壯瑤藥生骨湯治療激素性股骨頭缺血性壞死的臨床療效評(píng)價(jià)及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機(jī)制初探

王偉偉　歐志學(xué)　章曉云　李時(shí)斌　周毅　李統(tǒng)

〔摘要〕 目的 運(yùn)用Meta分析對(duì)壯瑤藥生骨湯治療激素性股骨頭缺血性壞死的臨床療效進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)，并運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初探。方法 檢索相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)，時(shí)間從建庫(kù)至2021年1月，查找對(duì)象為生骨湯治療激素性股骨頭缺血性壞死的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)研究，采用RevMan 5.3軟件對(duì)納入文獻(xiàn)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)以及Meta分析。并運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選生骨湯成分、靶點(diǎn)以及激素性股骨頭缺血性壞死靶點(diǎn)，進(jìn)行映射，映射結(jié)果采用生物信息學(xué)進(jìn)行注釋，并運(yùn)用分子對(duì)接技術(shù)對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果 （1）共納入5篇文獻(xiàn)，394例患者，結(jié)果提示生骨湯可顯著提高臨床總有效率和綜合療效評(píng)分，降低患者空骨陷窩概率。（2）網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析得到活性成分40個(gè)，共有靶點(diǎn)94個(gè)，關(guān)鍵成分為木犀草素、去甲漢黃芩素、牽牛花色素、2’-羥基染料木素、染料木素，蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖以及關(guān)鍵蛋白模塊圖提示壯瑤藥生骨湯主要通過(guò)誘導(dǎo)SRC、VEGFA、MMP9、PLG、MAPK14等核心靶點(diǎn)起到治療作用。（3）GO、KEGG富集分析結(jié)果顯示，生骨湯通過(guò)以上關(guān)鍵核心靶點(diǎn)影響PI3K/Akt、HIF-1、MAPK等主要信號(hào)通路，集中調(diào)控蛋白水解、信號(hào)傳導(dǎo)、膠原分解代謝等生物過(guò)程來(lái)發(fā)揮治療激素性股骨頭缺血性壞死作用。（4）分子對(duì)接結(jié)果顯示，關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)結(jié)合能均小于參考值，具有較好結(jié)合活性。結(jié)論 壯瑤藥生骨湯能顯著提高激素性股骨頭缺血性壞死患者臨床總有效率和綜合療效評(píng)分，降低其空骨陷窩概率;其中木犀草素、去甲漢黃芩素、牽?；ㄉ?、2’-羥基染料木素、染料木素等為關(guān)鍵活性成分，通過(guò)調(diào)節(jié)新生血管生成、凝血系統(tǒng)以及骨細(xì)胞的增殖、凋亡、分化等達(dá)到治療效果。

〔關(guān)鍵詞〕 生骨湯;激素性股骨頭缺血性壞死;Meta分析;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);分子對(duì)接;壯瑤藥

〔中圖分類號(hào)〕R274? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.04.021

Evaluation of clinical efficacy and network pharmacology mechanism of Zhuangyao medicine Shenggu Decoction in the treatment of steroid-induced avascular necrosis of femoral head

WANG Weiwei OU Zhixue ZHANG Xiaoyun LI Shibin ZHOU Yi LI Tong

（1. Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning， Guangxi 530000， China;

2. Guilin Hospital of Traditional Chinese Medicine， Guilin， Guangxi 541002， China）

〔Abstract〕 Objective To systematically evaluate the clinical efficacy of Zhuangyao medicine Shenggu Decoction in the treatment of steroid-induced avascular necrosis of femoral head by Meta analysis， and to explore its mechanism of action by network pharmacology. Methods Relevant databases were searched from the establishment of the database to January 2021， to search for randomized controlled trials of Shenggu Decoction in the treatment of steroid-induced avascular necrosis of femoral head， and RevMan 5.3 software was used to evaluate the quality of the included literature as well as Meta analysis. Network pharmacology was used to screen the components， targets of Shenggu Decoction and targets of steroid-induced avascular

necrosis of femoral head， and mapped. The mapping results were annotated by bioinformatics， and verified by molecular

docking technology. Results （1） A total of 5 literatures and 394 patients were included. The results indicated that Shenggu Decoction could significantly improve the clinical total effective rate and comprehensive efficacy score， and reduce the probability of patients with empty bone lacuna. （2） Network pharmacology analysis obtained 40 active ingredients， there were 94 targets in total， and the key components were luteolin， norwogonin， morning glory， 2'-hydroxygenistein， and genistein. The protein-protein interaction network map and the key protein module map suggested Zhuangyao medicine Shenggu Decoction mainly plays a therapeutic role by inducing core targets such as SRC， VEGFA， MMP9， PLG， and MAPK14. （3） The results of GO and KEGG enrichment analysis showed that Shenggu Decoction affected major signaling pathways such as PI3K/Akt， HIF-1， and MAPK through the above key core targets， and centrally regulated biological processes such as proteolysis， signal transduction， and collagen catabolism to play a role in the treatment of steroid-induced avascular necrosis of femoral head. （4） Molecular docking results showed that the binding energies of key active ingredients and core targets were all lower than the reference value， indicating good binding activity. Conclusion Zhuangyao medicine Shenggu Decoction can significantly improve the clinical total effective rate and comprehensive efficacy score in patients with steroid-induced avascular necrosis of femoral head， and reduce the probability of empty bone lacuna; luteolin， norwogonin， morning glory， 2'-hydroxygenistein， and genistein are key active ingredients， which achieve therapeutic effects by regulating angiogenesis， coagulation system， and proliferation， apoptosis， and differentiation of bone cells.

〔Keywords〕 Shenggu Decoction; steroid-induced avascular necrosis of femoral head; Meta analysis; network pharmacology; molecular docking; Zhuangyao medicine

股骨頭壞死是一種臨床上常見(jiàn)的骨科疑難雜病，臨床上按照病因?qū)⑵浞譃閯?chuàng)傷性與非創(chuàng)傷性兩類，非創(chuàng)傷性多由激素過(guò)量使用以及飲酒過(guò)度所致[1]。相關(guān)研究表明[2]，廣西地區(qū)使用激素治療自身免疫性疾病從而導(dǎo)致激素性股骨頭缺血性壞死（steroid-induced avascular necrosis of femoral head， SANFH）的患者約占70.08%。其發(fā)病率、致殘率常年居高不下，醫(yī)療資源被大量浪費(fèi)，已嚴(yán)重拖累社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展[3]。而目前多采用手術(shù)治療，但手術(shù)治療存在費(fèi)用高、患者依從性差等問(wèn)題。因此，研究者逐漸將目光轉(zhuǎn)移至中醫(yī)藥領(lǐng)域。

中醫(yī)藥因其不良反應(yīng)少，臨床療效佳等優(yōu)勢(shì)，受到越來(lái)越多研究者的青睞。而壯瑤醫(yī)作為我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥的一個(gè)重要組成部分，其用藥大多采用本地藥材，且在臨床方面療效顯著，能降低醫(yī)療費(fèi)用和提高人民生活質(zhì)量。生骨湯是壯瑤醫(yī)治療SANFH的經(jīng)典方，具有補(bǔ)益肝腎、益髓生骨等作用[4]。其中主藥扶芳藤和松蘭補(bǔ)肝腎之虧虛，丟了棒和水田七消腫止痛、活血化瘀;大葉千斤拔、紅杜仲和雞血藤為佐，行補(bǔ)虛健骨之療效;四方藤調(diào)和藥性、舒經(jīng)活絡(luò)。該方雖然被廣泛應(yīng)用于SANFH治療，但其具體作用機(jī)制尚未明確，缺乏充分的循證依據(jù)。基于以上現(xiàn)狀，本研究采用Meta分析聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方式，在綜合評(píng)價(jià)壯瑤藥生骨湯治療SANFH療效的同時(shí)，對(duì)其潛在的作用機(jī)制進(jìn)行初步探索，為其臨床提供更為可靠的循證依據(jù)，也為其后期的實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1? Meta分析

1.1.1? 文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)? 文獻(xiàn)為國(guó)內(nèi)外公開(kāi)發(fā)表的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn);研究對(duì)象為SANFH患者;觀察組為生骨湯或常規(guī)治療+生骨湯，對(duì)照組為常規(guī)治療;有明顯的結(jié)局指標(biāo)，且數(shù)據(jù)完整。

1.1.2? 文獻(xiàn)排除標(biāo)準(zhǔn)? 文獻(xiàn)重復(fù)發(fā)表;關(guān)鍵信息無(wú)法獲得的文獻(xiàn);設(shè)計(jì)不嚴(yán)謹(jǐn)，文獻(xiàn)不完整;納入患者合并其他嚴(yán)重疾病，如惡性腫瘤、心血管疾病等;療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)不規(guī)范，治療結(jié)果未完整公布。

1.1.3? 相關(guān)指標(biāo)? 臨床總有效率、綜合療效評(píng)分、空骨陷窩率。

1.1.4? 文獻(xiàn)檢索策略? 相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)：中國(guó)知網(wǎng)、維普、萬(wàn)方、中國(guó)生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)、PubMed、Cochrane

Library、Embase、MEDLINE以及Web of Science。檢索方式：根據(jù)各數(shù)據(jù)庫(kù)檢索情況，通過(guò)主題詞聯(lián)合自由詞的方式進(jìn)行檢索。中文檢索關(guān)鍵詞為“生骨湯”“壯藥”“瑤藥”“激素性股骨頭缺血性壞死”，英文檢索關(guān)鍵詞為“Shenggu Decoction”“Zhuang Medicine”“Yao Medicine”“steroid-induced avascular necrosis of femoral head”。

1.1.5? 數(shù)據(jù)提取和文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)? 提取文獻(xiàn)相關(guān)信息為題目、作者、單位、年份、干預(yù)措施、治療療程和觀察指標(biāo)等。采用RevMan 5.3軟件對(duì)納入文獻(xiàn)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，內(nèi)容包括隨機(jī)序列產(chǎn)生、分配隱藏、對(duì)研究者或患者施加盲法、不完全結(jié)局?jǐn)?shù)據(jù)、其他偏倚。評(píng)價(jià)結(jié)果分為“低風(fēng)險(xiǎn)”“不清楚風(fēng)險(xiǎn)”“高風(fēng)險(xiǎn)”。以上內(nèi)容由兩名專業(yè)人員獨(dú)立匯總完成，當(dāng)出現(xiàn)不同意見(jiàn)時(shí)再增加一名專業(yè)人員同組討論后決定。

1.1.6? 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析? 利用RevMan 5.3軟件對(duì)納入研究進(jìn)行Meta分析，不能進(jìn)行Meta分析的則進(jìn)行描述性定性分析。二分類變量資料以95%可信區(qū)間（confidence interval， CI）比值比（odds ratio， OR）表示，連續(xù)性變量資料以95%CI標(biāo)準(zhǔn)化均值差（STD mean difference， SMD）表示。顯示異質(zhì)時(shí)，即P<0.1、I2≥50%，采用隨機(jī)效應(yīng)模型;顯示同質(zhì)時(shí)，即P>0.1，I2<50%，采用固定效應(yīng)模型。

1.2? 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

1.2.1? 生骨湯活性成分及靶點(diǎn)獲取? 利用TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）、BATMAN-TCM（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm）、DrugBank（https：//go.

drugbank.com/）和中藥與化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.chemcpd.csdb.cn/cmpref/main/tcm_introduce.asp）以及查閱文獻(xiàn)等方法收集生骨湯活性成分和相關(guān)靶點(diǎn)信息。TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)根據(jù)口服生物利用度（oral

bioavailability， OB）≥30%以及類藥性（drug-likeness， DL）≥0.18進(jìn)行篩選，其他數(shù)據(jù)庫(kù)和查閱文獻(xiàn)獲取到的活性成分則以Lipinski類藥五原則[5-6]，即分子量（MW<500），氫鍵供體數(shù)（Hdon<5），氫鍵受體數(shù)（Hacc<10），脂水分配系數(shù)（AlogP<5）和旋轉(zhuǎn)鍵（RBN<10）對(duì)其進(jìn)行篩選。通過(guò)PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索獲得的生骨湯活性成分的結(jié)構(gòu)式，未能搜索到的則收集其2D結(jié)構(gòu)圖，最后利用Swiss TargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.swisstargetprediction.ch/）進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)。

1.2.2? SANFH靶點(diǎn)篩選預(yù)測(cè)? 以“steroid-induced avascular necrosis of femoral head”為關(guān)鍵詞，利用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）對(duì)其相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行篩選。

1.2.3? 共同靶點(diǎn)篩選? 將兩者靶點(diǎn)經(jīng)Venn Diagram網(wǎng)站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）取交集，獲取兩者共同靶點(diǎn)并繪制韋恩圖。

1.2.4? 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析? 運(yùn)用Cytoscape 3.7.2構(gòu)建“中藥-活性成分-共有靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖;將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//string-db.org/cgi/input.pl），置信度得分設(shè)置為>0.9，隱藏游離蛋白進(jìn)行參數(shù)分析，結(jié)果導(dǎo)出后再導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2中構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction， PPI）網(wǎng)絡(luò)圖，運(yùn)用MCODE插件篩選關(guān)鍵蛋白模塊，參數(shù)設(shè)置：度值=2，節(jié)點(diǎn)得分=0.2，最大深度=100。

1.2.5? GO、KEGG富集分析? 運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//david.ncifcrf.gov）對(duì)導(dǎo)出數(shù)據(jù)進(jìn)行GO、KEGG富集分析，GO富集分析包括生物過(guò)程、分子功能和細(xì)胞組分;KEGG富集分析則直觀檢測(cè)共有靶點(diǎn)涉及的通路分布情況;最后通過(guò)微生信網(wǎng)站（http：//www.bioinformatics.com.cn/）將GO、KEGG富集結(jié)果可視化。

1.2.6? 分子對(duì)接? 根據(jù)“1.2.4”分析結(jié)果，取關(guān)鍵活性成分與核心蛋白運(yùn)用AutoDock vina 1.1.2軟件進(jìn)行分子對(duì)接。首先，在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.rcsb.org/）搜索關(guān)鍵蛋白3D結(jié)構(gòu)，使用PyMOL 1.7.2.1軟件移除關(guān)鍵蛋白中非蛋白分子和配體;通過(guò)PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)下載活性成分結(jié)構(gòu)并進(jìn)行優(yōu)化。使用AutoDock vina 1.1.2軟件進(jìn)行定位、殘基修補(bǔ)、水分子去除、添加氫原子和電荷并保存。以原配體所在位點(diǎn)作為關(guān)鍵蛋白活性口袋進(jìn)行分子對(duì)接，最后通過(guò)PyMOL 1.7.2.1軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1? Meta分析結(jié)果

2.1.1? 文獻(xiàn)檢索結(jié)果? 初步檢索得到中文文獻(xiàn)3584篇和英文文獻(xiàn)865篇，通過(guò)閱讀題目和查重后，剔除4434篇，剩中文文獻(xiàn)15篇和英文文獻(xiàn)0篇，根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行閱讀評(píng)估和剔除后，最終納入文獻(xiàn)5篇[7-11]。

2.1.2? 納入文獻(xiàn)基本特征? 納入5篇文獻(xiàn)均為中文文獻(xiàn)，共計(jì)5項(xiàng)研究和394例樣本，其中試驗(yàn)組199例和對(duì)照組195例，試驗(yàn)組干預(yù)措施均為生骨湯，對(duì)照組干預(yù)措施均為常規(guī)治療藥物。見(jiàn)表1。

2.1.3? 納入文獻(xiàn)偏倚分析評(píng)估? 本次研究納入文獻(xiàn)均提及“隨機(jī)”字樣，其中2篇文獻(xiàn)[7，11]采用隨機(jī)數(shù)字表法，評(píng)定為低風(fēng)險(xiǎn)，剩余3篇文獻(xiàn)[8-10]只描述為隨機(jī)，未明確隨機(jī)序列產(chǎn)生方法，故評(píng)定為不清楚風(fēng)險(xiǎn);本次研究納入文獻(xiàn)均未提及分配隱藏及盲法，故評(píng)定為不清楚風(fēng)險(xiǎn);所有納入文獻(xiàn)均有明確結(jié)局指標(biāo)，故評(píng)定為低風(fēng)險(xiǎn);所有納入文獻(xiàn)均未發(fā)現(xiàn)重復(fù)發(fā)表或發(fā)表偏倚，評(píng)定為低風(fēng)險(xiǎn);其他偏倚均未知，故評(píng)定為不清楚風(fēng)險(xiǎn)。見(jiàn)圖1。

2.1.4? 療效評(píng)價(jià)分析? （1）臨床總有效率：納入的5篇文獻(xiàn)[7-11]均提及臨床總有效率，結(jié)果提示各研究間具有同質(zhì)性（P=0.79，I2=0%），選擇固定效應(yīng)模型，OR=4.38（95%CI 2.15～8.89，P<0.000 01），提示生骨湯優(yōu)于仙靈骨葆膠囊，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2a。

（2）綜合療效評(píng)分：納入的5篇文獻(xiàn)中4篇[7-8，10-11]提及綜合療效評(píng)分，結(jié)果提示各研究間具有同質(zhì)性（P=0.57，I=0%），選擇固定效應(yīng)模型，SMD=3.89（95%CI 3.48～4.30，P<0.000 01），提示生骨湯優(yōu)于仙靈骨葆膠囊，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2b。

（3）空骨陷窩率：納入的5篇文獻(xiàn)中2篇[7，9]提及空骨陷窩率，結(jié)果提示各研究間具有同質(zhì)性（P=0.90，I=0%），選擇固定效應(yīng)模型，OR=0.16（95%CI 0.05～0.58，P=0.005），提示生骨湯優(yōu)于仙靈骨葆膠囊，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2c。

2.1.5? 發(fā)表偏倚? 繪制漏斗圖對(duì)生骨湯和仙靈骨葆膠囊在提高總有效率方面進(jìn)行偏倚分析，如圖所示，漏斗圖各散點(diǎn)呈不完全對(duì)稱，說(shuō)明存在發(fā)表偏倚的可能性。見(jiàn)圖3。

2.2? 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果

2.2.1? 藥物成分及相關(guān)靶點(diǎn)篩選? 通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)和查閱文獻(xiàn)，共得到生骨湯活性成分40個(gè)，活性成分靶點(diǎn)630個(gè)。

2.2.2? 疾病靶點(diǎn)篩選? 結(jié)果匯總后共得到SANFH相關(guān)靶點(diǎn)505個(gè)。

2.2.3? 潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果? 經(jīng)Venn Diagram網(wǎng)站得到共同靶點(diǎn)94個(gè)。見(jiàn)圖4a。

2.2.4? 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與結(jié)果分析? “中藥-活性成分-共同靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖見(jiàn)圖4b，通過(guò)Network Analyzer工具分析網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的度值。度值排前5位的靶點(diǎn)為雞肉瘤病毒基因（sarcoma gene， SRC）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A， VEGFA）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9， MMP9）、纖溶酶原（plasminogen， PLG）、絲裂原激活蛋白激酶14（mitogen-activated protein kinase 14， MAPK14）;排前5位的成分為木犀草素（luteolin）、去甲漢黃芩素（norwogonin）、牽?；ㄉ兀╬etunidin）、2’-羥基染料木素（2'-hydroxygenistein）、染料木素（genistein），具體活性成分信息見(jiàn)表2。將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行參數(shù)分析后，剩余83個(gè)核心蛋白，導(dǎo)出結(jié)果后接著導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2中構(gòu)建PPI圖，見(jiàn)圖4c，并通過(guò)Network Analyzer工具和MCODE插件篩選關(guān)鍵蛋白模塊，得到2個(gè)關(guān)鍵蛋白模塊，模塊1評(píng)分為7.714，模塊2評(píng)分為4.333，具體情況見(jiàn)圖4d。

2.2.5? GO、KEGG富集分析? 將83個(gè)核心靶點(diǎn)上傳至DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行GO、KEGG富集分析。GO富集分析共得到431個(gè)條目，其中細(xì)胞組分34個(gè)，生物過(guò)程307個(gè)，分子功能90個(gè)，顯示生骨湯治療SANFH主要與蛋白水解、信號(hào)傳導(dǎo)、膠原分解代謝過(guò)程等生物過(guò)程及蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP結(jié)合、鋅離子結(jié)合等分子功能密切相關(guān)，其過(guò)程涉及質(zhì)膜、細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞外泌體等細(xì)胞組分，見(jiàn)圖5。KEGG富集分析共得到73條通路，具體分布見(jiàn)圖6，排除與SANFH聯(lián)系不夠密切的通路，篩選出磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B， PI3K/Akt）、低氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1， HIF-1）、絲裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）等相關(guān)主要信號(hào)通路。

2.2.6? 分子對(duì)接結(jié)果? 根據(jù)“2.2.4”分析結(jié)果，分別取度值前5位的活性成分以及核心蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，并取結(jié)合能最低者進(jìn)行可視化，見(jiàn)表3、圖7，結(jié)果顯示，關(guān)鍵活性成分與核心蛋白的結(jié)合能均≤-5.0 kJ/mol[12]，且多數(shù)嵌入核心靶點(diǎn)活性口袋的疏水區(qū)，結(jié)合模式多以π-π作用和氫鍵為主，提示具有較好結(jié)合活性，其中染料木素能與MMP9上的LEU-188、LEU-222、LEU-243、ALA-189、VAL-223以及MIS-226殘基結(jié)合。

3 討論

近年來(lái)，隨著糖皮質(zhì)激素的廣泛應(yīng)用，SANFH的發(fā)病率也在逐年升高，其占比率在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死中高達(dá)51%[13-14]，已成為臨床上較為棘手的骨科疾病。SANFH的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，其中股骨頭血液循環(huán)中斷是目前最普遍認(rèn)可的發(fā)病機(jī)制。目前，西藥多采用增加纖溶、擴(kuò)張血管、抗凝與降脂藥物聯(lián)合使用，或?qū)⒃黾映晒桥c抑制破骨藥物聯(lián)合使用[15]。西藥治療通常只涉及一種或幾種作用機(jī)制，治療效果不穩(wěn)定。中醫(yī)治療則以整體觀為指導(dǎo)，強(qiáng)調(diào)早期診斷、早期治療以及病證結(jié)合，以求髖關(guān)節(jié)局部和整體穩(wěn)定[16]。在患者不同時(shí)期均需采用一定的補(bǔ)腎健骨中藥治療[17-19]，而生骨湯是壯瑤醫(yī)治療SANFH的經(jīng)驗(yàn)方，具有補(bǔ)益肝腎、益髓生骨、舒筋活絡(luò)、活血化瘀的作用，且療效顯著[7-11]。而本次Meta分析結(jié)果顯示，與常規(guī)用藥仙靈骨葆膠囊相比，生骨湯的療效更好，可顯著提高總有效率、綜合療效評(píng)分，并降低患者的空骨陷窩率。

基于Meta分析結(jié)果，本次研究進(jìn)一步通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)生骨湯治療SANFH的潛在作用機(jī)制進(jìn)行初步探索，發(fā)現(xiàn)木犀草素、去甲漢黃芩素、牽牛花色素、2’-羥基染料木素、染料木素為關(guān)鍵成分。木犀草素是一種黃酮類化合物，具有抗炎以及調(diào)節(jié)免疫的作用[20]。相關(guān)研究顯示[21]，木犀草素能通過(guò)STAT1/Caspase-3信號(hào)通路抑制去脫氧誘導(dǎo)的成骨凋亡激活。染料木素主要來(lái)源于廣豆根和金雀花等一些豆科植物，具有提取率高、成本低等特點(diǎn)[22]。而相關(guān)實(shí)驗(yàn)顯示[23]，染料木素可通過(guò)旁分泌刺激成骨細(xì)胞增殖、分化，進(jìn)而增強(qiáng)骨保護(hù)素蛋白質(zhì)分泌以及mRNA表達(dá)。

此外，本次研究還發(fā)現(xiàn)生骨湯治療SANFH的核心靶點(diǎn)為SRC、VEGFA、MMP9、PLG、MAPK14。PLG是纖溶系統(tǒng)的重要組成之一，激活后具有溶解血栓并抑制凝血的作用?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix

metalloproteinase， MMPs）是參與降解全身各種組織細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶家族，其中MMP2、MMP9在破骨細(xì)胞中大量表達(dá)，降解骨基質(zhì)相關(guān)有機(jī)物[24]。VEGFA是VEGF家族中常見(jiàn)的一位成員，具有促進(jìn)新生血管生成的作用[25]。VEGF與其激酶結(jié)構(gòu)域受體（Flt-1、Flt-4、KDR）特異性結(jié)合后，增加相關(guān)靜脈通透性來(lái)促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及炎性物質(zhì)滲出。而SRC是Src激酶家族的成員之一，近期有相關(guān)研究表明[26]，LPS通過(guò)TLR4通路觸發(fā)信號(hào)分子Src/Syk磷酸化，激活NF-κB和AP-1信號(hào)通路，從而影響炎性因子表達(dá)。血管發(fā)生炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致組織腫脹引起骨內(nèi)壓升高，而骨內(nèi)壓升高是SANFH的一個(gè)重要病因。綜上所述，生骨湯治療SANFH主要是通過(guò)調(diào)節(jié)新生血管生成、凝血系統(tǒng)以及骨吸收等相關(guān)途徑。

另外，本次研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt、HIF-1、MAPK等相關(guān)通路與生骨湯治療SANFH密切相關(guān)。PI3K/Akt通路主要參與細(xì)胞增殖、凋亡和分化[27]。Zou等[28]研究發(fā)現(xiàn)缺氧條件下，小鼠成骨細(xì)胞中PI3K-Akt信號(hào)通路受到抑制，最終導(dǎo)致成骨細(xì)胞凋亡。Liu等[29]研究發(fā)現(xiàn)，人多能干細(xì)胞分泌物可通過(guò)激活PI3K/Akt通路增強(qiáng)股骨頭內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞的成血管能力，維持股骨頭血供。HIF-1α信號(hào)通路在缺血/低氧環(huán)境下，對(duì)血管生成和骨形成起著十分重要的調(diào)節(jié)作用。相關(guān)研究表明低氧情況下，穩(wěn)定表達(dá)的HIF-1α蛋白能增高VEGF的表達(dá)來(lái)促進(jìn)血管生成[30]。Zhang等[31]研究也證實(shí)在低氧環(huán)境下，軟骨細(xì)胞HIF-1α、VEGF表達(dá)均升高，誘導(dǎo)血管生成來(lái)為骨生成帶來(lái)氧分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。MAPK通路在細(xì)胞生長(zhǎng)及細(xì)胞信息交流過(guò)程中起到十分重要的作用，其中p38-MAPK、ERK信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞凋亡，從而影響SANFH。p38通過(guò)磷酸化p53，影響活性氧簇在線粒體中的產(chǎn)生，將氧化應(yīng)激信號(hào)轉(zhuǎn)化為凋亡信號(hào)以促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡[32]。而ERK通路，則具有調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化增殖的作用，該通路被激活后，RUNX2、Ⅰ型膠原以及堿性磷酸酶表達(dá)水平會(huì)增高，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖[33]。

本次研究不足之處：（1）納入文獻(xiàn)只有5篇，且質(zhì)量有所欠缺;（2）納入文獻(xiàn)均為國(guó)內(nèi)研究;（3）網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究未將分析結(jié)果與成分含量相聯(lián)系，后續(xù)研究應(yīng)將兩者關(guān)系考慮在內(nèi)進(jìn)行分析;（4）此次研究搜索到松蘭、丟了棒的相關(guān)活性成分均未滿足篩選條件，望后續(xù)能完善相關(guān)成分研究。

本次研究運(yùn)用Meta分析和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進(jìn)行綜合分析，結(jié)果表明，生骨湯可顯著提高SANFH患者臨床總有效率、綜合療效評(píng)分，并降低其空骨陷窩率;而生骨湯主要是通過(guò)誘導(dǎo)調(diào)控相關(guān)靶點(diǎn)和信號(hào)通路，調(diào)節(jié)新生血管生成、凝血系統(tǒng)以及骨細(xì)胞的增殖、凋亡、分化來(lái)發(fā)揮治療作用。本研究一定程度上為壯瑤藥生骨湯治療SANFH提供了較為科學(xué)的循證依據(jù)，并分析了其內(nèi)在機(jī)制，這為傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究相結(jié)合提供了理論依據(jù)，也為今后臨床相關(guān)問(wèn)題的研究提供了系統(tǒng)的研究思維與模式。

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