藥物靶向治療在心肌缺血再灌注損傷中的應(yīng)用已見成效,例如他汀類藥物、降糖藥、促紅細(xì)胞生成素等[7]。 胰激肽原酶(PKase)又稱胰激肽釋放酶,是哺乳動(dòng)物胰腺等器官中提取的一種蛋白水解酶,具有血管舒張、改善血液循環(huán)和微循環(huán)、防止血栓形成等作用。 已有研究報(bào)道,胰激肽原酶在糖尿病腎病中發(fā)揮抗氧化應(yīng)激、抗炎癥反應(yīng)及抗組織纖維化等重要調(diào)控作用[8-9],但胰激肽原酶在心肌缺血再灌注損傷中的作用尚不知曉。 因此,本研究通過建立心肌缺血再灌注損傷大鼠模型,探究胰激肽原酶在大鼠心肌損傷、心肌氧化應(yīng)激和纖維化中的作用,為心肌缺血再灌注損傷的臨床診斷與治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

50 只無特定病原體(SPF)級(jí)SD 大鼠,雄性,6～7 周齡,體重220～250 g。 由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(豫)2017-0001],本研究所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作完全遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理保護(hù)法及3R 原則,并經(jīng)鄭州中心醫(yī)院相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(ZXYY20200703)。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(豫)2020-0008],動(dòng)物飼養(yǎng)條件:每只大鼠給予12 h 光照/黑暗循環(huán),自由獲取水和標(biāo)準(zhǔn)飲食,(20±2)℃和(60±5)%濕度環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑與儀器

胰激肽原酶(高純,50 U/mg)購自上海源葉生物科技有限公司(貨號(hào)S10219); HE 試劑盒(C0105S)購自碧云天生物科技有限公司;大鼠肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)(ml059533)、肌紅蛋白(Mb) (ml003054)、 心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cTn-Ⅰ)(ml003145)ELISA 試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;SOD(A001-3-2)、MDA(A003-1-2)和GSH(A005-1-2)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所有限公司;Masson 染色試劑盒(G1340)、BCA 蛋白定量試劑盒(PC0020)、PT-PCR 試劑盒(RP1100)均購自北京索萊寶科技有限公司;Bax(ab32503)、Bcl-2(ab182858)、cas-9(ab184786)、cas-3(ab184786)、α-SMA (ab124964)、 TGF-β1 (ab215715) 和 FN(ab268020)兔單克隆抗體和HRP 標(biāo)記的對(duì)應(yīng)二抗均購自英國Abcam 公司。

心臟超聲診斷儀(Vivid7)購自美國GE 公司;ABI7500 Real-time PCR 系統(tǒng)(Applied Biosystems);酶標(biāo)儀(RT6100)購自深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司;臺(tái)式高速離心機(jī)(D3024R)購自大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)股份公司;成像系統(tǒng)(Tanon-1600R)購自上海天能科技有限公司,光學(xué)顯微鏡(Nikon Eclipse E100)購自日本尼康公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

50 只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、模型加藥組共5 組(n=10)。 建模:模型組和模型加藥組大鼠采用左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎法建立心肌缺血再灌注大鼠模型。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前禁食12 h,腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,隨后將大鼠仰臥位固定于實(shí)驗(yàn)板上,用4 根電極銀針支住大鼠四肢,用MS4000U-1C 型生物信號(hào)定量記錄分析系統(tǒng)檢測大鼠心電圖,氣管插管后用呼吸機(jī)輔助大鼠呼吸。在大鼠胸骨第3、4 肋骨間做開胸切口手術(shù),暴露大鼠心臟,于冠狀動(dòng)脈左前降支根部用帶線縫合針穿深度約1 mm,寬度1.8 mm 備用結(jié)扎,缺血30 min 后再灌注60 min 建立心肌缺血再灌注大鼠模型,以左室前壁紫紺及ST 段抬高,QRS 幅度升高即為手術(shù)成功,ST 段逐漸降低,左室前壁缺血區(qū)紫紺消失標(biāo)志再灌注成功,假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎。模型加藥組建模前參考文獻(xiàn)[10]分別腹腔注射1.5、3、6 U/kg 胰激肽原酶,持續(xù)給藥5 周(每天1次)。 記錄各組大鼠心率(HR)、左室收縮壓(LVSP)和短軸縮短率(FS),每組20 只。 術(shù)后12 h 收集各組大鼠尾靜脈血,然后實(shí)施安樂死,收集心臟組織用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 HE 染色觀察心肌病理損傷

取4%多聚甲醛固定的心肌組織,經(jīng)石蠟包埋切片、脫蠟、水化后,行HE 染色;光鏡下拍照并觀察記錄組織形態(tài)學(xué)變化。

1.3.3 ELISA 檢測心損標(biāo)記物含量水平

取100 μL 尾靜脈血,于3000 r/min、4℃離心15 min,取上清,按ELISA 試劑盒說明書測定各組大鼠血清中CK-MB、Mb、cTnI 含量。

1.3.4 試劑盒檢測氧化應(yīng)激指標(biāo)

經(jīng)歷了建議1和建議2的教學(xué)后，學(xué)生可能對(duì)于數(shù)線的理解還存在難度。因?yàn)橹八佑|的線段模型（如圖10）和面積模型（如圖11），都是把整條線段或整個(gè)圖形看作整體“1”，小數(shù)表示的是線段中的一小段或圖形中的一小塊。

嚴(yán)格按照SOD、MDA 和GSH 檢測試劑盒測定各組大鼠血清中SOD、MDA 和GSH 含量。

1.3.5 Western blot 檢測線粒體損傷標(biāo)記蛋白表達(dá)水平

從液氮中取出大鼠心肌組織,于室溫下解凍后用手術(shù)剪將組織剪切成小塊并置于勻漿研磨儀中研磨均勻。 用RIPA 蛋白裂解液于冰上提取總蛋白,用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白總濃度,每孔上樣20 μg,經(jīng)SDS-PAGE 電泳分離、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉后,加入一抗(1 ∶1000),4℃搖床孵育過夜,第2 天回收一抗并加入HRP 標(biāo)記的對(duì)應(yīng)二抗(1 ∶5000),室溫孵育2 h。 用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑于暗室下曝光顯影,將膠片掃描存檔整理去色后,分析并計(jì)算各組大鼠蛋白相對(duì)表達(dá)量,蛋白相對(duì)表達(dá)量為目標(biāo)條帶和內(nèi)參條帶(ACTIN)比值表示。 獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次取平均值。

1.3.6 Masson 染色觀察心肌組織纖維化程度

取4%多聚甲醛固定的心肌組織,按照Masson試劑盒說明書進(jìn)行大鼠心肌組織Masson 染色。 藍(lán)色代表膠原纖維,紅色代表肌纖維。

1.3.7 RT-PCR 檢測α-SMA、TGF-β1 和FN mRNA表達(dá)水平

取液氮中保存的大鼠心肌組織約80 mg,溫室下解凍組織,超聲研磨均勻后在4℃、3000 r/min 條件下離心15 min,用TRIzol 試劑盒提取總RNA 并測定RNA 濃度和純度。 按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,按RT-PCR 試劑盒操作說明配制反應(yīng)體系。 在PCR 擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增(擴(kuò)增條件:保持步驟96℃15 s,40 個(gè)周期,95℃10 s 和60℃30 s),以目的基因和內(nèi)參比值表示mRNA 表達(dá)水平,采用2-△△CT法分析結(jié)果。 重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次,結(jié)果取平均值。 引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 19.0 軟件分析,數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)。 采用單因素方差進(jìn)行組間比較,若方差齊則兩兩比較采用LSD 法,若方差不齊則兩兩比較采用Dunnett-t法。 以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胰激肽原酶對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠HR、LVSP 和FS 的影響

注:a:假手術(shù)組;b:模型組;c:模型+1.5 U/kg PKase 組;d:模型+3 U/kg PKase 組;e:模型+6 U/kg PKase 組。 與假手術(shù)組相比,*P＜0.05;與模型組相比,#P＜0.05。

2.2 胰激肽原酶對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌病理損傷的影響

HE 染色觀察各組大鼠心肌組織病理損傷程度,如圖2 所示,假手術(shù)組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)正常,排列規(guī)則,未見炎性細(xì)胞浸潤。 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)紊亂,心肌細(xì)胞腫大,可見大量肌纖維斷裂和炎性細(xì)胞浸潤。 與模型組比較,1.5 U/kg PKase 組仍然可見大量斷裂的心肌纖維和炎性細(xì)胞浸潤,3 U/kg PKase 組大鼠心肌細(xì)胞中可見少量炎性細(xì)胞浸潤,未見斷裂的心肌纖維和水腫變性的心肌細(xì)胞。 6 U/kg PKase 組大鼠心肌組織排列規(guī)則,僅見極少的炎性細(xì)胞浸潤,未見斷裂的心肌纖維和腫脹變性的心肌細(xì)胞。 結(jié)果提示,胰激肽原酶改善心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織病理損傷。

注:心肌纖維被染成淡紅色,細(xì)胞核呈藍(lán)紫色,黑色箭頭表示炎性浸潤細(xì)胞,綠色箭頭表示斷裂纖維。

2.3 胰激肽原酶對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠心損標(biāo)記物含量的影響

ELISA 檢測各組大鼠心損標(biāo)記物CK-MB、Mb和cTnI 含量(見表2),與假手術(shù)組比較,模型組大鼠CK-MB、Mb 和cTnI 含量顯著升高(P＜0.05)。 與模型組比較,1.5 U/kg PKase 組大鼠CK-MB、Mb 和cTnI 含量無明顯變化(P＞0.05),3、6 U/kg PKase 組大鼠CK-MB、Mb 和cTnI 含量顯著降低(P＜0.05)。結(jié)果提示,胰激肽原酶能夠改善心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌功能。

表2 各組大鼠CK-MB、Mb 和cTnI 含量(ˉx±s,n=10)Table 2 Contents of CK-MB, Mb and cTnI in each group of rats

2.4 胰激肽原酶對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠氧化應(yīng)激水平的影響

與假手術(shù)組比較,模型組大鼠血清中SOD 和GSH 含量明顯降低,MDA 含量升高(P＜0.05)。 與模型組比較,1.5 U/kg PKase 組大鼠血清中SOD、MDA 和GSH 含量無明顯差異(P＞0.05),3、6 U/kg PKase 組大鼠血清中SOD 和GSH 含量升高,MDA含量降低,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),見圖3。 結(jié)果提示,胰激肽原酶能夠緩解心肌缺血再灌注損傷大鼠氧化應(yīng)激水平。

注:a:假手術(shù)組;b:模型組;c:模型+1.5 U/kg PKase 組;d:模型+3 U/kg PKase 組;e:模型+6 U/kg PKase 組。 與假手術(shù)組相比,*P＜0.05;與模型組相比,#P＜0.05。

2.5 胰激肽原酶對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠線粒體功能的影響

與假手術(shù)組比較,模型組大鼠心肌組織中Bax/Bcl-2、cleaved cas9/cas9 和cleaved cas3/cas3 蛋白水平顯著升高(P＜0.05)。 與模型組比較,1.5 U/kg PKase 組大鼠心肌組織中蛋白水平無明顯差異(P＞0.05),3、6 U/kg PKase 組大鼠心肌組織中Bax/Bcl-2、cleaved cas9/cas9 和cleaved cas3/cas3 蛋白水平顯著降低(P＜0.05),見圖4。 結(jié)果提示,胰激肽原酶能夠緩解心肌缺血再灌注損傷大鼠線粒體功能損傷。

注:A:Western blot 檢測線粒體損傷標(biāo)記物蛋白表達(dá);B:蛋白相對(duì)表達(dá)量。 與假手術(shù)組相比,*P＜0.05;與模型組相比,#P＜0.05。

2.6 胰激肽原酶對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌纖維和炎癥因子的影響

如圖5 所示,假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊,染色均勻,未見炎癥細(xì)胞浸潤且間質(zhì)內(nèi)無增生纖維。 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂,間質(zhì)內(nèi)充滿大量、均勻的藍(lán)色纖維網(wǎng),部分纖維斷裂,可見炎癥細(xì)胞浸潤。 與模型組大鼠比較,1.5 U/kg PKase 組大鼠仍可見大量炎癥細(xì)胞浸潤,間質(zhì)內(nèi)藍(lán)色纖維網(wǎng)稍有減輕。 3 U/kg PKase 組增生的藍(lán)色纖維網(wǎng)明顯減少,可見少量炎癥細(xì)胞浸潤,6 U/kg PKase 組大鼠間質(zhì)內(nèi)增生的藍(lán)色纖維網(wǎng)顯著減少或消失,僅可見極少的纖維條,心肌細(xì)胞中未見炎性細(xì)胞浸潤。 結(jié)果提示,胰激肽原酶能夠改善心肌缺血再灌注大鼠心肌纖維化。

注:心肌纖維被染成紅色,膠原纖維被染成藍(lán)色,黑色箭頭表示炎性浸潤,綠色箭頭表示膠原纖維。

2.7 胰激肽原酶對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠纖維化標(biāo)記蛋白水平的影響

與假手術(shù)組相比,模型組大鼠心肌組織中α-SMA、TGF-β1 和FN mRNA 和蛋白水平均顯著上調(diào)(P＜0.05)。 與模型組比較,1.5 U/kg PKase 組大鼠α-SMA、TGF-β1 和FN 在mRNA 和蛋白水平均無明顯差異(P＞0.05),3、6 U/kg PKase 組大鼠心肌組織中α-SMA、TGF-β1 和FN mRNA 和蛋白水平均顯著下調(diào)(P＜0.05),見圖6。 結(jié)果提示,胰激肽原酶能夠緩解心肌缺血再灌注大鼠心肌組織纖維化。

注:A:RT-PCR 檢測α-SMA、TGF-β1 和FN mRNA 水平;B:Western blot 檢測α-SMA、 TGF-β1 和FN 蛋白水平;C:蛋白相對(duì)表達(dá)量。 與假手術(shù)組相比,*P＜0.05;與模型組相比,#P＜0.05。

3 討論

心肌缺血再灌注發(fā)生前會(huì)產(chǎn)生大量的氧自由基,從而引起心肌纖維化和心肌損傷,心臟功能障礙等[11]。 因此,及時(shí)清除氧自由基和降低心肌纖維水平能夠有效緩解心肌損傷和心臟功能。 Xie 等[12]發(fā)現(xiàn),心肌缺血再灌注大鼠血清CK-MB、Mb 和cTnI水平明顯升高,α-SMA、TGF-β1 和FN 含量極高,SOD 和GSH 含量降低,MDA 含量升高,經(jīng)給藥治療后,心肌缺血再灌注大鼠心肌損傷明顯好轉(zhuǎn),氧化應(yīng)激和炎癥水平降低,纖維化程度得到改善。 本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)胰激肽原酶給藥治療后,心肌缺血再灌注大鼠心臟功能明顯好轉(zhuǎn),心肌病理損傷得到改善,心肌氧化應(yīng)激、纖維化水平降低。 因此,胰激肽原酶通過降低心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌氧化應(yīng)激和纖維化水平緩解大鼠心肌損傷。

本研究前期檢測了各組大鼠心臟功能、心肌病理損傷程度和心肌損傷標(biāo)記物含量水平,結(jié)果顯示,模型組大鼠HR、LVSP、FS 明顯低下,心肌病理損傷嚴(yán)重,CK-MB、Mb 和cTnI 含量極高。 經(jīng)胰激肽原酶給藥治療后,心肌缺血再灌注損傷模型大鼠心臟功能顯著得到改善,心肌病理損傷及損傷標(biāo)記物含量減少。 結(jié)果提示,胰激肽原酶對(duì)心肌缺血再灌注大鼠心臟功能、心肌損傷具有調(diào)控作用。 為明確胰激肽原酶調(diào)控模型大鼠心肌功能的作用機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)還檢測了各組大鼠心肌組織中氧化應(yīng)激和纖維化水平。

氧化應(yīng)激發(fā)生積累的大量氧自由基促使心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌細(xì)胞膜通透性增加,從而使得胞內(nèi)的SOD 釋放到細(xì)胞外。 同時(shí),MDA 含量增加誘發(fā)機(jī)體發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng),最終破壞機(jī)體正常的氧化與抗氧化平衡狀態(tài),進(jìn)一步加重心肌缺血再灌注大鼠心肌損傷[13-17]。 本實(shí)驗(yàn)顯示,在模型組大鼠心肌組織中SOD 和GSH 含量明顯降低,MDA 含量升高,經(jīng)胰激肽原酶治療后,心肌缺血再灌注大鼠心肌組織中SOD 和GSH 含量顯著升高,MDA 含量降低。 由于線粒體功能與氧化應(yīng)激密切相關(guān),若氧化應(yīng)激水平極高,則會(huì)導(dǎo)致線粒體膜通透性增加及氧自由基的大量產(chǎn)生,使得線粒體腫脹、功能受損、細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載,最終引起細(xì)胞死亡[18-20]。 因此,線粒體損傷程度能夠從側(cè)面反應(yīng)機(jī)體氧化應(yīng)激水平及正常組織功能。 本研究通過檢測各組大鼠線粒體損傷標(biāo)記物蛋白表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)胰激肽原酶給藥治療后,心肌缺血再灌注大鼠心肌組織中Bax/Bcl-2、cas-9、cas-3 水平顯著降低,結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,胰激肽原酶可能通過調(diào)控模型大鼠心肌氧化應(yīng)激水平改善大鼠心臟和線粒體功能,緩解心肌病理損傷。

α-SMA 是血管平滑肌細(xì)胞中的一種細(xì)胞骨架蛋白,與心肌細(xì)胞纖維化的發(fā)生發(fā)展有關(guān),是肌成纖維細(xì)胞的特異性標(biāo)志物[21]。 TGF-β1 是新發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的TGF-β 超家族,具有抑制心肌細(xì)胞分化的作用[22]。 FN 是是心肌細(xì)胞外基質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一,在心肌細(xì)胞粘附性和運(yùn)動(dòng)能力中發(fā)揮著重要作用[23]。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)胰激肽原酶治療后,心肌缺血再灌注大鼠心肌組織中α-SMA、TGF-β1 和FN 表達(dá)水平顯著降低,結(jié)果提示,胰激肽原酶通過降低心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織纖維化水平緩解大鼠心肌損傷。

綜上所述,胰激肽原酶在心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌損傷、氧化應(yīng)激和纖維化中具有調(diào)控作用。 本實(shí)驗(yàn)從動(dòng)物水平上初步說明胰激肽原酶在心肌缺血再灌注損傷中的調(diào)節(jié)作用,后續(xù)實(shí)驗(yàn)我們計(jì)劃進(jìn)一步探究胰激肽原酶的具體調(diào)節(jié)作用機(jī)制,為胰激肽原酶的臨床應(yīng)用及藥物研發(fā)提供更加充分的理論依據(jù)。