李想 王妍柏 王銀鋒 黃學(xué)蘭

慢性乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染引起的疾病，具有傳染性、流行性等特征[1]。血清乙型肝炎表面抗原(HBsAg)陽(yáng)性是HBV感染的重要依據(jù)，但部分患者血清HBsAg檢測(cè)為陰性，但肝臟組織或血清中HBV DNA檢測(cè)為陽(yáng)性，此部分患者稱為隱匿性HBV感染患者[2]。隱匿性乙型肝炎目前仍缺乏早期診斷標(biāo)志物，嚴(yán)重威脅人類生命健康。研究表明，微小RNA-122(microRNA-122，miR-122)在乙型肝炎的發(fā)生發(fā)展及HBV復(fù)制過(guò)程中呈異常表達(dá)[3]。細(xì)胞周期激酶抑制因子4基因座中反義非編碼RNA(antisense non-coding RNA in the INK4 Locus，ANRIL)屬于長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNAs，lncRNA)的一種，是多種疾病的易感位點(diǎn)，研究表明，miR-122是ANRIL的靶基因之一[4]。因此，本研究對(duì)隱匿性乙型肝炎等患者血清ANRIL、miR-122進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合臨床指標(biāo)分析探討ANRIL、miR-122對(duì)隱匿性乙型肝炎的鑒別診斷價(jià)值，以期為臨床上開(kāi)發(fā)早期隱匿性乙型肝炎診斷指標(biāo)提供新思路。

資料與方法

一、一般資料

選取2019年2月至2021年1月寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院感染科收治的20例隱匿性乙型肝炎患者為隱匿性乙型肝炎組，平均年齡(46.95±10.02)歲；選取同期住院治療的80例慢性乙型肝炎患者作為慢性乙型肝炎組，平均年齡(47.22±10.13)歲；另同期選取80例健康體檢者作為健康對(duì)照組，平均年齡(46.83±9.48)歲。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①慢性乙型肝炎診斷符合相應(yīng)指南[5]，隱匿性乙型肝炎診斷符合診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；②年齡≥20歲，病例資料齊全者；③一個(gè)月內(nèi)未使用免疫抑制劑、抗炎藥物者；④試驗(yàn)符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，患者均自愿參加。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有結(jié)核病、酒精性肝病、遺傳代謝性肝病、藥物性肝損傷、自身免疫性肝病者；②有免疫缺陷病毒或其他病毒感染者；③有肝硬化跡象者。

查閱門(mén)診及住院病歷，收集整理患者年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)(body mass index，BMI)等一般資料。

二、主要試劑與儀器

RNA提取試劑盒(貨號(hào)：JL1545)購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：YT9036)購(gòu)自北京伊塔生物科技有限公司；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(貨號(hào)：RR820A)購(gòu)自日本Takara公司；HBV核酸定量檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：QMTEZ-7147)購(gòu)自上海圻明生物科技有限公司。qRT-PCR儀(型號(hào)：Stratagene Mx3005P)購(gòu)自上海普迪生物科技有限公司；酶標(biāo)儀(型號(hào)：Infinite F50)購(gòu)自?shī)W地利Tecan公司；全自動(dòng)生化分析儀(型號(hào)：YSI 2950)購(gòu)自瑞士INFORS公司。

三、研究方法

(一)樣品采集及保存 采集健康體檢者體檢當(dāng)天及慢性乙型肝炎和隱匿性乙型肝炎患者入院第二天清晨空腹靜脈血，離心后收集血清，-80℃保存。

(二)血清ANRIL、miR-122水平測(cè)定 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)法檢測(cè)受試者血清ANRIL、miR-122表達(dá)水平。采用試劑盒提取血清總RNA并反轉(zhuǎn)錄得cDNA。采用qRT-PCR儀擴(kuò)增ANRIL、miR-122及其內(nèi)參基因，引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)并合成，序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，45個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次，采用2-△△CT法計(jì)算血清ANRIL、miR-122相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物序列

(三)血清TBil、ALT、AST水平檢測(cè) 采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清總膽紅素(total bilirubin，TBil)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine transarninase，ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)水平，操作步驟嚴(yán)格按照儀器使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

(四)HBV DNA載量檢測(cè) 采用PCR結(jié)合熒光探針的體外DNA擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)血清HBV DNA載量。HBV引物序列及熒光探針序列見(jiàn)表2，引物及探針由中山醫(yī)科大學(xué)達(dá)安基因診斷中心合成。DNA提取后，依照HBV核酸定量檢測(cè)試劑盒(PCR結(jié)合熒光探針的體外DNA擴(kuò)增技術(shù))說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，之后放入qRT-PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，58℃退火1 min，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后電腦分析計(jì)算HBV DNA拷貝數(shù)。

表2 HBV引物及熒光探針序列

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、健康對(duì)照組、慢性乙型肝炎組和隱匿性乙型肝炎組一般資料比較

健康對(duì)照組、慢性乙型肝炎組和隱匿性乙型肝炎組年齡、性別、BMI比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；慢性乙型肝炎組TBil、ALT、AST水平高于隱匿性乙型肝炎組和健康對(duì)照組，HBV DNA載量高于隱匿性乙型肝炎組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 健康對(duì)照組、慢性乙型肝炎組和隱匿性乙型肝炎組一般資料比較[n，(±s)]

二、健康對(duì)照組、慢性乙型肝炎組和隱匿性乙型肝炎組血清ANRIL、miR-122比較

慢性乙型肝炎組血清ANRIL高于隱匿性乙型肝炎組和健康對(duì)照組，miR-122低于隱匿性乙型肝炎組和健康對(duì)照組；隱匿性乙型肝炎組血清ANRIL高于健康對(duì)照組，miR-122低于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 健康對(duì)照組、慢性乙型肝炎組和隱匿性乙型肝炎組血清ANRIL、miR-122比較(±s)

三、隱匿性乙型肝炎患者血清ANRIL、miR-122與TBil、ALT、AST、HBV DNA載量的相關(guān)性

Pearson法分析結(jié)果顯示，隱匿性乙型肝炎患者血清ANRIL與miR-122呈負(fù)相關(guān)(r=-0.597，P<0.05)，且ANRIL與TBil、ALT、AST、HBV DNA載量均呈正相關(guān)(P<0.05)；miR-122與TBil、ALT、AST、HBV DNA載量均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)圖1、表5。

圖1 隱匿性乙型肝炎患者血清ANRIL與miR-122的相關(guān)性

表5 隱匿性乙型肝炎患者血清ANRIL、miR-122與TBil、ALT、AST、HBV DNA載量的相關(guān)性

四、血清ANRIL、miR-122鑒別診斷隱匿性乙型肝炎的價(jià)值

以血清ANRIL、miR-122水平為檢驗(yàn)變量繪制ROC曲線，結(jié)果顯示，血清ANRIL、miR-122鑒別診斷隱匿性乙型肝炎的曲線下面積(area under curve，AUC)分別為0.901(95%CI: 0.796～0.996)、0.887(95%CI: 0.822～0.953)，截?cái)嘀捣謩e為1.218、0.847，特異度分別為91.2%、73.8%，敏感度分別為85.0%、95.0%；二者聯(lián)合鑒別診斷的AUC為0.941(95%CI: 0.868～0.998)，特異度為96.3%，敏感度為90.0%。見(jiàn)圖2。

圖2 血清ANRIL、miR-122鑒別診斷隱匿性乙型肝炎的ROC曲線

五、影響隱匿性乙型肝炎發(fā)生的多因素Logistic回歸分析

將是否發(fā)生隱匿性乙型肝炎作為因變量，以ANRIL、miR-122、TBil、ALT、AST、HBV DNA載量為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示ANRIL是影響隱匿性乙型肝炎發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，miR-122是影響隱匿性乙型肝炎發(fā)生的保護(hù)因素(P<0.05)。見(jiàn)表6。

表6 影響隱匿性乙型肝炎發(fā)生的多因素Logistic回歸分析

討 論

關(guān)于引起隱匿性乙型肝炎的原因，目前尚無(wú)統(tǒng)一觀點(diǎn)，但仍可確認(rèn)隱匿性乙型肝炎是病毒(如突變或病毒DNA整合到宿主基因組中)和宿主(如長(zhǎng)期的HBV特異性T細(xì)胞的免疫反應(yīng)或免疫系統(tǒng)紊亂)共同作用的結(jié)果[7]。目前在隱匿性乙型肝炎個(gè)體中，即使是檢測(cè)“金標(biāo)準(zhǔn)”——檢測(cè)HBV DNA載量的方法也存在一定局限性，因其血清HBV DNA含量通常較低，有時(shí)甚至無(wú)法用當(dāng)前的技術(shù)手段檢測(cè)到，因此可能出現(xiàn)假陰性的結(jié)果[8]。隱匿性乙型肝炎患者體內(nèi)病毒仍處于低復(fù)制狀態(tài)，會(huì)加速患者肝臟疾病進(jìn)展，威脅器官移植、輸血等的安全性[9]。

lncRNA是由基因組中非編碼序列轉(zhuǎn)錄生成的，其長(zhǎng)度大于200 nt且不具有翻譯成蛋白質(zhì)能力，許多l(xiāng)ncRNA在表觀遺傳、翻譯及蛋白修飾過(guò)程中均可發(fā)揮重要的調(diào)控作用[10]。ANRIL作為一種lncRNA，其在包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤中發(fā)揮重要的致癌基因作用[11]。Ma等[12]研究證實(shí)，ANRIL可調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期發(fā)展。miR-122在肝臟發(fā)育、脂質(zhì)代謝、肝癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展等過(guò)程中均發(fā)揮重要調(diào)控作用，可作為肝臟特異性表達(dá)指標(biāo)[13]。荊曉晴等[14]研究顯示，HBV攜帶者外周血單核細(xì)胞中miR-122表達(dá)異常，且可能與病毒增殖有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，隱匿性乙型肝炎患者及慢性乙型肝炎患者血清中ANRIL表達(dá)水平升高，miR-122表達(dá)水平降低，且隱匿性乙型肝炎患者中二者與HBV DNA載量均呈一定的相關(guān)性，miR-122表達(dá)趨勢(shì)與徐蘭鋒等[15]及馬青松等[16]研究結(jié)果一致，提示ANRIL的高表達(dá)、miR-122的低表達(dá)可能與肝炎的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。Ma等[17]研究表明，ANRIL可通過(guò)調(diào)節(jié)miR-122的表達(dá)調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲。本研究推測(cè)ANRIL可能通過(guò)靶向調(diào)節(jié)miR-122轉(zhuǎn)錄，使其表達(dá)水平降低，進(jìn)而影響HBV復(fù)制活動(dòng)，調(diào)控乙肝病情的發(fā)生發(fā)展。進(jìn)一步采用多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示ANRIL、miR-122均是影響隱匿性乙型肝炎發(fā)生的因素。進(jìn)一步驗(yàn)證了ANRIL、miR-122在隱匿性HBV復(fù)制及病情進(jìn)展中的作用。本研究采用ROC曲線分析了ANRIL、miR-122在隱匿性乙型肝炎中的鑒別診斷效能，結(jié)果表明ANRIL、miR-122鑒別診斷隱匿性乙型肝炎的最佳截?cái)嘀捣謩e為1.218、0.847，兩指標(biāo)均有較高的診斷效能，且二者聯(lián)合后的診斷特異度為96.3%，均高于二者單獨(dú)檢測(cè)(分別為91.2%、73.8%)。此外，本研究中血清ANRIL、miR-122與肝功能指標(biāo)TBil、ALT、AST均有相關(guān)性，這提示ANRIL、miR-122可能通過(guò)影響HBV復(fù)制，加速隱匿性乙型肝炎患者病情進(jìn)展，造成其肝功能損傷。

綜上所述，隱匿性乙型肝炎患者血清ANRIL表達(dá)水平升高，miR-122表達(dá)水平降低，二者均與HBV DNA載量有關(guān)，且在鑒別診斷隱匿性乙型肝炎中有較高的診斷效能。ANRIL、miR-122可能通過(guò)影響HBV復(fù)制參與隱匿性乙型肝炎的發(fā)生、發(fā)展。ANRIL、miR-122可能有較高的應(yīng)用價(jià)值，值得臨床醫(yī)師關(guān)注，但因本研究收集病例數(shù)有限，結(jié)果可能存在一定的局限性，且具體機(jī)制尚需進(jìn)一步通過(guò)動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)證實(shí)。