千金藤素通過調控p53信號介導的自噬逆轉人非小細胞肺癌細胞的?？颂婺崮退幮?/h1>
2022-04-26 06:43:14劉然邢爽王璐張怡許保海
臨床肺科雜志 2022年5期
劉然 邢爽 王璐 張怡 許保海
非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是最常見的肺癌形式，約占所有肺癌病例的85%，其五年生存率很低，僅為15%[1-2]?；瘜W療法和靶向療法顯著改善了患者的預后。然而，當癌細胞對藥物治療產生抗藥性時，一些患者會復發(fā)，這代表了重要的臨床局限性[3-4]。?？颂婺?Icotinib)是第一代表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor，EGFR)-酪氨酸激酶抑制劑(Tyrosine kinase inhibitor，TKI)，具有方便、高效、低毒的特點[5-6]，已被中國食品藥品監(jiān)督管理局(CDFA)批準為激活EGFR突變的NSCLC患者的一線治療藥物，但是幾乎所有接受治療的患者經過9～15個月無進展生存期后，都不可避免地出現(xiàn)耐藥性，導致治療失敗[7]。因此，深入探討EGFR-TKI耐藥肺癌細胞的作用機制，對于探索新的耐藥逆轉策略具有重要意義。千金藤素(Cepharanthine)是從中藥千金藤中提取的異喹啉生物堿，臨床主要用于白細胞減少癥，研究表明千金藤素在多種腫瘤中具有抗腫瘤活性和抗多藥耐藥的作用；可誘導人卵巢癌SKOV3細胞自噬，抑制細胞活力[8]；能逆轉人鼻咽癌多藥耐藥細胞CNE2/ADM的耐藥性[9]；與多柔比星聯(lián)合應用能逆轉人類髓性白血病細胞K562/ADR對多柔比星耐藥性[10]。但是千金藤素能否逆轉人NSCLC細胞的?？颂婺崮退幮赃€未可知，因此本研究旨在探討千金藤素對人NSCLC細胞的?？颂婺崮退幮缘挠绊懠翱赡艿淖饔脵C制。
資料與方法
一、實驗細胞
人NSCLC細胞PC-9(ATCC)購自上海冠導生物工程有限公司，貨號：DA-C5037。
二、藥物、儀器與試劑
胎牛血清(10099-141)、DMEM培養(yǎng)基(10569-010)(美國Gibco公司)，?？颂婺?浙江貝達藥業(yè)有限公司，國藥準字H20110061)，Pifithrin-α(PFT-α，p53抑制劑，上海信裕生物科技有限公司，貨號：XY-1816)，MTT試劑盒(C0009S)、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(C1062L)、RIPA裂解液(P0013B)、BCA試劑盒(P0010)(碧云天生物科技公司)，6-氨基-3-甲基嘌呤(3-MA，美國Sigma-Aldrich公司，貨號：M9281)；細胞自噬染色檢測試劑盒(MDC法)(南京森貝伽生物公司，貨號：SBJ-1661)，兔抗人p53(ab32389)、mTOR(ab32028)、p-mTOR(ab137133)、Beclin-1(ab207612)、LC3A/B(ab128025)、β-actin(ab8227)、山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab205718)(英國abcam公司)，細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)，IX73倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，H-7500透射電子顯微鏡(日本日立公司)，iMark680多功能酶標儀、蛋白轉膜裝置、BD FACSCanto Ⅱ流式細胞儀(美國Bio-Rad公司)。
三、細胞培養(yǎng)及NSCLC?？颂婺崮退幖毎鸓C-9/Icotinib resistance(IR)的建立
采用?？颂婺釢舛冗f增、不斷作用的方式誘導PC-9細胞耐藥。PC-9細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，取對數(shù)生長期PC-9細胞，用質量濃度為0.5 μmol/L的?？颂婺岽碳ぷ饔?4 h，然后換新鮮的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，直到細胞形態(tài)恢復到正常生長狀態(tài)，長滿培養(yǎng)皿后進行傳代，再用0.5 μmol/L的?？颂婺嶙饔?4h，反復換液、傳代，直至在同一濃度藥物作用下細胞生長不受影響，逐漸增加?？颂婺釢舛冗M行不斷篩選培養(yǎng)，直至PC-9細胞能在含濃度為20 μmol/L?？颂婺岬呐囵B(yǎng)基中穩(wěn)定存活，記為PC-9/IR耐藥細胞。
四、MTT法篩選千金藤素的實驗濃度
體外細胞實驗中所使用的千金藤素的濃度，以對PC-9/IR細胞不造成顯著生長抑制為標準，取該濃度范圍內的較高濃度為千金藤素濃度。具體操作為：取對數(shù)生長期PC-9/IR耐藥細胞，以2×103細胞/孔的濃度接種到96孔板中(邊緣孔用PBS填充)，待PC-9/IR耐藥細胞貼壁并鋪滿孔底后，棄去原培養(yǎng)基，加入含2、4、8、16、32 μmol/L千金藤素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48h后加入5 g/L MTT試劑20 μL；繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去上層清液后加入150μl的DMSO低速震蕩溶解10min；使用酶標儀檢測各組細胞在490 nm處的光密度(optic density，OD)值，計算細胞增殖抑制率。將不含細胞的培養(yǎng)基作為空白對照組。
細胞增殖抑制率=1-(實驗組OD-空白對照組OD)/(對照組OD-空白對照組OD)×100%
五、埃克替尼敏感性檢測
采用MTT法檢測：具體操作同1.2.2，固定千金藤素的濃度為8 μmol/L，取對數(shù)生長期PC-9/IR耐藥細胞接種到96孔板中，待PC-9/IR耐藥細胞貼壁并鋪滿孔底后，分組兩組：一組只用含0、1、2、4、8、16、32、64 μmol/L?？颂婺岬呐囵B(yǎng)基培養(yǎng)，不使用千金藤素；一組用含8 μmol/L千金藤素和不同濃度(0、1、2、4、8、16、32、64 μmol/L)的埃克替尼的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；培養(yǎng)48 h后，各孔加入5 g/L MTT試劑20 μL；繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清后加入150μL的DMSO；在490 nm處測定各組細胞的OD值，計算細胞存活率；并采用GraphPad軟件計算?？颂婺釋Ω鹘M細胞的半數(shù)抑制濃度(the half inhibitory concentration, IC50)和逆轉耐藥倍數(shù)(reverse fold, RF)=IR IC50/(IR+千金藤素)共同作用下IC50。
細胞存活率=(實驗組OD-空白對照組OD)/(對照組OD-空白對照組OD)×100%
六、細胞分組及處理
取對數(shù)生長期PC-9/IR耐藥細胞，按每孔2×106個接種于24孔板，分PC-9/IR組(正常培養(yǎng)的PC-9/IR耐藥細胞)、千金藤素組(PC-9/IR耐藥細胞+8 μmol/L千金藤素)、?？颂婺峤M(PC-9/IR耐藥細胞+20 μmol/L埃克替尼)、千金藤素+埃克替尼組(PC-9/IR耐藥細胞用含20 μmol/L?？颂婺岷? μmol/L千金藤素的培養(yǎng)基共同處理)、3-MA組(PC-9/IR耐藥細胞用5 mmol/L的3-MA預處理1 h，隨后用含20 μmol/L?？颂婺岷? μmol/L千金藤素的培養(yǎng)基共同處理)、PFT-α組(PC-9/IR耐藥細胞用40μmol/L的p53抑制劑Pifithrin-α預處理1 h再用含20 μmol/L埃克替尼和8 μmol/L千金藤素的培養(yǎng)基共同處理)，繼續(xù)培養(yǎng)48h，收集細胞進行后續(xù)實驗。
七、流式細胞術檢測細胞凋亡
取對數(shù)期生長的PC-9/IR細胞，按照1.2.4項下步驟進行分組及處理，培養(yǎng)48h后，將培養(yǎng)的細胞用0.25%胰蛋白酶進行消化處理，離心，去除上清液，PBS洗滌后將細胞以1×106細胞/mL的密度重懸，加入5 μL Annexin V-FITC、5 μL PI避光孵育15 min，按照FITC-Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒說明書步驟，使用流式細胞儀分析細胞凋亡率。
八、MDC染色檢測自噬
MDC是一種嗜酸性熒光染色劑，可選擇性標記酸性自噬泡，通常用作檢測自噬的特異性標記。細胞按照1.2.4項下步驟進行分組及處理，培養(yǎng)48h后，用MDC(50 μmol/L)在37℃下避光孵育15 min，PBS洗滌兩次，立即使用倒置熒光顯微鏡檢測并拍照。平均光密度值由Image-Pro Plus 6.0版計算得出。
九、透射電鏡觀察細胞超微結構變化
收集各組細胞并用PBS洗滌，然后立即浸入2.5%戊二醛中在4°C下固定30 mim。將樣品后固定在1%四氧化鋨中1h，然后在一系列梯度乙醇中脫水。切超薄切片(50nm)，用2.5%乙酸鈾酰和1%檸檬酸鉛染色。用透射電子顯微鏡觀察細胞自噬情況，并拍照。
十、Western blot檢測自噬相關蛋白表達
使用RIPA裂解液提取細胞中蛋白質。使用BCA試劑盒對蛋白質濃度進行定量。取等量蛋白質樣品上樣(30 μg/泳道)，10% SDS-PAGE分離蛋白質，并通過半干轉移將其轉移到PVDF膜上。將膜用5%脫脂牛奶封閉，并在4 ℃下與一抗(p53、mTOR、p-mTOR、Beclin-1、LC3A/B、β-actin，1∶1000)孵育過夜。第二天，將膜與偶聯(lián)辣根過氧化物酶的二抗孵育(1∶2000)2h，然后使用化學發(fā)光試劑盒(ECL)進行顯色。以β-actin為內參，分析結果。
十一、統(tǒng)計學方法
結 果
一、千金藤素的體外細胞實驗濃度
不同濃度的千金藤素能不同程度的抑制PC-9/IR細胞的生長(見表1)；千金藤素的濃度在2、4、8 μmol/L時對PC-9/IR細胞的抑制作用較弱，抑制率均低于5%。因此，選擇8 μmol/L的千金藤素作為后續(xù)實驗濃度。
表1 千金藤素對PC-9/IR細胞增殖的抑制作用
二、千金藤素對PC-9/IR細胞?？颂婺崦舾行缘淖饔?/p>
PC-9/IR細胞的存活率隨著?？颂婺釢舛鹊脑黾佣档停Ы鹛偎啬苊黠@增加PC-9/IR細胞對?？颂婺岬拿舾行?，經計算使用千金藤素后PC-9/IR細胞的IC50由43.56μmol/L下降至4.31μmol/L，其逆轉耐藥指數(shù)為10.11倍(見表2、圖1)。為了保證細胞的存活率，故選擇?？颂婺釢舛葹? μmol/L與8 μmol/L千金藤素共同處理PC-9/IR細胞。
表2 千金藤素對PC-9/IR細胞?？颂婺崦舾行缘淖饔?/p>
圖1 千金藤素對PC-9/IR細胞?？颂婺崦舾行缘淖饔?/p>
三、千金藤素聯(lián)合?？颂婺釋C-9/IR細胞凋亡的作用
與PC-9/IR組相比，千金藤素組、?？颂婺峤M細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與單用千金藤素組和?？颂婺峤M相比，千金藤素+埃克替尼組細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)；與千金藤素+埃克替尼組相比，3-MA組、PFT-α組細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)；見(圖2、表3)。
圖2 各組細胞凋亡檢測結果
表3 各組細胞凋亡率的比較
四、千金藤素聯(lián)合埃克替尼對PC-9/IR細胞中自噬的影響
與PC-9/IR組相比，千金藤素組、埃克替尼組細胞綠色熒光的平均光密度值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與千金藤素組和?？颂婺峤M相比，千金藤素+?？颂婺峤M細胞在細胞質和核周區(qū)顯示出綠點樣結構的增加，其代表成熟的自噬空泡，平均光密度顯著增加(P<0.05)；與千金藤素+埃克替尼組相比，3-MA組、PFT-α組綠色熒光的平均光密度明顯降低(P<0.05)；見(圖3、表4)。
圖3 各組細胞MDC染色結果(200×，400×)
表4 各組細胞自噬的自噬情況比較
五、各組細胞中自噬小體的形成情況
PC-9/IR組細胞顯示正常的細胞質、細胞核和細胞器，沒有自噬小體；千金藤素組和埃克替尼組可見少量具有雙層膜結構的自噬小體形成；千金藤素+?？颂婺峤M細胞中可見較多的自噬小體，某些自噬小體的液泡內還包含受損的細胞器，如線粒體和內質網(wǎng)；3-MA組和PFT-α組細胞中自噬小體的數(shù)量較千金藤素+?？颂婺峤M明顯減少(見圖4)。
圖4 各組細胞的超微結構變化(TEM，53000×)
六、各組細胞中自噬相關蛋白的表達
與PC-9/IR組相比，千金藤素組、?？颂婺峤M細胞中自噬相關蛋白的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與千金藤素組和埃克替尼組相比，千金藤素+?？颂婺峤M細胞p53、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達顯著增加，p-mTOR/mTOR的比值顯著降低(P<0.05)；與千金藤素+?？颂婺峤M相比，3-MA組、PFT-α組細胞p53、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達明顯降低，p-mTOR/mTOR的比值明顯升高(P<0.05)(見圖5，表5)。
圖5 各組細胞中自噬相關蛋白的表達
討 論
癌癥耐藥性是臨床治療中治療失敗和患者死亡的主要原因。因此，克服癌細胞的耐藥性已成為癌癥治療領域要解決的關鍵問題。近年來研究發(fā)現(xiàn)對EGFR-TKI具有高度抵抗力的細胞中，自噬并沒有被上調，而這些細胞與雷帕霉素(一種自噬的誘導劑)共同處理可以部分恢復對EGFR-TKI的敏感性[11]。Liu等[12]發(fā)現(xiàn)β-欖香烯能通過誘導自噬逆轉NSCLC細胞的吉非替尼耐藥性；YM155(一種survivin小分子抑制劑)可通過誘導自噬顯著增強厄洛替尼對EGFR-TKI耐藥的NSCLC細胞系H1650和A549的敏感性[13]。表明自噬的誘導可能是恢復對EGFR-TKI耐藥細胞敏感性的有效策略。
千金藤素在臨床主要用于白細胞減少癥，近年的研究發(fā)現(xiàn)其對多種腫瘤細胞的耐藥性有逆轉作用，如鼻咽癌多藥耐藥細胞CNE2/ADM、人類髓性白血病多柔比星耐藥細胞K562/ADR；并且其對腫瘤細胞的影響與自噬密切相關[14]。項福英等[8]發(fā)現(xiàn)千金藤素可能通過抑制PI3K/AKT/m TOR信號通路，增加SKOV3細胞內酸性自噬泡數(shù)量，誘導人卵巢癌SKOV3細胞自噬；張巖昊等[15]發(fā)現(xiàn)千金藤素能誘導線粒體自噬的增加，增強多柔比星抑制三陰性乳腺癌細胞增殖的活性，進而誘導細胞凋亡。本研究采用體外濃度梯度遞增的方法建立NSCLC細胞PC-9的?？颂婺崮退幖毎關C-9/IR，從自噬的角度考察千金藤素對PC-9/IR細胞耐藥性的作用；首先我們在細胞水平篩選千金藤素作用于PC-9/IR細胞的濃度，通過細胞毒性實驗發(fā)現(xiàn)當千金藤素的濃度低于8 μmol/L時對PC-9/IR細胞不產生明顯的抑制作用(抑制率<5%)，因此選擇此濃度作為后續(xù)耐藥性逆轉實驗中千金藤素的濃度。隨后我們將低毒劑量的千金藤素與不同濃度的埃克替尼共同作用于PC-9/IR細胞，通過細胞增殖情況來評價聯(lián)合用藥后PC-9/IR細胞對埃克替尼敏感性的變化，發(fā)現(xiàn)千金藤素與埃克替尼聯(lián)合用藥后，相比埃克替尼單獨用藥，PC-9/IR細胞的存活率顯著降低，PC-9/IR細胞的IC50由43.56μmol/L下降至4.31μmol/L，其逆轉耐藥指數(shù)為10.11倍，說明千金藤素能逆轉PC-9/IR細胞的?？颂婺崮退幮?。為了進一步探究千金藤素對PC-9/IR細胞的埃克替尼耐藥性的逆轉作用是否與自噬相關，我們采用透射電子顯微鏡和MDC染色觀察細胞自噬情況，發(fā)現(xiàn)千金藤素與?？颂婺崧?lián)合應用可顯著增加PC-9/IR細胞中自噬空泡和自噬小體的數(shù)量，促進細胞凋亡，而經過自噬抑制劑3-MA預處理的PC-9/IR細胞，自噬空泡和自噬小體的數(shù)量均減少，能降低千金藤素與?？颂婺崧?lián)合應用時對PC-9/IR細胞凋亡的促進作用；提示千金藤素逆轉PC-9/IR細胞的?？颂婺崮退幮耘c促進細胞自噬有關。但其具體通過何種途徑發(fā)揮作用，尚不清楚。
近年來研究表明，抑癌基因p53作為一種重要的轉錄因子，在細胞周期阻滯、凋亡中都發(fā)揮著重要作用；并且參與自噬活性的調節(jié)。約50%的晚期NSCLC病例中發(fā)生p53突變，導致腫瘤抑制功能喪失。重新激活突變型p53，從而誘導癌細胞凋亡是p53靶向治療的目標[16]。NSCLC組織中p53表達水平與細胞凋亡呈正相關[17]。Fan等[18]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可能通過p53介導的信號傳導途徑誘導NSCLC A549細胞凋亡和自噬；黃芩苷能通過激活p53途徑提高順鉑誘導的細胞凋亡和自噬以克服NSCLC的順鉑耐藥性[19]；重樓皂苷可上調p53，誘導caspase依賴性凋亡，并抑制mTOR信號傳導，進而抑制抗順鉑的人NSCLC細胞系A549/DDP細胞的增殖，誘導細胞凋亡和自噬[20]。另有研究發(fā)現(xiàn)異喹啉生物堿(包括千金藤素)是一種新型的AMPK激活劑可誘導耐藥性癌癥中的自噬細胞死亡[21]；Unson等[22]發(fā)現(xiàn)千金藤素是用于治療具有p53突變的結直腸癌患者的有前途的藥物；而且能夠上調p53蛋白表達，抑制肺癌A549細胞生長，促進其凋亡[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，千金藤素與?？颂婺崧?lián)合作用于PC-9/IR細胞時，可上調p53、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達，并抑制p-mTOR的表達，使用3-MA預處理的PC-9/IR細胞中p53的表達降低，而且p53抑制劑Pifithrin-α可減少千金藤素誘導的細胞凋亡和自噬；提示千金藤素可能通過上調p53的表達，誘導PC-9/IR細胞自噬，促進其凋亡。
綜上所述，千金藤素可能通過激活p53介導的自噬，逆轉PC-9/IR細胞的埃克替尼耐藥性。由于p53在自噬中的調控比較復雜，其對自噬的調控作用受細胞所處的環(huán)境和所受的壓力及其亞細胞定位的影響，其具體的作用機制有待進一步深入研究。
猜你喜歡
長絲鱸潰爛癥病原分離鑒定和耐藥性分析當代水產(2021年8期)2021-11-04 08:48:54 “千金”原來指男兒身小學閱讀指南·低年級版(2020年10期)2020-10-12 02:43:28 家庭影院技術(2019年7期)2019-08-27 02:42:22 嬰幼兒感染中的耐藥菌分布及耐藥性分析云南醫(yī)藥(2019年3期)2019-07-25 07:25:10 一鍵開啟智能影音室 ?？怂糤MS-C3家庭影院技術(2018年11期)2019-01-21 02:20:46 WHO：HIV耐藥性危機升級，普及耐藥性檢測意義重大中國生殖健康(2019年12期)2019-01-07 01:54:40 千金碎夢家教世界·創(chuàng)新閱讀(2015年6期)2015-05-30 00:57:42 千金醉琴科普童話·百科探秘(2014年12期)2014-11-26 09:18:34 基因組揭示結核桿菌耐藥性根源世界科學(2013年11期)2013-03-11 18:09:49 “第一千金”切爾西 等中外文摘(2010年17期)2010-09-21 03:22:52
劉然 邢爽 王璐 張怡 許保海
非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是最常見的肺癌形式，約占所有肺癌病例的85%，其五年生存率很低，僅為15%[1-2]?；瘜W療法和靶向療法顯著改善了患者的預后。然而，當癌細胞對藥物治療產生抗藥性時，一些患者會復發(fā)，這代表了重要的臨床局限性[3-4]。?？颂婺?Icotinib)是第一代表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor，EGFR)-酪氨酸激酶抑制劑(Tyrosine kinase inhibitor，TKI)，具有方便、高效、低毒的特點[5-6]，已被中國食品藥品監(jiān)督管理局(CDFA)批準為激活EGFR突變的NSCLC患者的一線治療藥物，但是幾乎所有接受治療的患者經過9～15個月無進展生存期后，都不可避免地出現(xiàn)耐藥性，導致治療失敗[7]。因此，深入探討EGFR-TKI耐藥肺癌細胞的作用機制，對于探索新的耐藥逆轉策略具有重要意義。千金藤素(Cepharanthine)是從中藥千金藤中提取的異喹啉生物堿，臨床主要用于白細胞減少癥，研究表明千金藤素在多種腫瘤中具有抗腫瘤活性和抗多藥耐藥的作用；可誘導人卵巢癌SKOV3細胞自噬，抑制細胞活力[8]；能逆轉人鼻咽癌多藥耐藥細胞CNE2/ADM的耐藥性[9]；與多柔比星聯(lián)合應用能逆轉人類髓性白血病細胞K562/ADR對多柔比星耐藥性[10]。但是千金藤素能否逆轉人NSCLC細胞的?？颂婺崮退幮赃€未可知，因此本研究旨在探討千金藤素對人NSCLC細胞的?？颂婺崮退幮缘挠绊懠翱赡艿淖饔脵C制。
資料與方法
一、實驗細胞
人NSCLC細胞PC-9(ATCC)購自上海冠導生物工程有限公司，貨號：DA-C5037。
二、藥物、儀器與試劑
胎牛血清(10099-141)、DMEM培養(yǎng)基(10569-010)(美國Gibco公司)，?？颂婺?浙江貝達藥業(yè)有限公司，國藥準字H20110061)，Pifithrin-α(PFT-α，p53抑制劑，上海信裕生物科技有限公司，貨號：XY-1816)，MTT試劑盒(C0009S)、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(C1062L)、RIPA裂解液(P0013B)、BCA試劑盒(P0010)(碧云天生物科技公司)，6-氨基-3-甲基嘌呤(3-MA，美國Sigma-Aldrich公司，貨號：M9281)；細胞自噬染色檢測試劑盒(MDC法)(南京森貝伽生物公司，貨號：SBJ-1661)，兔抗人p53(ab32389)、mTOR(ab32028)、p-mTOR(ab137133)、Beclin-1(ab207612)、LC3A/B(ab128025)、β-actin(ab8227)、山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab205718)(英國abcam公司)，細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)，IX73倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，H-7500透射電子顯微鏡(日本日立公司)，iMark680多功能酶標儀、蛋白轉膜裝置、BD FACSCanto Ⅱ流式細胞儀(美國Bio-Rad公司)。
三、細胞培養(yǎng)及NSCLC?？颂婺崮退幖毎鸓C-9/Icotinib resistance(IR)的建立
采用?？颂婺釢舛冗f增、不斷作用的方式誘導PC-9細胞耐藥。PC-9細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，取對數(shù)生長期PC-9細胞，用質量濃度為0.5 μmol/L的?？颂婺岽碳ぷ饔?4 h，然后換新鮮的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，直到細胞形態(tài)恢復到正常生長狀態(tài)，長滿培養(yǎng)皿后進行傳代，再用0.5 μmol/L的?？颂婺嶙饔?4h，反復換液、傳代，直至在同一濃度藥物作用下細胞生長不受影響，逐漸增加?？颂婺釢舛冗M行不斷篩選培養(yǎng)，直至PC-9細胞能在含濃度為20 μmol/L?？颂婺岬呐囵B(yǎng)基中穩(wěn)定存活，記為PC-9/IR耐藥細胞。
四、MTT法篩選千金藤素的實驗濃度
體外細胞實驗中所使用的千金藤素的濃度，以對PC-9/IR細胞不造成顯著生長抑制為標準，取該濃度范圍內的較高濃度為千金藤素濃度。具體操作為：取對數(shù)生長期PC-9/IR耐藥細胞，以2×103細胞/孔的濃度接種到96孔板中(邊緣孔用PBS填充)，待PC-9/IR耐藥細胞貼壁并鋪滿孔底后，棄去原培養(yǎng)基，加入含2、4、8、16、32 μmol/L千金藤素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48h后加入5 g/L MTT試劑20 μL；繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去上層清液后加入150μl的DMSO低速震蕩溶解10min；使用酶標儀檢測各組細胞在490 nm處的光密度(optic density，OD)值，計算細胞增殖抑制率。將不含細胞的培養(yǎng)基作為空白對照組。
細胞增殖抑制率=1-(實驗組OD-空白對照組OD)/(對照組OD-空白對照組OD)×100%
五、埃克替尼敏感性檢測
采用MTT法檢測：具體操作同1.2.2，固定千金藤素的濃度為8 μmol/L，取對數(shù)生長期PC-9/IR耐藥細胞接種到96孔板中，待PC-9/IR耐藥細胞貼壁并鋪滿孔底后，分組兩組：一組只用含0、1、2、4、8、16、32、64 μmol/L?？颂婺岬呐囵B(yǎng)基培養(yǎng)，不使用千金藤素；一組用含8 μmol/L千金藤素和不同濃度(0、1、2、4、8、16、32、64 μmol/L)的埃克替尼的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；培養(yǎng)48 h后，各孔加入5 g/L MTT試劑20 μL；繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清后加入150μL的DMSO；在490 nm處測定各組細胞的OD值，計算細胞存活率；并采用GraphPad軟件計算?？颂婺釋Ω鹘M細胞的半數(shù)抑制濃度(the half inhibitory concentration, IC50)和逆轉耐藥倍數(shù)(reverse fold, RF)=IR IC50/(IR+千金藤素)共同作用下IC50。
細胞存活率=(實驗組OD-空白對照組OD)/(對照組OD-空白對照組OD)×100%
六、細胞分組及處理
取對數(shù)生長期PC-9/IR耐藥細胞，按每孔2×106個接種于24孔板，分PC-9/IR組(正常培養(yǎng)的PC-9/IR耐藥細胞)、千金藤素組(PC-9/IR耐藥細胞+8 μmol/L千金藤素)、?？颂婺峤M(PC-9/IR耐藥細胞+20 μmol/L埃克替尼)、千金藤素+埃克替尼組(PC-9/IR耐藥細胞用含20 μmol/L?？颂婺岷? μmol/L千金藤素的培養(yǎng)基共同處理)、3-MA組(PC-9/IR耐藥細胞用5 mmol/L的3-MA預處理1 h，隨后用含20 μmol/L?？颂婺岷? μmol/L千金藤素的培養(yǎng)基共同處理)、PFT-α組(PC-9/IR耐藥細胞用40μmol/L的p53抑制劑Pifithrin-α預處理1 h再用含20 μmol/L埃克替尼和8 μmol/L千金藤素的培養(yǎng)基共同處理)，繼續(xù)培養(yǎng)48h，收集細胞進行后續(xù)實驗。
七、流式細胞術檢測細胞凋亡
取對數(shù)期生長的PC-9/IR細胞，按照1.2.4項下步驟進行分組及處理，培養(yǎng)48h后，將培養(yǎng)的細胞用0.25%胰蛋白酶進行消化處理，離心，去除上清液，PBS洗滌后將細胞以1×106細胞/mL的密度重懸，加入5 μL Annexin V-FITC、5 μL PI避光孵育15 min，按照FITC-Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒說明書步驟，使用流式細胞儀分析細胞凋亡率。
八、MDC染色檢測自噬
MDC是一種嗜酸性熒光染色劑，可選擇性標記酸性自噬泡，通常用作檢測自噬的特異性標記。細胞按照1.2.4項下步驟進行分組及處理，培養(yǎng)48h后，用MDC(50 μmol/L)在37℃下避光孵育15 min，PBS洗滌兩次，立即使用倒置熒光顯微鏡檢測并拍照。平均光密度值由Image-Pro Plus 6.0版計算得出。
九、透射電鏡觀察細胞超微結構變化
收集各組細胞并用PBS洗滌，然后立即浸入2.5%戊二醛中在4°C下固定30 mim。將樣品后固定在1%四氧化鋨中1h，然后在一系列梯度乙醇中脫水。切超薄切片(50nm)，用2.5%乙酸鈾酰和1%檸檬酸鉛染色。用透射電子顯微鏡觀察細胞自噬情況，并拍照。
十、Western blot檢測自噬相關蛋白表達
使用RIPA裂解液提取細胞中蛋白質。使用BCA試劑盒對蛋白質濃度進行定量。取等量蛋白質樣品上樣(30 μg/泳道)，10% SDS-PAGE分離蛋白質，并通過半干轉移將其轉移到PVDF膜上。將膜用5%脫脂牛奶封閉，并在4 ℃下與一抗(p53、mTOR、p-mTOR、Beclin-1、LC3A/B、β-actin，1∶1000)孵育過夜。第二天，將膜與偶聯(lián)辣根過氧化物酶的二抗孵育(1∶2000)2h，然后使用化學發(fā)光試劑盒(ECL)進行顯色。以β-actin為內參，分析結果。
十一、統(tǒng)計學方法
結 果
一、千金藤素的體外細胞實驗濃度
不同濃度的千金藤素能不同程度的抑制PC-9/IR細胞的生長(見表1)；千金藤素的濃度在2、4、8 μmol/L時對PC-9/IR細胞的抑制作用較弱，抑制率均低于5%。因此，選擇8 μmol/L的千金藤素作為后續(xù)實驗濃度。
表1 千金藤素對PC-9/IR細胞增殖的抑制作用
二、千金藤素對PC-9/IR細胞?？颂婺崦舾行缘淖饔?/p>
PC-9/IR細胞的存活率隨著?？颂婺釢舛鹊脑黾佣档停Ы鹛偎啬苊黠@增加PC-9/IR細胞對?？颂婺岬拿舾行?，經計算使用千金藤素后PC-9/IR細胞的IC50由43.56μmol/L下降至4.31μmol/L，其逆轉耐藥指數(shù)為10.11倍(見表2、圖1)。為了保證細胞的存活率，故選擇?？颂婺釢舛葹? μmol/L與8 μmol/L千金藤素共同處理PC-9/IR細胞。
表2 千金藤素對PC-9/IR細胞?？颂婺崦舾行缘淖饔?/p>
圖1 千金藤素對PC-9/IR細胞?？颂婺崦舾行缘淖饔?/p>
三、千金藤素聯(lián)合?？颂婺釋C-9/IR細胞凋亡的作用
與PC-9/IR組相比，千金藤素組、?？颂婺峤M細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與單用千金藤素組和?？颂婺峤M相比，千金藤素+埃克替尼組細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)；與千金藤素+埃克替尼組相比，3-MA組、PFT-α組細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)；見(圖2、表3)。
圖2 各組細胞凋亡檢測結果
表3 各組細胞凋亡率的比較
四、千金藤素聯(lián)合埃克替尼對PC-9/IR細胞中自噬的影響
與PC-9/IR組相比，千金藤素組、埃克替尼組細胞綠色熒光的平均光密度值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與千金藤素組和?？颂婺峤M相比，千金藤素+?？颂婺峤M細胞在細胞質和核周區(qū)顯示出綠點樣結構的增加，其代表成熟的自噬空泡，平均光密度顯著增加(P<0.05)；與千金藤素+埃克替尼組相比，3-MA組、PFT-α組綠色熒光的平均光密度明顯降低(P<0.05)；見(圖3、表4)。
圖3 各組細胞MDC染色結果(200×，400×)
表4 各組細胞自噬的自噬情況比較
五、各組細胞中自噬小體的形成情況
PC-9/IR組細胞顯示正常的細胞質、細胞核和細胞器，沒有自噬小體；千金藤素組和埃克替尼組可見少量具有雙層膜結構的自噬小體形成；千金藤素+?？颂婺峤M細胞中可見較多的自噬小體，某些自噬小體的液泡內還包含受損的細胞器，如線粒體和內質網(wǎng)；3-MA組和PFT-α組細胞中自噬小體的數(shù)量較千金藤素+?？颂婺峤M明顯減少(見圖4)。
圖4 各組細胞的超微結構變化(TEM，53000×)
六、各組細胞中自噬相關蛋白的表達
與PC-9/IR組相比，千金藤素組、?？颂婺峤M細胞中自噬相關蛋白的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與千金藤素組和埃克替尼組相比，千金藤素+?？颂婺峤M細胞p53、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達顯著增加，p-mTOR/mTOR的比值顯著降低(P<0.05)；與千金藤素+?？颂婺峤M相比，3-MA組、PFT-α組細胞p53、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達明顯降低，p-mTOR/mTOR的比值明顯升高(P<0.05)(見圖5，表5)。
圖5 各組細胞中自噬相關蛋白的表達
討 論
癌癥耐藥性是臨床治療中治療失敗和患者死亡的主要原因。因此，克服癌細胞的耐藥性已成為癌癥治療領域要解決的關鍵問題。近年來研究發(fā)現(xiàn)對EGFR-TKI具有高度抵抗力的細胞中，自噬并沒有被上調，而這些細胞與雷帕霉素(一種自噬的誘導劑)共同處理可以部分恢復對EGFR-TKI的敏感性[11]。Liu等[12]發(fā)現(xiàn)β-欖香烯能通過誘導自噬逆轉NSCLC細胞的吉非替尼耐藥性；YM155(一種survivin小分子抑制劑)可通過誘導自噬顯著增強厄洛替尼對EGFR-TKI耐藥的NSCLC細胞系H1650和A549的敏感性[13]。表明自噬的誘導可能是恢復對EGFR-TKI耐藥細胞敏感性的有效策略。
千金藤素在臨床主要用于白細胞減少癥，近年的研究發(fā)現(xiàn)其對多種腫瘤細胞的耐藥性有逆轉作用，如鼻咽癌多藥耐藥細胞CNE2/ADM、人類髓性白血病多柔比星耐藥細胞K562/ADR；并且其對腫瘤細胞的影響與自噬密切相關[14]。項福英等[8]發(fā)現(xiàn)千金藤素可能通過抑制PI3K/AKT/m TOR信號通路，增加SKOV3細胞內酸性自噬泡數(shù)量，誘導人卵巢癌SKOV3細胞自噬；張巖昊等[15]發(fā)現(xiàn)千金藤素能誘導線粒體自噬的增加，增強多柔比星抑制三陰性乳腺癌細胞增殖的活性，進而誘導細胞凋亡。本研究采用體外濃度梯度遞增的方法建立NSCLC細胞PC-9的?？颂婺崮退幖毎關C-9/IR，從自噬的角度考察千金藤素對PC-9/IR細胞耐藥性的作用；首先我們在細胞水平篩選千金藤素作用于PC-9/IR細胞的濃度，通過細胞毒性實驗發(fā)現(xiàn)當千金藤素的濃度低于8 μmol/L時對PC-9/IR細胞不產生明顯的抑制作用(抑制率<5%)，因此選擇此濃度作為后續(xù)耐藥性逆轉實驗中千金藤素的濃度。隨后我們將低毒劑量的千金藤素與不同濃度的埃克替尼共同作用于PC-9/IR細胞，通過細胞增殖情況來評價聯(lián)合用藥后PC-9/IR細胞對埃克替尼敏感性的變化，發(fā)現(xiàn)千金藤素與埃克替尼聯(lián)合用藥后，相比埃克替尼單獨用藥，PC-9/IR細胞的存活率顯著降低，PC-9/IR細胞的IC50由43.56μmol/L下降至4.31μmol/L，其逆轉耐藥指數(shù)為10.11倍，說明千金藤素能逆轉PC-9/IR細胞的?？颂婺崮退幮?。為了進一步探究千金藤素對PC-9/IR細胞的埃克替尼耐藥性的逆轉作用是否與自噬相關，我們采用透射電子顯微鏡和MDC染色觀察細胞自噬情況，發(fā)現(xiàn)千金藤素與?？颂婺崧?lián)合應用可顯著增加PC-9/IR細胞中自噬空泡和自噬小體的數(shù)量，促進細胞凋亡，而經過自噬抑制劑3-MA預處理的PC-9/IR細胞，自噬空泡和自噬小體的數(shù)量均減少，能降低千金藤素與?？颂婺崧?lián)合應用時對PC-9/IR細胞凋亡的促進作用；提示千金藤素逆轉PC-9/IR細胞的?？颂婺崮退幮耘c促進細胞自噬有關。但其具體通過何種途徑發(fā)揮作用，尚不清楚。
近年來研究表明，抑癌基因p53作為一種重要的轉錄因子，在細胞周期阻滯、凋亡中都發(fā)揮著重要作用；并且參與自噬活性的調節(jié)。約50%的晚期NSCLC病例中發(fā)生p53突變，導致腫瘤抑制功能喪失。重新激活突變型p53，從而誘導癌細胞凋亡是p53靶向治療的目標[16]。NSCLC組織中p53表達水平與細胞凋亡呈正相關[17]。Fan等[18]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可能通過p53介導的信號傳導途徑誘導NSCLC A549細胞凋亡和自噬；黃芩苷能通過激活p53途徑提高順鉑誘導的細胞凋亡和自噬以克服NSCLC的順鉑耐藥性[19]；重樓皂苷可上調p53，誘導caspase依賴性凋亡，并抑制mTOR信號傳導，進而抑制抗順鉑的人NSCLC細胞系A549/DDP細胞的增殖，誘導細胞凋亡和自噬[20]。另有研究發(fā)現(xiàn)異喹啉生物堿(包括千金藤素)是一種新型的AMPK激活劑可誘導耐藥性癌癥中的自噬細胞死亡[21]；Unson等[22]發(fā)現(xiàn)千金藤素是用于治療具有p53突變的結直腸癌患者的有前途的藥物；而且能夠上調p53蛋白表達，抑制肺癌A549細胞生長，促進其凋亡[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，千金藤素與?？颂婺崧?lián)合作用于PC-9/IR細胞時，可上調p53、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達，并抑制p-mTOR的表達，使用3-MA預處理的PC-9/IR細胞中p53的表達降低，而且p53抑制劑Pifithrin-α可減少千金藤素誘導的細胞凋亡和自噬；提示千金藤素可能通過上調p53的表達，誘導PC-9/IR細胞自噬，促進其凋亡。
綜上所述，千金藤素可能通過激活p53介導的自噬，逆轉PC-9/IR細胞的埃克替尼耐藥性。由于p53在自噬中的調控比較復雜，其對自噬的調控作用受細胞所處的環(huán)境和所受的壓力及其亞細胞定位的影響，其具體的作用機制有待進一步深入研究。
猜你喜歡
當代水產(2021年8期)2021-11-04 08:48:54
小學閱讀指南·低年級版(2020年10期)2020-10-12 02:43:28
云南醫(yī)藥(2019年3期)2019-07-25 07:25:10
家庭影院技術(2018年11期)2019-01-21 02:20:46
中國生殖健康(2019年12期)2019-01-07 01:54:40
家教世界·創(chuàng)新閱讀(2015年6期)2015-05-30 00:57:42
科普童話·百科探秘(2014年12期)2014-11-26 09:18:34
世界科學(2013年11期)2013-03-11 18:09:49
中外文摘(2010年17期)2010-09-21 03:22:52
