痰TB DNA檢測(cè)對(duì)非空洞性肺結(jié)核診斷的臨床價(jià)值

鄧勇　　彭云　　鄧崢　　歐書強(qiáng)　　曾桃　　李朝亮　　陶學(xué)萍

[摘要] 目的 了解痰TB DNA在非空洞性結(jié)核中的診斷價(jià)值。 方法 按照入院時(shí)間順序，收集江西省萍鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院感染科2019年1—12月住院診斷為非空洞性肺結(jié)核患者的臨床資料100例，主要包括肺部CT結(jié)果、痰抗酸染色、TB DNA，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果 TB DNA的陽(yáng)性率為54%，痰抗酸染色的陽(yáng)性率為27%，兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=15.132，P<0.001），73例抗酸染色陰性患者中痰TB DNA陽(yáng)性31例，TB DNA陰性42例。27例抗酸染色陽(yáng)性患者中痰TB DNA陽(yáng)性24例，TB DNA陰性3例。 結(jié)論 痰TB DNA檢測(cè)在非空洞性肺結(jié)核中的診斷價(jià)值高于痰抗酸染色，值得臨床推廣，但也有一定的假陰性率，必要時(shí)可多次送檢。

[關(guān)鍵詞] TB DNA;肺結(jié)核;非空洞型;痰

[中圖分類號(hào)] R521? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2022）08-0070-03

Clinical value of sputum TB DNA detection in diagnosis of non-cavitary pulmonary tuberculosis

DENG Yong PENG Yun DENG Zheng OU Shuqiang ZENG Tao LI Chaoliang TAO Xueping

Department of Infectious Diseases， Pingxiang No.2 People′s Hospital， Pingxiang? ?337000，China

[Abstract] Objective? To investigate the diagnostic value of sputum TB DNA in non-cavitary tuberculosis. Methods? Clinical data of 100 patients with non-cavitary tuberculosis diagnosed in Department of Infectious Diseases， Pingxiang No.2 People′s Hospital from January to December 2019 were collected， according to the time sequence of admission. The data mainly included lung CT results， sputum acid-fast staining， and TB DNA. Statistical analysis was conducted. Results? The positive rate of TB DNA was 54%， and that of sputum acid-fast staining was 27%， with statistically significant difference （χ2=15.132， P<0.001）. Among the 73 patients with negative acid-fast staining， 31 patients were positive for sputum TB DNA and 42 patients were negative for TB DNA. Among the 27 patients with positive acid-fast staining， 24 patients were positive for sputum TB DNA and 3 patients were negative for TB DNA. Conclusion? The diagnostic value of sputum TB DNA detection is higher than that of sputum acid-fast staining in non-cavitary tuberculosis. It is worthy of clinical promotion. However， it has certain false negative rate. Samples should be submitted for multiple inspections if necessary.

[Key words] TB DNA; Tuberculosis; Non-cavitary type; Sputum

結(jié)核病是一種慢性傳染病，數(shù)百年來一直威脅著公眾健康，目前每年仍然有多達(dá)1000 萬人罹患結(jié)核病[1]，尤其是在發(fā)展中國(guó)家，而我國(guó)結(jié)核的疫情大部分地區(qū)成下降趨勢(shì)[2]，但仍不容忽視，尤其是老年和受教育程度低者[3]。結(jié)核病的臨床診斷程序既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力，傳統(tǒng)肺結(jié)核診斷依靠肺部影像學(xué)和痰抗酸染色進(jìn)行診斷，在非空洞性的肺結(jié)核中，影像學(xué)相對(duì)更難鑒別，痰抗酸染色陽(yáng)性率也更低，給臨床診治帶來諸多不便。而采用雙重實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)痰中結(jié)核分枝桿菌的核酸，可以明顯提高檢測(cè)的陽(yáng)性率。本文回顧性分析江西省萍鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院收治的100例非空洞性肺結(jié)核患者痰結(jié)核分枝桿菌脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）和痰抗酸染色結(jié)果，對(duì)其臨床意義進(jìn)行總結(jié)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年1—12月在萍鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院感染科住院臨床診斷為肺結(jié)核的病例，肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)參照國(guó)家衛(wèi)建委發(fā)布的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷[4]，根據(jù)入院時(shí)間先后順序、納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病例收集，共收集100例符合要求的病例，并詳細(xì)記錄各研究對(duì)象的臨床資料（姓名、年齡、性別、發(fā)病情況、肺部影像學(xué)結(jié)果、痰抗酸染色結(jié)果等）。其中，男83例、女17例，年齡15～87歲，平均（56.7±17.7）歲。所有入組對(duì)象均知情同意，并簽署知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有入選對(duì)象均具有典型的肺結(jié)核的影像學(xué)表現(xiàn)或影像學(xué)不典型但抗結(jié)核治療有效證實(shí)為肺結(jié)核;②檢測(cè)晨痰抗酸染色至少1次者;③經(jīng)過抗結(jié)核治療后1～3個(gè)月后肺部病灶吸收，且隨訪1年后肺部病灶穩(wěn)定或纖維化;④順利規(guī)范隨訪1年者。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并AIDS、乙型病毒性肝炎、腎功能不全、任何部位腫瘤者;②肺結(jié)核病灶影像學(xué)表現(xiàn)不典型者;③因出現(xiàn)藥物不良反應(yīng)等原因未順利完成抗結(jié)核治療療程者;④隨訪過程中因患者死亡等任何因素導(dǎo)致失訪者。

1.2 方法

所有受檢者入院第2天清晨在漱口后咳出的深部痰分裝在兩個(gè)一次性帶蓋痰液杯子中，分別送檢痰抗酸染色和痰結(jié)核分枝桿菌核酸（pulmonary tuberculosis deoxyribonucleic acid，TB DNA），然后第2、3天用同樣的方法取得痰液標(biāo)本進(jìn)行送檢兩次痰抗酸染色。其中抗酸染色使用冷染法檢測(cè)，TB DNA采用熒光定量PCR檢測(cè)。

1.3 痰TB DNA檢測(cè)流程

1.3.1 DNA提取? 取出陰性質(zhì)控品，8000 rmp離心數(shù)秒，吸50 μl至0.5 ml滅菌離心管中，加入50 μl DNA提取液中充分混勻，100℃恒溫處理10 min，12 000 rmp離心5 min，備用。

1.3.2 標(biāo)本處理? 向痰液玻璃管中加入4倍體積的4%NaOH，搖勻，室溫放置15～30 min待液化;取液化后標(biāo)本1.0 ml至1.5 ml離心管，12 000 rmp離心5 min。去上清，沉淀加滅菌生理鹽水1 ml混勻，12 000 rmp離心5 min，重復(fù)1次。去上清，沉淀加入50 μl DNA提取液中充分混勻，100℃恒溫處理10 min，12 000 rmp離心5 min，備用。

1.3.3 PCR擴(kuò)增? 按比例（TB-PCR反應(yīng)液40 μl/人份+Tap酶3 μl/人份）取相應(yīng)的PCR反應(yīng)液及Taq酶，充分混勻后按43 μl/管分裝至0.2 ml離心管中，備用。向準(zhǔn)備好試劑的0.2 ml試劑管中，分別加入處理后的樣品（包括標(biāo)本、陰性質(zhì)控品/臨界陽(yáng)性質(zhì)控品和強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品）上清液2 μl，或直接加入陽(yáng)性定量參考品2 μl，8000 rpm離心數(shù)秒，放入儀器樣品槽。

1.3.4 編輯? 按對(duì)應(yīng)順序設(shè)置陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性定量參考品及未知標(biāo)本，并在Name欄中設(shè)置樣品名稱，選中所有設(shè)置樣品孔，點(diǎn)擊工具欄中P鍵，選擇PRI primer l后關(guān)閉窗口。

1.3.5 結(jié)果分析? 在Analysis菜單下選擇Analyze自動(dòng)分析結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 痰抗酸染色與TB DNA的陽(yáng)性率比較

總共納入100例非空洞性肺結(jié)核，其中痰抗酸染色陽(yáng)性27例，陽(yáng)性率27.00%，其中只有6例為三次痰抗酸染色均陽(yáng)性，其余均為多次痰抗酸染色中1～2次為陽(yáng)性，TB DNA陽(yáng)性54例，陽(yáng)性率54.00%，兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=15.132，P<0.001）。

2.2 痰抗酸染色陰性患者中TB DNA陽(yáng)性情況

73例痰抗酸染色陰性患者中痰TB DNA陽(yáng)性31例，TB DNA陰性42例。27例抗酸染色陽(yáng)性患者中痰TB DNA陽(yáng)性24例，TB DNA陰性3例。見表1。

2.3 TB DNA陽(yáng)性患者中痰抗酸染色情況

54例TB DNA陽(yáng)性的患者中TB DNA數(shù)值與抗酸染色陽(yáng)性情況：TB DNA≤104拷貝的TB DNA陽(yáng)性例數(shù)為22例，痰抗酸染色陽(yáng)性例數(shù)為5例，抗酸染色陽(yáng)性率9.26%，TB DNA在104到105拷貝之間TB DNA陽(yáng)性例數(shù)為9例，痰抗酸染色陽(yáng)性例數(shù)為3例，抗酸染色陽(yáng)性率14.81%，TB DNA在105～106拷貝之間TB DNA陽(yáng)性例數(shù)為9例，痰抗酸染色陽(yáng)性例數(shù)為5例，抗酸染色陽(yáng)性率24.07%，TB DNA>106拷貝的TB DNA陽(yáng)性例數(shù)為14例，痰抗酸染色陽(yáng)性例數(shù)為10例，抗酸染色陽(yáng)性率42.59%。見表2。

2.4 不同年齡段TB DNA陽(yáng)性情況

根據(jù)患者年齡情況分析，≤60歲患者中TB DNA陽(yáng)性例數(shù)為30例，>60歲患者TB DNA陽(yáng)性例數(shù)為24例，兩者TB DNA陽(yáng)性率相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.015，P=0.904）。見表3。

3 討論

肺結(jié)核是呼吸系統(tǒng)常見的一種疾病，主要是因?yàn)楦腥窘Y(jié)核分枝桿菌后引發(fā)，肺結(jié)核可引起咳嗽、咳痰、咯血、消瘦、盜汗等臨床癥狀。但病灶不僅局限于肺部，也可以侵襲淋巴結(jié)、骨骼系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等，侵犯神經(jīng)系統(tǒng)可引起結(jié)核性腦膜炎，可導(dǎo)致患者頭痛、嘔吐、意識(shí)喪失等[5]。部分肺結(jié)核患者由于存在咳嗽的痰液未吐出，而是咽入胃部，在胃部未被消化液消化的結(jié)核桿菌可進(jìn)入腸道引起腸結(jié)核。傳統(tǒng)肺結(jié)核診斷主要依賴于肺部影像學(xué)表現(xiàn)、臨床表現(xiàn)和抗酸染色。但實(shí)際上，肺結(jié)核的影像學(xué)表現(xiàn)并不會(huì)像教材中描述的那樣典型（表現(xiàn)為病變多發(fā)生在上葉的尖后段和下葉的背段，密度不均勻、邊緣較清楚和變化較慢，易形成空洞和播散病灶），而是出現(xiàn)多種表現(xiàn)，甚至表現(xiàn)為間質(zhì)性肺炎的磨玻璃樣改變，臨床上不可避免地易導(dǎo)致誤診、誤治的情況發(fā)生[6-7]，即便是高分辨率CT在痰菌陰性的肺結(jié)核中診斷的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值僅約60%[8]，因此，肺結(jié)核的診斷不能依舊停留在影像學(xué)層面[9]。2015年，世界衛(wèi)生組織批準(zhǔn)了雄心勃勃的“消滅結(jié)核病”計(jì)劃，目標(biāo)是到2035年將結(jié)核病發(fā)病率降低90%，結(jié)核病死亡率降低95%。為了結(jié)束全球結(jié)核病流行，必須改進(jìn)診斷措施，提高肺結(jié)核確診率，并針對(duì)弱勢(shì)群體進(jìn)行有效監(jiān)測(cè)。

在病原學(xué)診斷方面，臨床上常采用痰抗酸染色和痰培養(yǎng)法，痰抗酸染色操作簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉，但受主觀因素影響等原因，其陽(yáng)性率低，敏感性低，容易造成誤診、誤治。而痰培養(yǎng)周期長(zhǎng)，雖然經(jīng)過改良后現(xiàn)在的手段可以縮短周期，但目前還未能廣泛應(yīng)用，無法滿足臨床需求，尤其是對(duì)于危重患者，如果等待培養(yǎng)結(jié)果再進(jìn)行治療的話，則病情將無法得到控制，因此，往往僅適用于疾控中心對(duì)耐藥的監(jiān)測(cè)及實(shí)驗(yàn)室研究。本研究對(duì)江西省萍鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院臨床診斷為肺結(jié)核且影像學(xué)為非空洞性的肺結(jié)核患者進(jìn)行3次痰抗酸染色和痰TB DNA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)3次送檢痰抗酸染色的累計(jì)陽(yáng)性率僅為27.00%，而送檢1次的痰TB DNA的陽(yáng)性率為54.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示痰TB DNA的陽(yáng)性率明顯高于痰抗酸染色[10]，對(duì)于痰TB DNA陰性的患者進(jìn)行多次送檢將進(jìn)一步提高痰TB DNA的陽(yáng)性率，且痰TB DNA檢測(cè)結(jié)果在數(shù)小時(shí)內(nèi)就可出結(jié)果，有助于臨床的早期診斷。另外，可以對(duì)臨床懷疑存在耐藥的患者進(jìn)行TB DNA的標(biāo)本基因測(cè)序，根據(jù)耐藥基因序列從而檢測(cè)出是否存在耐藥。其中73例痰抗酸染色陰性患者中痰TB DNA陽(yáng)性例數(shù)為31例，而在27例痰抗酸染色陽(yáng)性患者中痰TB DNA陰性例數(shù)為3例，說明痰TB DNA也存在假陰性情況[11]，不排除與痰液送檢標(biāo)本情況有關(guān)，因此，必要時(shí)也可考慮再次或多次送檢痰TB DNA檢測(cè)以提高陽(yáng)性率。對(duì)54例TB DNA陽(yáng)性的患者分析發(fā)現(xiàn)，31例痰TB DNA滴度<105 copies/ml的患者中痰抗酸染色陽(yáng)性例數(shù)為8例，陽(yáng)性率為25.80%，提示在低滴度TB DNA的痰液標(biāo)本中絕大部分痰抗酸染色均為陰性，僅在高滴度TB DNA的痰液標(biāo)本中才能顯示出陽(yáng)性結(jié)果，痰抗酸染色陽(yáng)性率低，尤其是在結(jié)核桿菌滴度低的情況下。根據(jù)年齡大小，以60歲為界限進(jìn)行年齡分組進(jìn)行組內(nèi)分析發(fā)現(xiàn)，在>60歲組和≤60歲組中TB DNA陽(yáng)性率無明顯差異，提示痰TB DNA陽(yáng)性情況與年齡大小可能無相關(guān)性。但由于痰抗酸染色價(jià)格低廉，仍廣泛用于臨床，因此，在考慮經(jīng)濟(jì)因素影響情況下（當(dāng)然，實(shí)際上目前TB DNA價(jià)格也非常低），建議對(duì)痰抗酸染色陰性的患者，如果臨床考慮結(jié)核或普通抗生素治療效果欠佳又存在肺部病灶的患者，有必要行痰TB DNA檢測(cè)甚至多次檢測(cè)以提高結(jié)核病的診斷陽(yáng)性率。

當(dāng)然，PCR檢測(cè)TB DNA也存在部分缺點(diǎn)，如不能區(qū)分檢測(cè)標(biāo)本中的擴(kuò)增信號(hào)是來源于死菌還是活菌，對(duì)于已經(jīng)抗結(jié)核治療后的肺結(jié)核，如果肺內(nèi)仍存在已經(jīng)死亡的結(jié)核桿菌，咳出的痰液標(biāo)本經(jīng)PCR檢測(cè)TB DNA仍可得出陽(yáng)性結(jié)果，因此對(duì)病情的判斷尤其是已經(jīng)使用了能夠殺死結(jié)核桿菌的抗菌藥物后，應(yīng)結(jié)合臨床治療情況以及其他輔助檢查結(jié)果進(jìn)行綜合判斷[12]。另外，部分肺結(jié)核患者不存在咳嗽、咳痰，可以通過支氣管鏡灌洗獲取肺泡灌洗液檢測(cè)TB DNA，目前本研究人員已在多例無咳嗽、咳痰且肺部病灶不典型的患者的肺泡灌洗液中檢測(cè)出TB DNA陽(yáng)性，包括也有研究者發(fā)現(xiàn)在胸水等漿膜腔積液及患者的血液中檢測(cè)到TB DNA陽(yáng)性[13-14]。

綜上所述，痰TB DNA的陽(yáng)性率在非空洞性肺結(jié)核患者中的陽(yáng)性率明顯高于痰抗酸染色，操作性方便，易于臨床開展，有助于臨床的早期診斷，值得臨床推廣。但也存在一定的假陰性情況，必要時(shí)可多次送檢，或者聯(lián)合其他檢測(cè)手段如肺泡灌洗液、X-Pert、TB RNA等有助于進(jìn)一步提高陽(yáng)性率[15-20]。

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（收稿日期：2021-03-15）