蒙真鋮， 陳林楊， 陳鴻潔， 只佳增， 錢 云， 李國棟

(1.云南省紅河熱帶農(nóng)業(yè)科學研究所， 云南 河口 661300； 2.云南中醫(yī)藥大學， 昆明 650500)

波葉青牛膽(TinosporacrispaL.)為防己科青牛膽屬藤本植物，又稱苦藤、千里找根、綠包藤，主要分布在亞洲、非洲地區(qū)的雨林及混合落葉林，主要包括印度、馬來西亞、泰國等[1]，我國云南亦有分布[2]。波葉青牛膽藤莖富含生物堿類、二萜類、三萜類化合物等[3-5]，具有抗菌、降血壓、抗瘧疾以及強心等藥理作用[6-7]；亦可作為城市景觀及園林綠化的優(yōu)良藤本植物，是一種具有良好開發(fā)前景的藥材及園林綠化植物；相關(guān)學者對波葉青牛膽的研究主要在其化學成分、藥用藥理及臨床應(yīng)用上[8]，而對其在扦插繁殖方面的研究鮮有報道，由于橡膠、香蕉等熱帶作物的大面積栽種和推廣，云南山地雨林次生植被破壞嚴重，加上對野生波葉青牛膽資源的肆意挖掘，波葉青牛膽的生境逐步喪失。本實驗以波葉青牛膽為研究材料，對其進行扦插繁殖試驗研究，旨在為波葉青牛膽的種質(zhì)資源保存和種苗擴繁提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以云南省紅河熱帶農(nóng)業(yè)科學研究所南藥種質(zhì)資源圃的波葉青牛膽植株為研究材料。選取植株健壯，無病蟲害的木質(zhì)化枝條為插穗(長12～15 cm)，保證每條插穗上有3～5個芽；插穗基部用刀片切成斜口，備用。

1.2 插床與實驗條件設(shè)置

試驗于 2019年8月—11月在云南省紅河熱帶農(nóng)業(yè)科學研究所育苗棚內(nèi)進行。插床為地床，鋪設(shè)厚25 cm的扦插基質(zhì)。棚外設(shè)置可移動的遮陽網(wǎng)，扦插后每天噴霧保持空氣相對濕度在85%以上，15 d后減少噴霧次數(shù)，并及時清除苗床雜草。

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1正交試驗

以基質(zhì)(A)、ABT濃度(B)、浸泡時間(C)為試驗因素，其中D為空列，每因素3個水平，按L9(34)正交表(表1)對波葉青牛膽進行扦插試驗，共計9個處理，每個扦插數(shù)為30個，研究各因素水平對波葉青牛膽扦插生根情況的影響；20 d后，記錄地下部分農(nóng)藝性狀指標(包括總根數(shù)、不定根數(shù)、最長根長、生根率、腐爛率)和地上部分農(nóng)藝性狀指標(包括出芽數(shù)、葉片數(shù)、最大葉面積、發(fā)芽率)。

表1 L9(34)正交試驗設(shè)計Table 1 Orthogonal experimental design with L9 (34)

1.3.2優(yōu)化試驗

以正交試驗的最優(yōu)組合為參考，研究在相同基質(zhì)和激素濃度條件下，以不同浸泡時間為梯度，進一步做扦插優(yōu)化試驗，清水處理作為對照(ck)；每種處理20個莖段，3次重復(fù)。20 d后，記錄地下部分農(nóng)藝性狀指標(包括總根數(shù)、不定根數(shù)、最長根長、生根率、腐爛率)和地上部分農(nóng)藝性狀指標(包括出芽數(shù)、葉片數(shù)、最大葉面積、發(fā)芽率)，試驗設(shè)計見表2。

表2 優(yōu)化組合試驗設(shè)計Table 2 Test design of optimized combination

1.4 扦插后管理

莖段扦插深度約3 cm。扦插后每天噴霧保持空氣相對濕度在85%以上，15 d后減少噴霧次數(shù)，20 d后統(tǒng)計相關(guān)數(shù)據(jù)。

生根率(%)=(生根插穗數(shù)/插穗總數(shù))×100%；

腐爛率(%)=(腐爛插穗數(shù)/插穗總數(shù))×100%；

抽芽率(%)=(抽芽插穗數(shù)/插穗總數(shù))×100%。

1.5 數(shù)據(jù)分析

Microsoft Excel 2007軟件整理數(shù)據(jù)，運用SPSS 19.0軟件對所有指標使用鄧肯法(Duncan)進行方差分析，Origin 8.0軟件制圖。方差分析前，參照Bashir等[9]的方法對所有百分率指標進行反正弦轉(zhuǎn)換(sin-1)，而生根數(shù)等數(shù)量指標在處理間的變幅較大，作對數(shù)轉(zhuǎn)換[lg(x+1)]，以滿足正態(tài)分布假設(shè)。

隸屬函數(shù)計算公式為：

U(Xj) = (Xj-Xmin) /(Xmax-Xmin)

式中：Xj為某一處理的某一指標值，Xmin、Xmax分別為所有處理在該指標中的最小值和最大值。腐爛率與生根效果呈負相關(guān)，其公式為：

U(Xj)=1-(Xj-Xmin) /(Xmax-Xmin) 。

將各處理不同指標的隸屬值進行累加求其平均值，平均值越大效果越好[10-11]。

使用杭州萬深檢測科技有限公司生產(chǎn)的LA-S植物圖像分析儀測定葉面積。

2 結(jié)果分析

2.1 波葉青牛膽各農(nóng)藝性狀相關(guān)性分析

由表3可知，腐爛率與所有的農(nóng)藝性狀呈負相關(guān)，其中與生根率、最長根長、出芽數(shù)、發(fā)芽率呈極顯著負相關(guān)，與總根數(shù)呈顯著負相關(guān)；不定根數(shù)與總根數(shù)呈顯著正相關(guān)，與最大葉面積呈負相關(guān)；總根數(shù)與最長根長呈極顯著正相關(guān)，與生根率、發(fā)芽率呈顯著正相關(guān)；最長根長與生根率呈極顯著正相關(guān)，與出芽數(shù)、發(fā)芽率呈顯著正相關(guān)；生根率與出芽數(shù)、發(fā)芽率呈顯著正相關(guān)；出芽數(shù)與發(fā)芽率呈極顯著正相關(guān)，與葉片數(shù)、最長葉柄呈顯著正相關(guān)；葉片數(shù)與最長葉柄、最大葉面積呈極顯著正相關(guān)，與發(fā)芽率呈顯著正相關(guān)；最長葉柄與最大葉面積呈極顯著正相關(guān)，與發(fā)芽率呈顯著正相關(guān)。

表3 波葉青牛膽各農(nóng)藝性狀相關(guān)性Table 3 Correlation analysis of agronomic traits of T. crispa

2.2 不同處理組合對波葉青牛膽扦插的影響

本試驗以5個地下部分指標和5個地上部分指標從不同層面考察了不同試驗因素對波葉青牛膽扦插育苗的影響，由于單一或少數(shù)指標難以全面、客觀地反映各組合的育苗效果，為進一步全面反映各個處理因素及水平對波葉青牛膽扦插育苗情況的綜合效應(yīng)，本實驗采用隸屬函數(shù)法對各組合的生根效果、發(fā)芽效果進行綜合評價，將各處理不同指標的隸屬值進行累加求其平均值，平均值越大扦插效果越好。

因素的主次是以極差(R)的大小來衡量。R值大，表明此因素對試驗的產(chǎn)生與結(jié)果影響大，說明該因素比較重要；R值小，則表明其對試驗的影響小，說明該因素相對比較次要[12]。由R值大小的比較分析可以看出，3種因素對波葉青牛膽生根效果的影響從大到小依次為A(基質(zhì))、C(浸泡時間)、B(ABT濃度)，通過直觀分析法，得出波葉青牛膽生根效果的優(yōu)組合為A1B2C1(表4)；對波葉青牛膽發(fā)芽效果的影響從大到小為C(浸泡時間)、A(基質(zhì))、B(ABT濃度)，發(fā)芽效果的優(yōu)組合為A2B3C1(表5)；對波葉青牛膽扦插效果的影響從大到小為A(基質(zhì))、C(浸泡時間)、B(ABT濃度)，優(yōu)組合為A1B2C1(表6)。

表4 正交試驗不同處理組合對波葉青牛膽扦插地下部分影響的直觀分析Table 4 Visual analysis of the effects of different treatment combinations in orthogonal test on the underground part of the cuttings of T. crispa

表5 不同處理組合對波葉青牛膽扦插地上部分影響的直觀分析Table 5 Visual analysis of the effects of different treatment combinations in orthogonal test on the aboveground part of the cuttings of T. crispa

表6 不同處理組合對波葉青牛膽扦插影響的直觀分析Table 6 Visual analysis of the effects of different treatment combinations in orthogonal experiment on the cutting

2.3 不同處理組合對波葉青牛膽扦插影響的方差分析

進一步做方差分析，以判斷各個因素對波葉青牛膽扦插育苗的影響程度。 A處理中，A1、A2處理水平的生根效果較好，兩個水平的生根效果差異不顯著，其中A1的生根效果最好，且與A3差異顯著；A2和A3處理水平的生根效果差異不顯著；A處理的3個水平對發(fā)芽效果和扦插效果的影響均不顯著；綜合3個指標，可以看出A1水平處理的效果最好，B處理和C處理的3個水平對波葉青牛膽的生根效果、發(fā)芽效果和扦插效果3個指標的影響均不顯著，其中以B2，C1水平處理的較好；由方差分析得出，波葉青牛膽扦插育苗的優(yōu)組合為A1B2C1(表7)。

表7 正交試驗不同因素組合對波葉青牛膽扦插影響的方差分析Table 7 Variance analysis of the effects of different factors combination in orthogonal experiment on the cutting

2.4 優(yōu)化試驗不同處理組合對波葉青牛膽扦插生長的影響

根據(jù)正交試驗獲得的波葉青牛膽扦插育苗的優(yōu)組合為參考，研究在河沙和ABT濃度為400 mg/L的統(tǒng)一條件下，以不同浸泡時間為梯度，進一步做扦插優(yōu)化試驗，分析各優(yōu)化組合對地下部分(須根數(shù)、不定根數(shù)、最長根長)、地上部分(出芽數(shù)、葉片數(shù)、最大葉面積)等農(nóng)藝性狀和生根率、腐爛率、發(fā)芽率等指標的影響。最后根據(jù)采用隸屬函數(shù)法對各組合的生根效果(須根數(shù)，不定根數(shù)，最長根長，生根率，腐爛率)、發(fā)芽效果(出芽數(shù)，葉片數(shù)，最大葉面積，發(fā)芽率)，扦插效果(所有指標)進行綜合評價。

在相同基質(zhì)和激素濃度下，不同浸泡時間對波葉青牛膽各扦插指標的影響也各不相同；隨著浸泡時間的增加，須根數(shù)、不定根數(shù)、最長根長等地下部分農(nóng)藝性狀指標數(shù)值呈先增后減的趨勢；其中須根數(shù)在浸泡2 min和10 min時，數(shù)量較多，每株平均數(shù)量分別為16條和12.15條，兩處理間差異不顯著，而和ck(清水浸泡2 min)、30 min、1 h、6 h等4個處理差異顯著；ck和30 min處理的平均每株須根數(shù)較少，分別為2.83條和2.47條，兩者間差異不顯著；浸泡1 h后，平均每株須根數(shù)僅有0.7條，浸泡6 h后須根數(shù)為0條；須根數(shù)由多到少的順序為2 min、10 min、ck、30 min、1 h、6 h(圖1-a，圖2)。

不定根數(shù)在浸泡2 min和10 min時，平均每株數(shù)量較多，分別為7.07條和7.95條，兩者間差異不顯著，與ck(1.33條)、30 min(2.47條)、1 h(2.15條)、6 h(2.17條)差異顯著；ck與1 h以及6 h處理的不定根數(shù)較少，三者間差異不顯著；30 min次之；不定根數(shù)由多到少的順序為10 min、2 min、30 min、6 h、1 h、ck(圖1-a，圖2)；

最長根長在浸泡2 min和10 min時，每株平均長度最長，分別為10.65 cm和7.62 cm，兩者間差異不顯著，與ck(4.86 cm)、30 min(6.51 cm)、1 h(2.79 cm)、6 h(1.09 cm)差異顯著；30 min次之，ck、1 h、6 h較短，其平均長度由長到短依次為2 min、10 min、30 min、ck、1 h、6 h(圖1-a，圖2)。

隨著浸泡時間的增加，出芽數(shù)、葉片數(shù)、最長葉柄等指標的數(shù)值呈先增加后減小的趨勢，浸泡6 h后，3個指標的數(shù)值均為0。其中出芽數(shù)在ck，2 min和10 min處理時數(shù)值最大，每株平均出芽數(shù)分別達到0.72個，0.92個和0.95個，且三者間差異不顯著，與30 min(0.4個/株)、1 h(0.13個/株)、6 h(0個/株)差異顯著；浸泡30 min的處理組合次之；1 h和6 h的平均出芽數(shù)最小，其平均出芽數(shù)由多到少依次為10 min、2 min、ck、30 min、1 h、6 h(圖1-b，圖2)。

葉片數(shù)在浸泡10 min處理時數(shù)值最大，每株為2.78片，且與其他處理差異顯著；2 min的處理較好，每株為1.88片；ck處理次之，每株為0.77片；浸泡30 min后，每株葉片數(shù)僅為0.2片，其平均葉片數(shù)由多到少依次為10 min、2 min、ck、30 min、1 h、6 h(圖1-b，圖2)。

最大葉面積在2～10 min處理時數(shù)值最大，分別為16.27 cm2/株和16.80 cm2/株，兩者差異不顯著，而與ck(0.48 cm2/株)、30 min(0.14 cm2/株)、1 h(0.16 cm2/株)、6 h(0 cm2/株)差異顯著；ck和30 min、1 h以及6 h的處理較小，四者間差異不顯著；其平均值由大到小依次為10 min、2 min、ck、1 h、30 min、6 h(圖1-b，圖2)。

圖1 優(yōu)化試驗不同處理組合對波葉青牛膽各農(nóng)藝性狀指標的影響Fig.1 Effects of different treatment combinations on the agronomic traits of T. crispa

生根率在2～30 min處理時效果較好，分別為88.33%，86.67%和93.33%，三者間差異不顯著；ck次之，為83.33%，與2 min，10 min處理差異不顯著；1 h和6 h處理的生根率較低，僅為45%和35%；其生根率由大到小依次為30 min、2 min、10 min、ck、1 h、6 h(圖1-c)。

腐爛率在ck和2～30 min處理時，效果較好，分別為11.67%，11.67%，13.33%和6.67%，四者間差異不顯著，而與1 h(53.33%)和6 h(65%)差異顯著；其腐爛率由低到高依次為30 min、ck=2 min、10 min、1 h、6 h(圖1-c)。

發(fā)芽率在ck，2～10 min處理時，效果較好，分別為71.67%，71.67%和78.33%，三者間差異不顯著；30 min次之，為40%，與ck，2 min，10 min處理差異顯著；1 h和6 h處理的發(fā)芽率較低，僅為13.33%和0；其發(fā)芽率由大到小依次為10 min、2 min=ck、30 min、1 h、6 h(圖1-c)。

2～10 min處理時，生根效果，發(fā)芽效果及扦插效果都最好；隨著浸泡時間的增加，這3個指標都呈逐漸下降趨勢；其中生根效果指數(shù)在2～10 min處理時分別為0.47和0.42，1 h后的生根效果指數(shù)為0.072，6 h時更低，僅有0.013，生根效果由高到低依次為2 min、10 min、30 min、ck、1 h、6 h；發(fā)芽效果指數(shù)最高為0.5，發(fā)芽效果由高到低依次為10 min、2 min、ck、30 min、1 h、6 h；扦插效果指數(shù)最高為0.949，扦插效果由高到低依次為2 min、10 min、ck、30 min、1 h、6 h(圖1-d)。

3 討論與結(jié)論

3.1 討 論

扦插基質(zhì)、植物生長調(diào)節(jié)劑，扦插部位浸泡時間等外界因素對插穗生根均有影響[13]，也是扦插育苗實驗中常見的研究因子?；|(zhì)是影響植物扦插生根的重要影響因子，決定了插穗的生根環(huán)境[14]，直接影響生根的難易和生根質(zhì)量。本正交試驗中，基質(zhì)對波葉青牛膽的扦插生根起主導(dǎo)作用，這與在蒜香藤[15]、薔薇[16]、金花茶[17]等的扦插研究也得到了驗證；園土為基質(zhì)，波葉青牛膽生根效果最差；河沙，椰糠生根效果較好。究其原因可能為園土質(zhì)地較黏重，吸水性較強，透氣不良，不利于波葉青牛膽根系伸長生長，而河沙或椰糠則不會有以上缺點。因此，園土并不適用于波葉青牛膽扦插。

激素的使用有利于誘導(dǎo)根原始體，促進不定根的生長。不同類型的外源激素對不同植物扦插生根的影響不同；同一激素不同濃度不同的浸泡時間亦影響著扦插效果。ABT作為生根促進劑的相關(guān)研究較多，這已經(jīng)許多物種上得到了驗證：郭其強等[18]認為，藏柏和巨柏在100 mg/L的ABT 溶液中浸泡插穗3 h時，插穗愈傷組織和根系發(fā)育狀況最優(yōu)；諶振等[19]采用1 250 mg/L的ABT 1號處理杏黃龍船花插穗，生根效果最好；10 mg/L ABT可有效提高杜鵑花扦插的成活率[20]；150 mg/L浸泡3 h的ABT 1號溶液處理，有利于樹頭菜的插穗生根和改善根系質(zhì)量，提高插穗內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)含量，對其插穗生根有促進作用[21]。

優(yōu)化實驗中，不同浸泡時間對波葉青牛膽的扦插效果差異顯著；基本上隨著浸泡時間的增加，各生長指標基本上呈先增后減的趨勢；說明在同一濃度條件下，插穗受在水中浸泡時間的長短而影響扦插效果；浸泡2～10 min時，插穗的地下部分(須根數(shù)、不定根數(shù)、最長根長)和地上部分(出芽數(shù)、葉片數(shù)、最大葉面積)等農(nóng)藝性狀都比較好；生根率、發(fā)芽率都比較高，腐爛率較低；隨著浸泡時間的增加(大于30 min)，插穗腐爛率高，生根率和發(fā)芽率都較低，可能是由于波葉青牛膽短時間內(nèi)就能完全吸收所需激素，隨著浸泡時間的增加，激素過度吸收，促進作用轉(zhuǎn)為抑制作用，這與潘越等[22]、張沛健等[23]研究結(jié)果基本相同，至于具體原因，還需要進行進一步研究探索。

3.2 結(jié) 論

本研究以基質(zhì)、ABT濃度，浸泡時間為因素，通過三因素三水平的正交試驗，得出波葉青牛膽扦插的最優(yōu)組合是以河沙為扦插基質(zhì)，使用400 mg/L的ABT溶液浸泡10 min；以優(yōu)組合為參考，深入研究同一基質(zhì)和濃度下不同浸泡時間處理，當以河沙為扦插基質(zhì)，使用400 mg/L的ABT溶液浸泡2～10 min時，波葉青牛膽的生根效果，發(fā)芽效果及扦插效果都最好。該結(jié)果將對藥用植物波葉青牛膽的人工扦插繁殖提供一定的參考。