張懷霞，張瑩瑩，任 昊 ，謝 雯，陳 倩，侯生珍，賈建磊

(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016；2.青海大學(xué)實(shí)驗(yàn)室管理處，西寧 810016)

【研究意義】藏系綿羊作為青海地區(qū)傳統(tǒng)優(yōu)良品種之一，草原生態(tài)環(huán)境的變化和國(guó)家禁牧舍飼等相關(guān)政策的實(shí)施使得放牧補(bǔ)飼或舍飼替代原有的傳統(tǒng)自然放牧成為必然趨勢(shì)[1]。面對(duì)牧區(qū)草地資源在高寒地帶、天然草場(chǎng)具有很長(zhǎng)的枯草期等諸多制約條件，只有利用現(xiàn)代養(yǎng)殖技術(shù)進(jìn)行規(guī)?；?、集約化的飼養(yǎng)管理才能有助于提高藏羊生產(chǎn)效率從而保證牧民養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益[2]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】眾所周知，動(dòng)物胃腸系統(tǒng)的生理動(dòng)態(tài)平衡主要靠微生物來維持，一旦平衡失調(diào)，動(dòng)物的生產(chǎn)性能隨之降低甚至發(fā)病。研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物的品種、年齡、日糧以及養(yǎng)殖方式等都在影響著其腸道微生物的結(jié)構(gòu)及其數(shù)量。石鵬君等[3]在研究山羊腸道菌群結(jié)構(gòu)組成與物種之間的關(guān)系中發(fā)現(xiàn)了相同品種的山羊腸道微生物構(gòu)成相似度較高,不同種類間的山羊之間其腸道菌群構(gòu)成相似度極低，差異較大；周小娟等[4]在研究不同日齡、品種和飼養(yǎng)方式對(duì)肉仔雞腸道菌群的研究報(bào)道中說明肉仔雞腸道微生物區(qū)系受品種和飼養(yǎng)方式等的影響;李賀[5]在探究不同來源脂肪對(duì)大鼠腸道微生物的影響研究中發(fā)現(xiàn)大鼠盲腸內(nèi)容物中的菌群發(fā)酵和菌群組成受到不同脂肪的顯著影響。大量研究表明，動(dòng)物在不同的飼養(yǎng)模式下其生產(chǎn)性能、微生物區(qū)系等都表現(xiàn)出不同程度的差異，例如陳粉粉等[6]在對(duì)不同的飼養(yǎng)方式對(duì)肉雞生產(chǎn)性能及腸道和器官指數(shù)的影響報(bào)道中發(fā)現(xiàn)放牧組肉雞和籠養(yǎng)雞日增重、血液中的尿酸及總蛋白等均有差異；鄭青[7]在不同的飼養(yǎng)模式對(duì)豬腸道菌群的影響的研究中發(fā)現(xiàn)，林下養(yǎng)殖的豬與圈養(yǎng)豬腸道菌群差異明顯且林下散養(yǎng)的豬腸道菌群更具有多樣性；王柏輝[8]等以蘇尼特羊?yàn)閷?duì)象、以不同的飼養(yǎng)方式為單因素的試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)蘇尼特羊在2種飼養(yǎng)條件下其腸道菌群在屬水平上表現(xiàn)出極大的差異?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】對(duì)于牛、羊等反芻動(dòng)物，更多的有關(guān)其體內(nèi)微生物的研究都集中在瘤胃，基于反芻動(dòng)物特殊的消化道結(jié)構(gòu)，其腸道微生物群落也一樣值得關(guān)注，特別是糞便微生物，往往認(rèn)為與機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)、健康等密切相關(guān)[9]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以藏系綿羊?yàn)檠芯繉?duì)象探索不同飼養(yǎng)方式對(duì)其糞便微生物菌群結(jié)構(gòu)和功能的影響，旨在為藏羊全舍飼養(yǎng)殖提供理論基礎(chǔ)并為藏羊高效養(yǎng)殖提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)在青海省共和縣切吉鄉(xiāng)哇玉香咔牧業(yè)責(zé)任有限公司(海拔3200 m)進(jìn)行，選擇初始條件相近的1～1.5歲藏羊后備母羊12只，隨機(jī)分為2組(自然放牧組RF，全舍飼組RS)，每組6只。試驗(yàn)從2020年7月8日至9月8日，為期60 d，前2周為適應(yīng)期，第3周開始為正式期。

1.1.2 飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)開始前所有羊只采用傳統(tǒng)的放牧+補(bǔ)飼的飼養(yǎng)模式，即藏羊早上8：00放牧，下午5：30歸牧，歸牧之后補(bǔ)充精飼料和干草。開始后按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行羊只的飼養(yǎng)，即放牧組藏羊在當(dāng)?shù)靥烊徊輬?chǎng)自由放牧，早出晚歸，歸牧后不進(jìn)行補(bǔ)充飼喂。舍飼組藏羊采用全舍飼的飼養(yǎng)模式，試驗(yàn)期間每天用割草機(jī)去草場(chǎng)采割青草帶回進(jìn)行飼喂，自由飲水。

1.1.3 樣品采集 飼養(yǎng)試驗(yàn)最后5 d為樣品采集期(前2 d為適應(yīng)期，后3 d為糞便采集期)，每只母羊套上糞袋，每天8：00、12：00、16：00和20：00分別隨機(jī)采集糞便樣品，-20 ℃保存，采樣期結(jié)束后將樣品混勻后，每份糞樣采集約20 g，放入液氮后帶回實(shí)驗(yàn)室，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品DNA的提取 按照DP328糞便DNA提取通用試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)說明書提取藏羊糞便細(xì)菌總DNA，具體流程如下：①稱取180～220 mg的糞樣將其放到2 mL的離心管中并將離心管放置在冰上。②在離心管中加入1.4 mL的緩沖液，震蕩1 min使樣本充分混勻。③70 ℃下孵育5 min。④渦旋15 s之后13 000 r/min離心1 min，然后將1.2 mL上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)新的2 mL的離心管中。⑤加入一個(gè)抑制劑吸附片LnhibitEX于離心管中，將其震蕩直到吸附片完全并打開重懸。然后在室溫下孵育1 min保證吸附片能充分作用。⑥將離心管以13 000 r/min離心3 min。⑦把上一步離心所得的上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管后重復(fù)步驟6。⑧將離心所得上清液轉(zhuǎn)移200 μL到另一個(gè)1.5 mL的離心管后加入15 μL蛋白酶K。⑨加入200 μL緩沖液后渦旋15 s。⑩70 ℃下孵育10 min。加入200 μL無水乙醇并渦旋混勻。把上一步所得溶液加到吸附柱CR2中，12 000 r/min離心30 s后倒掉廢液并將吸附柱放進(jìn)收集管中。將500 μL緩沖液加入到吸附柱CR2中，12 000 r/min離心30 s后倒掉廢液，將吸附柱放進(jìn)收集管中。將700 μL漂洗液加入到吸附柱CR2中，12 000 r/min離心30 s后倒掉廢液，將吸附柱放進(jìn)收集管中。將500 μL漂洗液加入到吸附柱CR2中， 12 000 r/min離心30 s后倒掉廢液，將吸附柱放進(jìn)收集管中。吸附柱CR2放回到收集管后12 000 r/min離心2 min并將廢液倒掉,將吸附柱CR2在室溫下放置幾分鐘，以使殘余的漂洗液被完全晾干吸附。將吸附柱CR2轉(zhuǎn)到新的離心管中，在吸附膜的中間位置懸空加50 μL洗脫緩沖液，室溫下放置2～5 min后，12 000 r/min離心2 min，再將溶液收集到離心管中。

1.2.2 PCR擴(kuò)增和16S rDNA測(cè)序 DNA的純度及其濃度的檢測(cè)采用瓊脂糖凝膠電泳，離心管內(nèi)放入一定量的樣本DNA，將樣本用無菌水進(jìn)一步稀釋到1 ng/μL。將稀釋完成的基因組 DNA作為模板，利用16S rDNA V4區(qū)通用515F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)PCR擴(kuò)增目的片段16S rDNA V4區(qū)，使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)；按照PCR產(chǎn)物的濃度開始進(jìn)行相等含量的混樣，充分混勻，然后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，通過膠回收試劑盒來回收相應(yīng)目的條帶產(chǎn)物。接著便構(gòu)建文庫并對(duì)其進(jìn)行定量，定量完成之后選擇合格的文庫進(jìn)行下一步的上機(jī)測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 測(cè)序完成之后，對(duì)所得到的原始數(shù)據(jù)(Raw tags)通過拼接、過濾處理從而得到質(zhì)量較高的數(shù)據(jù)(Clean tags)。再將Clean tags去除嵌合體序列之后最終得到樣本的有效數(shù)據(jù)(Effective tags)。

劃定97%的相似性為聚類的標(biāo)準(zhǔn)水平，利用Uparse軟件對(duì)所有樣本的Effective tags進(jìn)行聚類，把有效數(shù)據(jù)聚類為OTUs，然后用Mothur方法與SILVA132的SSU rRNA數(shù)據(jù)庫對(duì)其序列進(jìn)行物種注釋。通過物種注釋分析得到每個(gè)分類水平上所有樣本的群落組成信息，然后對(duì)所有樣本的數(shù)據(jù)通過均一化處理，使用R軟件進(jìn)行Alpha多樣性分析、主坐標(biāo)分析、OUTs豐度分析以及功能預(yù)測(cè)分析，隨后得到樣本物種豐富度以及菌群多樣性等信息，并進(jìn)一步比較分析不同分組的藏羊其糞便微生物結(jié)構(gòu)和功能的差異。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 用Excel 2010對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行錄入整理，采用SAS 9.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以α=0.05進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序質(zhì)控結(jié)果

利用Illumina Nova 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，建立PCR-free文庫，隨后開始雙末端(Paired-end)測(cè)序。對(duì)Reads拼接之后，12份藏羊糞便樣品平均每樣品測(cè)得91 291條tags，經(jīng)過質(zhì)控平均得到 86 365條有效數(shù)據(jù)，質(zhì)控有效數(shù)據(jù)量達(dá)60 408條，質(zhì)控有效率達(dá)66.03%。各樣品測(cè)序質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)見表1。

表1 數(shù)據(jù)預(yù)處理統(tǒng)計(jì)及質(zhì)控

2.2 組內(nèi)同質(zhì)性分析

由圖1可知，在放牧飼養(yǎng)條件下藏羊糞便樣品中檢測(cè)到的OTU數(shù)目最多為1787個(gè)，舍飼飼養(yǎng)條件下則檢測(cè)到1630個(gè)OTU。舍飼組6個(gè)樣本共有的OTUS數(shù)目為812，放牧組為489，說明放牧組的組內(nèi)同質(zhì)性較舍飼組好。

一個(gè)完整的花即為一組樣本，而不同顏色的花瓣代表組內(nèi)不同樣本。core數(shù)字反映了所有樣本共有OTUs數(shù)目，花瓣上的數(shù)字為該樣本(組)獨(dú)有的OTU數(shù)目A complete flower is a group of samples, and petals of different colors represent different samples within the group. The core number reflects the number of OTUs shared by all samples, and the number on the petals is the number of OTUs unique to this sample (group)圖1 各樣本同質(zhì)性分析Fig.1 Analysis of homogeneity of each sample

2.3 Alpha多樣性分析

將不同樣本在97%的相似度水平下獲得的Alpha Diversity分析指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如表2所示。其中，Observed-species指數(shù)反映的是群落中物種的數(shù)量，結(jié)果表明放牧組樣品中群落的物種數(shù)量顯著高于舍飼組(P<0.05)；Shannon指數(shù)則反映菌群的多樣性，數(shù)據(jù)表明2個(gè)組的樣品菌群多樣性差異顯著(P<0.05),說明放牧組藏羊的糞便樣品其菌群較舍飼組具有更高的多樣性。

表2 Alpha多樣性統(tǒng)計(jì)

2.4 物種注釋及OTUs豐度分析

通過物種注釋并對(duì)不同分類層級(jí)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)共有1928個(gè)OTUs，其中，能夠注釋到數(shù)據(jù)庫的OTUs數(shù)目為1927(99.95%)，注釋到界水平的比例為99.95%，門水平的比例為98.08%，綱水平的比例為96.21%，目水平的比例為92.74%，科水平的比例為80.86%，屬水平的比例為27.96%，種水平的比例為8.04%。

2.4.1 菌群在門分類水平上的比較 如圖2所示，基于門水平而言，每一個(gè)樣品中占據(jù)主導(dǎo)地位的主要包括厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和變形菌門(Protebacteria)。其中厚壁菌門和擬桿菌門這兩大門類序列占總序列的75%以上，是藏羊糞便微生物菌群中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌。結(jié)合表3來看，舍飼組樣本中的放線菌門(Actinobacteria)和螺旋體門(Spirochaetes)的相對(duì)含量顯著高于放牧組(P<0.05)，其他菌門在2組中均差異不顯著(P>0.05)。

2.4.2 菌群在科分類水平上的比較 由圖3可知，在科水平上以瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)和Unidentified-clostridiales的豐度最高，即為優(yōu)勢(shì)物種。

進(jìn)一步分析科水平上的細(xì)菌豐度(表4)，其中放牧組在科水平上克里斯滕森菌科和擬桿菌科的含量顯著高于舍飼組(P<0.05)，其余菌科在2組中均有差異但不顯著(P>0.05)。從表中可以看到，2組中除了瘤胃球菌科、毛螺菌科及未被分類梭菌科之外，理研菌科和克里斯滕森菌科也具有較高的含量。

2.5 主坐標(biāo)分析

PCoA分析說明，如果樣本都聚集在一起，說明它們的物種結(jié)構(gòu)組成有很高的相似性，而如果群落的差異性很大，樣本就會(huì)分開且距離較遠(yuǎn)。由圖4可知，不同飼養(yǎng)模式下飼養(yǎng)的藏羊樣本菌群聚類在坐標(biāo)不同的位置，組間差異明顯而組內(nèi)沒有明顯的差異，舍飼組樣本中的物種組成結(jié)構(gòu)相似度較高，表明不同飼養(yǎng)模式對(duì)藏羊糞便微生物群落有影響。

圖2 門水平上物種分析Fig.2 Species analysis at the phylum level

表3 門水平上的細(xì)菌相對(duì)豐度

圖3 科水平上物種分析Fig.3 Species analysis at the family level

表4 科水平上的細(xì)菌相對(duì)豐度

R1:舍飼組1; R2:舍飼組2; R3:放牧組1; R4:放牧組2R1:House feeding group 1; R2:House feeding group 2; R3:Grazing group 1; R4:Grazing group 2圖4 Unifrac加權(quán)主坐標(biāo)分析Fig.4 Unifrac weighted main coordinate analysis

2.6 功能預(yù)測(cè)分析

選擇每個(gè)樣本在每個(gè)注釋層級(jí)上最大豐度排名前10的功能信息，作出功能相對(duì)豐度柱狀堆積圖進(jìn)而查看各樣本在不同注釋層級(jí)上相對(duì)豐度較高的功能及其比例。如圖5所示，2個(gè)組的藏羊糞便微生物功能所占比例差異不明顯，在2種飼養(yǎng)模式下藏羊糞便微生物的功能主要集中在新陳代謝(Metabolism)、基因信息和環(huán)境信息的加工(Genetic-information-processin)。

圖5 KEGG功能注釋相對(duì)豐度Fig.5 KEGG feature noterelative relative abundance

3 討 論

3.1 不同飼養(yǎng)模式對(duì)藏羊糞便微生物群落結(jié)構(gòu)組成的影響

從測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)藏羊糞便中微生物的種類豐富，其糞便微生物菌群包含21個(gè)門，30個(gè)綱，46個(gè)目，82個(gè)科和161個(gè)屬的細(xì)菌群落。本試驗(yàn)在放牧飼養(yǎng)條件下的藏羊糞便樣品中檢測(cè)到的OTUs數(shù)目為1787個(gè)，舍飼條件下則檢測(cè)到1630個(gè)OTUs，結(jié)合Alpha多樣性分析結(jié)果表明放牧組藏羊比舍飼組藏羊糞便菌群更具有多樣性。

基于門分類水平而言，藏羊糞便樣品中厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門的豐度最高，為主要的優(yōu)勢(shì)菌，這和多數(shù)研究結(jié)果[10]類似。在門水平上舍飼組樣本中的放線菌門和螺旋體門的含量顯著高于放牧組(P<0.05)，放線菌門作為大多數(shù)哺乳動(dòng)物腸道微生物的主要優(yōu)勢(shì)菌[11],能夠產(chǎn)生大量的抗生素消滅致病菌群從而保護(hù)宿主，也可以產(chǎn)生蛋白酶有利于宿主對(duì)蛋白的消化吸收[12]，而螺旋體門作為致病菌在舍飼組樣本中含量較高，證明可能是較高含量的螺旋體導(dǎo)致舍飼組一號(hào)樣本與組內(nèi)其他樣本產(chǎn)生了明顯的差異。2組藏羊樣本糞便微生物菌群科水平上克里斯滕森菌科和擬桿菌科豐度均有顯著差異(P<0.05)，兩者均在放牧組中具有較高的豐度，說明放牧組的藏羊?qū)δ芰康睦寐瘦^高。試驗(yàn)中的以上發(fā)現(xiàn)都說明不同的飼養(yǎng)模式對(duì)藏羊糞便微生物群落結(jié)構(gòu)組成有影響，許多研究也都證明了不同的飼養(yǎng)模式對(duì)動(dòng)物糞便微生物的影響：楊偉平[13]關(guān)于放牧型藏豬與普通瘦肉型豬腸道的細(xì)菌群落組成及多樣性的研究表明，藏豬腸道菌群多樣性顯著高于普通的瘦肉型豬，這是因?yàn)椴刎i長(zhǎng)期放牧采食牧草和幼蟲等；孔令玲[14]探究雪山雞在不同飼養(yǎng)模式下腸道微生物的差異時(shí)發(fā)現(xiàn)雪山雞在后期的籠養(yǎng)與全程平養(yǎng)2種飼養(yǎng)方式下物種豐度和菌群多樣性有明顯的差異。所以在此試驗(yàn)中藏羊生活習(xí)性的改變可能造成其糞便微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生差異包括光照、接觸的土壤環(huán)境以及藏羊的行為活動(dòng)方式等。

3.2 不同飼養(yǎng)模式對(duì)藏羊糞便微生物功能的影響

動(dòng)物腸道中棲居的大量微生物和胃腸組織構(gòu)成一極其復(fù)雜、對(duì)機(jī)體健康起著重要作用的菌群系統(tǒng)。由于基因組學(xué)的不斷發(fā)展，動(dòng)物糞便微生物的功能也被逐漸地發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌和宿主通過物質(zhì)和能量以及基因的互動(dòng)來調(diào)節(jié)重要的化學(xué)轉(zhuǎn)化[15]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，藏羊糞便微生物的主要功能包括新陳代謝、基因信息和環(huán)境信息的加工等，這可能主要取決于藏羊腸道內(nèi)豐度較高的細(xì)菌。宿主碳水化合物、蛋白質(zhì)及其他物質(zhì)的降解離不開腸道內(nèi)的擬桿菌，而膳食纖維的降解利用也要依賴于腸道內(nèi)的厚壁菌[16]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)科水平下瘤胃球菌科和毛螺菌科含量最高，瘤胃球菌科可以產(chǎn)生短鏈脂肪酸，其與反芻動(dòng)物纖維素等多糖的消化相關(guān)；毛螺菌科可分解纖維，包括試驗(yàn)檢測(cè)出的克里斯滕森菌科和琥珀酸弧菌科等都在宿主的新陳代謝中發(fā)揮自己的功能作用，它們可以通過消化纖維素及半纖維素，分解從而產(chǎn)生多糖[17]。在科水平下，克里斯滕森菌科和理研菌科都具有較高的豐度，其中克里斯滕森菌科一直都與基因聯(lián)系在一起，有研究提出克里斯滕森菌科是遺傳度最高的腸道菌；理研菌科與宿主的健康有著緊密的關(guān)系，主要表現(xiàn)在它在動(dòng)物腸道內(nèi)的含量會(huì)影響腸道內(nèi)短鏈脂肪酸即丁酸和戊酸的含量，從而對(duì)動(dòng)物健康產(chǎn)生影響[18]。

通過KEGG功能注釋發(fā)現(xiàn)，不同飼養(yǎng)模式下藏羊糞便微生物功能沒有顯著差異，具有較好的一致性，可能說明不同的飼養(yǎng)模式改變了藏羊糞便菌群的結(jié)構(gòu)及其多樣性，但對(duì)微生物功能的影響并不明顯，可能進(jìn)一步表明藏系綿羊適合舍飼飼養(yǎng)。

4 結(jié) 論

通過對(duì)比不同飼養(yǎng)模式下藏羊糞便微生物菌群結(jié)構(gòu)與功能，發(fā)現(xiàn)不同飼養(yǎng)模式下的藏羊糞便微生物菌群差異顯著，藏羊在自然放牧飼養(yǎng)方式下糞便微生物菌群多樣性高于全舍飼飼養(yǎng)方式；藏羊糞便微生物功能主要集中在新陳代謝、基因信息處理和環(huán)境信息處理中，2組藏羊其糞便微生物功能沒有顯著性差異；綜上所述，不同的飼養(yǎng)模式雖然對(duì)藏羊糞便微生物結(jié)構(gòu)影響差異顯著，但對(duì)微生物功能的影響不明顯，表明藏系綿羊能夠適應(yīng)全舍飼飼養(yǎng)模式。