李丹 周鳴鳴 何正義 吳趙曼秋 宋紹征

摘要：【目的】探究同源臂長度對CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)人乳鐵蛋白基因（hLF）打靶山羊β-乳球蛋白基因（BLG）座位點效率的影響，為今后體細胞核移植制備BLG -/hLF +基因打靶山羊提供科學(xué)依據(jù)，也為CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)介導(dǎo)BLG基因或其他基因座位點定向精準(zhǔn)分子修飾的遺傳育種提供借鑒?！痉椒ā酷槍ι窖駼LG基因第一外顯子區(qū)域設(shè)計構(gòu)建sgBLG/Cas9載體，電轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細胞，PCR驗證BLG基因座位點致突變活性;以BLC14乳腺特異性表達載體為基礎(chǔ)構(gòu)建3種同源臂長度（6.0、3.5和1.2 kb）的hLF基因打靶載體，分別與sgBLG/Cas9載體共轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細胞，經(jīng)500 μg/mL G418篩選后，采用PCR檢測基因打靶情況?！窘Y(jié)果】sgBLG/Cas9載體在山羊胎兒成纖維細胞BLG基因座附近切割DNA雙鏈的致突變活性效率在30%～35%。構(gòu)建獲得3種同源臂長度的hLF基因打靶載體（BLC14-1、BLC14-2和BLC14-3），對應(yīng)的同源臂長度分別為6.0、3.5和1.2 kb;將3種hLF基因打靶載體與sgBLG/Cas9載體共轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細胞，經(jīng)5次電轉(zhuǎn)染和G418篩選，分別獲得83、77和86株藥物抗性細胞，經(jīng)PCR同源重組檢測最終獲得42、38和44株BLG -/hLF +基因打靶細胞株，即hLF基因在山羊胎兒成纖維細胞BLG基因座的平均打靶效率分別為50.6%（42/83）、49.4%（38/77）和51.2%（44/86）。3種不同長度同源臂構(gòu)建的hLF基因打靶載體在山羊BLG基因座位點的打靶效率在統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異（P>0.05），表明同源臂長度對CRISPR/Cas9介導(dǎo)hLF基因打靶山羊BLG基因座位點無顯著影響?！窘Y(jié)論】利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)hLF基因打靶山羊胎兒成纖維細胞BLG基因座位點能成功獲得多株hLF +/BLG -基因打靶細胞株（BLG基因座定點打靶hLF基因），但打靶載體同源臂長度對CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)BLG位點定向整合hLF基因的打靶效率無明顯影響。

關(guān)鍵詞： 山羊;CRISPR/Cas9;基因打靶;同源臂長度;β-乳球蛋白基因（BLG）;人乳鐵蛋白基因（hLF）

中圖分類號： S814.8? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2022）01-0182-09

Effects of homologous arm length on the efficiency of CRISPR/Cas9 mediated hLF gene knock-in at goat β-lactoglobulin locus

LI Dan1， ZHOU Ming-ming1， HE Zheng-yi2， WU Zhao-man-qiu1， SONG Shao-zheng1*

（1Department of Basic Medicine， School of Health and Nursing， Wuxi Taihu University， Wuxi， Jiangsu? 214000， China; 2College of Veterinary Medicine， Yangzhou University/Jiangsu Provincial Research Center for Animal

Transgenesis and Biopharming，? Yangzhou ， Jiangsu? 225009， China）

Abstract：【Objective】To explore the effect of homology arm length on the efficiency of CRISPR/Cas9 system-me-diated human lactoferrin gene （hLF） targeting goat β-lactoglobulin gene （BLG） locus， and to provide a scientific basis for the preparation of BLG -/hLF + gene target cells by somatic cell nuclear transfer in the future. It also provided a reference for genetic breeding of BLG gene or other gene locus directed by precise molecular modification mediated by CRISPR/Cas9 gene editing system. 【Method】According to the first exon region of the goat BLG gene， the sgBLG/Cas9 vector was designed and constructed， and it was electrotransfected goat fetal fibroblasts. The site-mutagenic activity of the BLG gene locus was verified by PCR. Based on BLC14 mammary gland-specific expression vector， three hLF gene targeting vectors with homology arm length （6.0， 3.5 and 1.2 kb） were constructed， and it was cotransfected into goat fetal fibroblasts with sgBLG/Cas9 vector respectively. After 500 μg/mL G418 screening， the gene targeting was detected by PCR. 【Result】The mutagenic activity efficiency of cleaving DNA double strands with BLG locus in goat fetal fibroblasts was 30%-35% by sgBLG/Cas9 vector. The hLF gene targeting vectors （BLC14-1， BLC14-2 and BLC14-3） were constructed to obtain three homology arm lengths， corresponding to 6.0， 3.5 and 1.2 kb. Three hLF gene targeting vectors and sgBLG/Cas9 vector were cotransfected into goat fetal fibroblasts. After 5 times of electrotransfections and G418 screening， 83， 77 and 86 drug-resistant cells were obtained respectively. Finally， 42， 38 and 44 BLG -/hLF + gene targeting cell lines were obtained by PCR homologous recombination detection. The average targeting efficiencies of hLF gene at the BLG locus of goat fetal fibroblasts were 50.6% （42/83）， 49.4 % （38/77） and 51.2% （44/86）. There was no statistically significant difference in the targeting efficiency of hLF gene targeting vectors constructed with three different lengths of homology arms at the BLG gene locus in goats （P>0.05）， indicating that the homology arm length had no significant effect on CRISPR/Cas9-mediated hLF gene targeting at the BLG gene locus in goats. 【Conclusion】A number of BLG -/hLF + gene targeting cell lines（BLG loci for site-directed target hLF genes） have been successfully obtained by CRISPR/Cas9 system-mediated hLF gene targeting at BLG gene locus in goat fetal fibroblasts. However， the length of the homology arm of the targeting vector has no significant effect on the targeting efficiency of the CRISPR/Cas9 system-mediated BLG site-directed integration of the hLF gene.

Key words： goat; CRISPR/Cas9; gene targeting; homology arm length; β-lactoglobulin gene（BLG）; human lactoferrin gene（hLF）

Foundation items： National Key Research and Development Program of China（2016YFE0126000）;Science and Technology Project of Jiangxi Provincial Health Commission（202130627）;Natural Science Foundation of Colleges and Universities in Jiangsu （19KJB180030）;Excellent Young Backbone Teacher Project of “Qinglan Project” in Colleges and Universities of Jiangsu （Sujiaoshihan〔2021〕11）

0 引言

【研究意義】基因打靶是指利用同源重組的原理，通過精準(zhǔn)的堿基插入、缺失或突變等方式改變生物體基因組中的某一特定基因，從而實現(xiàn)對生物遺傳信息的定向改造（Dever et al.，2016）。CRISPR/Cas9是繼人工鋅指核酸酶（ZFNs）和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（TALENs）之后新興起的一種基因打靶編輯技術(shù)，主要由sgRNA序列引導(dǎo)Cas9蛋白核酸酶識別切割特異性DNA，使其雙鏈斷裂引發(fā)同源重組或非同源末端連接機制進行修復(fù)（Grunwald et al.，2019;朱麗穎等，2020;王妍鱈等，2021），具有編輯效率高、精準(zhǔn)性高、構(gòu)建序列簡單等特點，已廣泛應(yīng)用于功能基因?qū)W、人類疾病動物模型及畜禽遺傳育種改良等研究領(lǐng)域（Kleinstiver et al.，2016;Zhou et al.，2017;劉雷雷等，2019;Char et al.，2020）。因此，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)在山羊β-乳球蛋白（BLG）基因座位點打靶人乳鐵蛋白（hLF）基因，可在敲除羊乳中致敏原BLG基因的同時插入hLF基因，有望實現(xiàn)羊乳人源化改造（Oliveira et al.，2019），有效提高羊乳品質(zhì)，使其更具營養(yǎng)價值?！厩叭搜芯窟M展】以體細胞核移植和基因編輯為基礎(chǔ)的家畜基因打靶技術(shù)在轉(zhuǎn)基因新品種培育中具有重要意義，以動物體細胞為宿主細胞，打靶載體進入細胞核內(nèi)，載體的同源序列與宿主基因組序列發(fā)生同源重組，進而完成基因的插入或敲除。為了便于同源重組檢測，打靶載體通常包含長、短兩個同源臂，在傳統(tǒng)的基因打靶中同源臂長度是影響基因同源重組效率的關(guān)鍵因素（Shulman et al.，1990）。Shulman等（1990）研究發(fā)現(xiàn)，基因打靶效率隨著同源臂長度的增加而呈現(xiàn)指數(shù)性增長，且同源臂序列最長可達14 kb;Thomas等（1992）研究表明，當(dāng)同源臂長度低于1 kb時，會導(dǎo)致接頭區(qū)重組的保真度降低;McCreath等（2000）通過基因打靶技術(shù)在綿羊COL1A1基因3'非翻譯區(qū)引入hAAT基因，是最早的家畜基因打靶研究案例。隨后，Shen等（2007）成功在山羊胎兒成纖維細胞中敲除β-酪蛋白基因，以期獲得低致敏原性的轉(zhuǎn)基因山羊新品系;王向鵬等（2012）利用正負篩選策略，通過構(gòu)建2種不同長度（1.9和5.7 kb）的同源臂，成功獲得基因打靶細胞株;劉婉霞等（2015）利用TALENs與多位點打靶載體設(shè)計，在293T細胞中進行高效基因打靶;Zhu等（2016）利用TALENs介導(dǎo)山羊BLG基因座定點打靶人α-乳清白蛋白基因，構(gòu)建獲得可用于轉(zhuǎn)基因動物研究的打靶細胞系;Hryhorowicz等（2017）研究證實CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可介導(dǎo)動物基因打靶，從而引入不同的外源打靶載體基因;廣璐等（2019）利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)hFAD3基因在牛胎兒成纖維細胞中開展基因打靶研究，通過構(gòu)建5'和3'端不同長度的同源臂高效率獲得中靶細胞株;王文文等（2020）基于CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)分別構(gòu)建多個不同的MUC4和SLC12A8基因敲除載體，并探究不同載體的打靶效率。【本研究切入點】近年來，已有研究利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)分別在山羊成纖維細胞的β-酪蛋白和BLG基因位點進行打靶（劉暢，2016;Zhou et al.，2017），為羊乳人源化改造的分子遺傳育種奠定了基礎(chǔ)，但有關(guān)同源臂長度對CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)山羊基因打靶效率的相關(guān)研究國內(nèi)外鮮見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】構(gòu)建3種不同同源臂長度的hLF基因打靶載體，利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)介導(dǎo)在山羊胎兒成纖維細胞的BLG基因座位點打靶hLF基因，探究同源臂長度對打靶效率的影響，為今后體細胞核移植制備BLG -/hLF +基因打靶細胞株提供科學(xué)依據(jù)，也為CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)介導(dǎo)BLG基因或其他基因座位點定向精準(zhǔn)分子修飾的遺傳育種提供借鑒。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

妊娠30～35日齡的薩能奶山羊由揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院提供，常規(guī)飼養(yǎng)于揚州大學(xué)農(nóng)牧實驗場。CRISPR/Cas9二合一質(zhì)粒構(gòu)建試劑盒（AxyPrep PCR Clea-nup Kit，AP-PCR-250）購自南京堯順禹生物科技有限公司，BLC14質(zhì)粒和菌種（哺乳動物乳腺特異性表達載體含山羊BLG基因5'端調(diào)控序列、山羊BLG基因3'端調(diào)控序列、hLF基因cDNA序列、NEO基因及CMV基因增強子，已通過小鼠、兔和山羊細胞進行表達驗證）（An et al.，2012;Cheng et al.，2012）及大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α感受態(tài)細胞均由揚州大學(xué)江蘇省轉(zhuǎn)基因動物制藥工程研究中心保存提供;Trypsin（Amresco，0458）、DMEM/F12（Hyclone，D2906）、FBS（Hyclone，SH30070.03）、G418（Amesco，0344）、青鏈霉素（Sigma，J091911）及DNA膠回收純化試劑盒購自QIAGEN公司;DNA聚合酶、連接酶及各種限制性內(nèi)切酶購自寶生物工程（大連）有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純，購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1. 2 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank已公布的山羊BLG基因序列和hLF基因序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計4對不同的擴增引物序列（表1），所有PCR引物均委托上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1. 3 sgRNA設(shè)計及sgBLG/Cas9載體和hLF基因打靶載體構(gòu)建

根據(jù)山羊BLG基因座（Z33881.1，8088 bp）第一外顯子序列設(shè)計sgRNA，使用gRNA（https：//zlab.bio/ guide-design-resources）設(shè)計sgRNA引導(dǎo)序列（長度為22 nt），靶位點序列為GTGCCCCCACTTCTGGGGT CTA，通過酶切、連接及轉(zhuǎn)化等常規(guī)分子生物學(xué)方法構(gòu)建表達載體，并命名為sgBLG/Cas9。以山羊基因組DNA為模板，PCR擴增不同長度的同源臂;以BLC14乳腺特異性表達載體為基礎(chǔ)，通過常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建3種不同同源臂長度的hLF基因打靶載體，分別命名為BLC14-1、BLC14-2和BLC14-3。

1. 4 山羊胎兒成纖維細胞分離培養(yǎng)

通過無菌剖宮產(chǎn)手術(shù)獲取35日齡山羊胎兒，置于潔凈培養(yǎng)平皿內(nèi)，以D-Hank’s緩沖液洗滌3次;去除四肢、內(nèi)臟和頭部后，剪碎剩余組織（約1 mm3），經(jīng)D-Hank’s緩沖液洗滌3次后，置于潔凈離心管內(nèi)。添加5 mL消化液（0.05%胰酶+0.04% EDTA-Na2），使用移液管反復(fù)吹打消化直至渾濁液完全產(chǎn)生后靜置2 min，移液管吸取上層渾濁液置于另一潔凈離心管內(nèi);1500×g離心5 min，D-Hank’s緩沖液重懸洗滌，重復(fù)2次，添加DMEM/F12+10% FBS細胞培養(yǎng)液重懸細胞，并調(diào)整密度為5×105個/mL（細胞計數(shù)板）;然后接種于6孔細胞板內(nèi)，置于CO2培養(yǎng)箱（37 ℃，5% CO2，飽和濕度）中靜置培養(yǎng)，隔天換液。上述未完全消化的剩余組織塊繼續(xù)重復(fù)消化1次，收集細胞。

1. 5 CRISPR/Cas9編輯山羊BLG基因位點致突變活性檢測

收集生長匯合度約80%的山羊胎兒成纖維細胞，電轉(zhuǎn)染液重懸細胞并調(diào)整密度至1×106個/mL，sgBLG/Cas9質(zhì)粒經(jīng)回收純化后調(diào)整終濃度至20 μg/mL，然后與細胞懸液混合進行電轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染條件：2 mm間隙電極杯，2.0 kV/cm、250 μs，電擊2次，靜置5 min。使用DMEM/F12+10% FBS培養(yǎng)液輕輕混勻轉(zhuǎn)染后的細胞，接種至6孔細胞板內(nèi)，置于CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)（37 ℃，5% CO2，飽和濕度），48 h后換液。同時設(shè)未轉(zhuǎn)染的正常細胞為陰性對照。待細胞生長匯合度至50%～60%時，胰蛋白酶消化收集細胞，提取基因組DNA，以sg-F/sg-R為引物（表1）PCR檢測靶標(biāo)區(qū)域，并對擴增產(chǎn)物進行測序，比對峰圖突變情況。

1. 6 CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)hLF基因打靶載體的轉(zhuǎn)染與篩選

hLF基因打靶載體經(jīng)Sal I/Not I雙酶切線性化處理后，與純化的sgBLG/Cas9質(zhì)粒混合進行電轉(zhuǎn)染，基因終濃度均為20 μg/mL，電轉(zhuǎn)染方法與條件同1.5。48 h后添加500 μg/mL G418進行篩選，每隔48 h換1次液。同時設(shè)未經(jīng)轉(zhuǎn)染的正常山羊胎兒成纖維細胞為陰性對照。連續(xù)篩選培養(yǎng)10～14 d后，當(dāng)陰性對照組細胞全部死亡時，換成正常培養(yǎng)液（DMEM/F12+10% FBS），挑取單克隆細胞株接種于48孔細胞板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，72 h后傳代于12孔細胞板內(nèi)進行擴大培養(yǎng)。

1. 7 BLG-/hLF+基因打靶細胞株檢測與凍存

待細胞生長匯合度為80%～90%時，收集部分細胞，提取細胞基因組DNA用于PCR檢測，以hLF-F/hLF-R為引物對hLF基因進行整合檢測，以5'-BLG-F/5'-BLG-R為引物對5'端靶位點同源重組進行檢測，以3'-BLG-F/3'-BLG-R位引物對3'端靶位點同源重組進行檢測。剩余細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，使用DMEM/F12+10% DMSO+20% FBS凍存液進行稀釋，液氮速凍保存。

1. 8 統(tǒng)計分析

采用SPSS 22.0對獲得的BLG -/hLF +基因打靶細胞株進行統(tǒng)計分析，比較3種不同長度同源臂打靶載體對基因打靶效率的影響。P >0.05時表明同源臂長度對基因打靶無顯著影響，P<0.05時表明同源臂長度對基因打靶有顯著影響。

2 結(jié)果與分析

2. 1 sgBLG/Cas9載體與hLF基因打靶載體構(gòu)建情況

針對山羊BLG基因座設(shè)計構(gòu)建的sgBLG/Cas9載體靶標(biāo)位點位于第一外顯子區(qū)域，如圖1所示。在BLC14載體的基礎(chǔ)上，根據(jù)山羊BLG基因組序列，經(jīng)PCR擴增、酶切、連接及轉(zhuǎn)化等分子生物學(xué)方法構(gòu)建3種不同長度的同源臂作為打靶載體同源重組（表2），同源臂長度分別為6.0 kb（BLC14-1，5'端長臂4.0 kb+3'端短臂2.0 kb）、3.5 kb（BLC14-2，5'端長臂2.4 kb+3'端短臂1.1 kb）、1.2 kb（BLC14-3，5'端長臂0.7 kb+3'端短臂0.5 kb），其打靶載體結(jié)構(gòu)如圖1所示。

2. 2 山羊胎兒成纖維細胞的培養(yǎng)形態(tài)特征

經(jīng)胰蛋白酶消化法（0.05%胰酶+0.04% EDTA-Na2）體外分離獲得的山羊胎兒成纖維細胞屬于一種貼壁細胞，光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)較小，典型的成纖維細胞呈細長條狀、梭形或不規(guī)則形狀。經(jīng)傳代培養(yǎng)，細胞生長匯合度為80%～90%時，細胞形成集落，細胞群呈渦旋狀、火焰狀或放射狀排列，偶爾可見細胞群內(nèi)有部分白色集落存在，如圖2所示。

2. 3 CRISPR/Cas9編輯山羊胎兒成纖維細胞BLG基因座位點活性檢測結(jié)果

sgBLG/Cas9載體經(jīng)純化回收后，電轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細胞，收集細胞后提取基因組DNA進行PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)測序峰圖驗證突變情況，若峰圖出現(xiàn)重疊的套峰，則表明該細胞系發(fā)生一定程度的突變，且根據(jù)重疊套峰面積所占比例可初步判斷致突變活性（圖3）。從圖3中箭頭所指處開始出現(xiàn)重疊套峰，即此處開始出現(xiàn)突變（山羊BLG基因座第一外顯子中C堿基為sgBLG/Cas9特異性識別位點）。根據(jù)對重疊套峰面積的分析，可初步判斷sgBLG/Cas9載體在山羊胎兒成纖維細胞BLG基因座附近切割DNA雙鏈的致突變活性效率在30%～35%。

2. 4 hLF基因打靶細胞系構(gòu)建及其效率分析結(jié)果

在相同的條件下，分別將3種hLF基因打靶載體（BLC14-1、BLC14-2和BLC14-3）與sgBLG/Cas9載體共轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細胞，每個打靶載體轉(zhuǎn)染5次，每次使用不同細胞系（5個細胞系轉(zhuǎn)染），每次轉(zhuǎn)染細胞數(shù)為1×106個。以hLF-F/hLF-R為引物對hLF基因進行整合檢測，PCR擴增產(chǎn)物長度為470 bp（圖4-A）;以3'-BLG-F/3'-BLG-R為引物對hLF轉(zhuǎn)基因細胞株進行3'端同源重組檢測，PCR擴增產(chǎn)物長度為2402 bp（圖4-B）;以5'-BLG-F/5'-BLG-R為引物對hLF轉(zhuǎn)基因細胞株進行5'端同源重組檢測，PCR擴增產(chǎn)物長度為4708 bp（圖4-C）。BLC14-1、BLC14-2和BLC14-3等3種hLF基因打靶載體（同源臂長度分別為6.0、3.5和1.2 kb）經(jīng)5次電轉(zhuǎn)染和G418篩選，分別獲得83、77和86株藥物抗性細胞株（表2）。其中，經(jīng)PCR整合檢測分別有76、72和80株hLF轉(zhuǎn)基因細胞株，經(jīng)PCR同源重組檢測發(fā)現(xiàn)有42、38和44株為BLG -/hLF +基因打靶細胞株，hLF基因在山羊胎兒成纖維細胞BLG基因座的平均打靶效率分別為50.6%（42/83）、49.4%（38/77）和51.2%（44/86）。SPSS 22.0統(tǒng)計分析結(jié)果（圖5）顯示，3種不同長度同源臂構(gòu)建的hLF基因打靶載體在山羊BLG基因座位點的打靶效率在統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異（P>0.05），表明同源臂長度對CRISPR/Cas9介導(dǎo)hLF基因在山羊BLG基因座附近的平均打靶效率無顯著影響。

3 討論

自20世紀(jì)初通過基因打靶和體細胞核移植技術(shù)成功獲得多種基因打靶家畜以來，關(guān)于基因打靶的研究報道從未間斷（Becher et al.，2018）?；虼虬惺歉鶕?jù)同源重組的原理，通過外源DNA與宿主染色體DNA的同源序列發(fā)生重組，從而將外源基因精準(zhǔn)定點整合至宿主基因組上的特定位置，實現(xiàn)對生物體基因組定點精確修飾及改造的目的（Zhou et al.，2017），現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥蛋白生產(chǎn)、器官移植、生物醫(yī)學(xué)研究及動物品種改良分子遺傳育種等領(lǐng)域。在家畜遺傳育種方面，通過基因打靶技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因動物能實現(xiàn)短期內(nèi)改造動物生產(chǎn)性能，賦予動物優(yōu)良的性狀，且外源基因的整合與表達不受宿主基因的“位置效應(yīng)”影響，也不會干擾宿主其他基因的正常生理功能，具有遺傳穩(wěn)定、背景清楚等優(yōu)點，更有利于轉(zhuǎn)基因新品種的培育（Kim et al.，2016）?；虼虬屑夹g(shù)歷經(jīng)了構(gòu)建長同源臂、ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas9等幾代的發(fā)展，尤其是近年來CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的生物體基因組編輯，主要是利用單鏈引導(dǎo)序列sgRNA與Cas9核酸內(nèi)切酶復(fù)合物，特異性切割斷裂基因組DNA雙鏈的特定位點，有效誘導(dǎo)同源重組或非同源末端連接機制進行修復(fù)，從而實現(xiàn)對生物體基因組定向精準(zhǔn)編輯（黃娟等，2018;Grunwald et al.，2019）。本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)hLF基因打靶山羊BLG基因座位點，成功獲得多株BLG -/hLF +基因打靶細胞株。

隨著生活水平的不斷提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，人們對食用乳品的要求也越來越高（Sackesen et al.，2011）。BLG是牛乳和羊乳中主要的致敏原，可引起哮喘、嘔吐及腹瀉等過敏癥狀（Ehn et al.，2005;Oliveira et al.，2019;Varlamova and Zaripov，2020）。hLF是人乳中的主要乳清蛋白，具有抗菌、抗癌及增強免疫力等生物學(xué)活性，是理想的乳品添加劑（Wang et al.，2019;Shao et al.，2020）。由于山羊乳成分最接近于人乳，因此對山羊乳進行人源化改造，去除致敏原BLG基因的同時添加功能營養(yǎng)蛋白基因，賦予其人乳的特征，是一種理想的選擇。本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)在山羊BLG基因座位點打靶hLF基因，能有效去除致敏原BLG并增加功能營養(yǎng)成分hLF，使山羊乳具有更高的營養(yǎng)價值和生物學(xué)功能。至今，已有關(guān)于CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)山羊乳蛋白基因編輯的研究報道。劉暢（2016）應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)在山羊胎兒成纖維細胞β-酪蛋白基因第二外顯子序列中進行打靶，其打靶效率為74.29%;Zhou等（2017）利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)山羊耳成纖維細胞BLG基因座位點打靶hLF基因，其打靶效率為36.69%。這些研究為羊乳蛋白基因編輯和轉(zhuǎn)基因羊乳人源化改造的精準(zhǔn)分子育種提供了科學(xué)依據(jù)，但主要集中于靶標(biāo)位點的選擇和設(shè)計，針對打靶載體同源臂構(gòu)建，尤其是同源臂長度對打靶效率的影響鮮見報道。

本研究根據(jù)山羊BLG基因組序列，在BLC14乳腺特異性表達載體的基礎(chǔ)上分別構(gòu)建3種同源臂長度的hLF基因打靶載體，并系統(tǒng)比較分析不同長度同源臂在CRISPR/Cas9介導(dǎo)山羊乳蛋白基因座中的編輯效率。早期的基因打靶研究發(fā)現(xiàn)，打靶載體的同源臂長度是影響載體同源序列與宿主基因組序列發(fā)生同源重組的重要因素，因此，試圖通過增加打靶載體同源臂的長度以提高重組打靶效率（聶宇等，2016）。Shulman等（1990）將打靶載體的同源臂長度增加至14.0 kb時，其打靶效率呈指數(shù)型增長趨勢。An等（2012）直接構(gòu)建長同源臂打靶載體應(yīng)用于山羊BLG基因座打靶人乳白蛋白基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)打靶載體同源臂總長度低于5.5 kb時未篩選到打靶細胞株，而將同源臂延長至8.8 kb時其打靶效率明顯提高至5.3×10-5。聶宇等（2016）對ZFNs介導(dǎo)基因打靶載體同源臂長度的研究結(jié)果表明，打靶載體單同源臂長度至少在1.0 kb以上才具有較高的重組效率，且證實當(dāng)同源臂延長251 bp時，其重組效率可提高12.5%。本研究中，3種不同長度（6.0、3.5和1.2 kb）同源臂經(jīng)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的打靶效率分別為50.6%、49.4%和51.2%，即同源臂長度并未對hLF基因打靶載體在山羊BLG基因座位點的打靶效率造成顯著影響，究其原因可能是CRISPR/Cas9基因編輯靶標(biāo)位點的識別是由crRNA引導(dǎo)的RNA與DNA堿基配對過程，Cas9蛋白負責(zé)DNA切割，相對于TALENs蛋白對DNA序列的識別更加精準(zhǔn)，且識別序列僅為幾十個堿基，簡單便捷（Curtin et al.，2018;Zhang et al.，2019），也進一步證實CRISPR/Cas9系統(tǒng)無需較長的同源臂打靶載體即可實現(xiàn)高效的基因打靶。該結(jié)論為羊乳中低致敏原性和富含功能營養(yǎng)成分的人源化改造及轉(zhuǎn)基因動物精準(zhǔn)分子遺傳育種打下了理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)hLF基因打靶山羊胎兒成纖維細胞BLG基因座位點能成功獲得多株hLF +/BLG -基因打靶細胞株（BLG基因座定點打靶hLF基因），但打靶載體同源臂長度對CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)BLG位點定向整合hLF基因的打靶效率無明顯影響。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）