■張小雨 高 彬 徐田田 韓敏禎 李松林，4 呂利群，4 許 丹，4* 劉興旺

（1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2.上海海洋大學(xué)國(guó)家水生動(dòng)物病原體采集中心，上海 201306；3.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖部淡水水生遺傳資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；4.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306；5.上海牧漁科技有限公司，上海 201306）

大口黑鱸（Micropterus salmoides），屬鱸形目、太陽(yáng)魚科、黑鱸屬，因其肉質(zhì)肥美、適應(yīng)能力強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快等特點(diǎn)成為我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖品種[1]。作為一種典型的肉食性魚類，該魚配合飼料開(kāi)發(fā)過(guò)程有一定難度[2]，其人工配合飼料形式一般是軟顆粒飼料與膨化顆粒飼料[3]，且人工飼料配方在營(yíng)養(yǎng)水平和飼料參數(shù)方面仍有不足[4]。研究顯示，大口黑鱸對(duì)飼料碳水化合物利用能力十分低下[5-6]，飼料淀粉種類[7]、可消化淀粉水平[8]都會(huì)對(duì)大口黑鱸造成影響。最新研究表明，當(dāng)飼料淀粉超過(guò)5%就會(huì)抑制大口黑鱸生長(zhǎng)并造成氧化應(yīng)激[9]，且大口黑鱸生長(zhǎng)及飼料利用隨飼料碳水化合物水平升高而呈線性下降，在攝食后易出現(xiàn)肝臟病變，生長(zhǎng)緩慢和疾病頻發(fā)等不良問(wèn)題[10]。

大口黑鱸對(duì)碳水化合物的低利用率成為限制其配合飼料開(kāi)發(fā)推廣最重要原因之一。作為膨化配合飼料黏結(jié)及膨化成分，淀粉在飼料中添加使用是不可缺少的，因此碳水化合物引起大口黑鱸“肝糖應(yīng)激”及對(duì)肝糖應(yīng)激導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)進(jìn)行調(diào)控，從而改善大口黑鱸在攝食人工配合飼料后的健康狀態(tài)已成為相關(guān)研究熱點(diǎn)[2]。針對(duì)肉食性魚類肝糖應(yīng)激，一種以桑葉黃酮及栗木單寧為主要原料并復(fù)配若干功能性氨基酸的新型植物提取物添加劑被研究應(yīng)用。在前期研究中發(fā)現(xiàn)新型植物提取物添加劑具有消除肝糖應(yīng)激導(dǎo)致的魚類炎癥因子及促進(jìn)生長(zhǎng)等作用。本研究以大口黑鱸為研究對(duì)象，分別添加不同梯度新型植物提取物添加劑以評(píng)估其對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)、抗氧化及糖代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼料配制

以進(jìn)口魚粉、玉米蛋白粉、棉籽蛋白、豆粕等為主要蛋白源，魚油、豆油為主要脂肪源，α-淀粉等為主要糖源，配制基礎(chǔ)飼料。在基礎(chǔ)飼料中分別添加0[S1組（對(duì)照組）]、1 500 mg/kg（S2組）和3 000 mg/kg（S3組）的新型植物提取物添加劑（購(gòu)自廣州飛禧特生物科技有限公司，主要成分：桑葉黃酮65%、單寧酸30%、功能性氨基酸5%），配制成3 組等氮等能的試驗(yàn)飼料（見(jiàn)表1）。各飼料原料經(jīng)粉碎過(guò)篩后，按照配方稱取并攪拌混勻，制成直徑為2 mm 的顆粒飼料，風(fēng)干后4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗(yàn)飼料配方及營(yíng)養(yǎng)水平（%，干物質(zhì)）

1.2 試驗(yàn)用魚及養(yǎng)殖管理

養(yǎng)殖試驗(yàn)在鹽城恒興飼料有限公司淡水魚養(yǎng)殖車間進(jìn)行。挑選初始體質(zhì)量（7.50±0.23）g的幼魚225尾，隨機(jī)分為3組，每組3個(gè)平行，每個(gè)平行25尾魚，分別放入9個(gè)循環(huán)系統(tǒng)箱（70 cm×90 cm×80 cm）中。養(yǎng)殖試驗(yàn)持續(xù)8 周，每天投喂2 次，表觀飽食投喂，每天記錄各養(yǎng)殖桶的投喂克數(shù)。每天吸污換水（換水量不超過(guò)水體1/3）確保水質(zhì)，24 h 連續(xù)充氣增氧，期間水溫25～30 ℃。

1.3 樣品收集

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束前禁食24 h，統(tǒng)計(jì)每個(gè)養(yǎng)殖桶的魚尾總數(shù)和總重量。每個(gè)養(yǎng)殖桶隨機(jī)抽取9 尾魚，3 尾魚裝入自封袋保存放在-20 ℃冰箱，用于體成分測(cè)定；6尾魚進(jìn)行尾靜脈取血，靜置后離心（3 000 r/min，10 min，4 ℃）取上層血漿，加入100 μL 2%草酸鉀，分裝到離心管中置于-80 ℃待測(cè)。取血后，立即將鱸魚解剖，取肝臟組織裝入凍存管保存到-80 ℃冰箱中用于相關(guān)酶活性、基因表達(dá)量的測(cè)定。

1.4 指標(biāo)測(cè)定及分析方法

1.4.1 生長(zhǎng)指標(biāo)的計(jì)算方法

存活率（SR，%）=（試驗(yàn)結(jié)束時(shí)試驗(yàn)魚數(shù)目/試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)試驗(yàn)魚數(shù)目）×100

增重率（WGR，%）=(終末體重-初始體重)/初始體重×100

特定生長(zhǎng)率（SGR，%/d）=[ln（終末體重）-ln（初始體重）]/試驗(yàn)天數(shù)×100

飼料系數(shù)（FCR）=耗料量/（終末體重-初始體重）

1.4.2 飼料和魚體組成常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定

水分含量采用105 ℃烘箱干燥法（GB 5009.3—2016）測(cè)定；粗脂肪含量采用索氏抽提法（GB 5009.6—2016）測(cè)定；粗蛋白含量采用凱氏定氮法（GB 5009.5—2016）測(cè)定；粗灰分含量采用馬弗爐灼燒法（550 ℃）（GB 5009.4—2016）測(cè)定。

1.4.3 血漿生化指標(biāo)測(cè)定

取保存于-80 ℃的血漿，4 ℃冰箱解凍。檢測(cè)血糖（GLU）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、總蛋白（TP）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）和白蛋白（ALB）含量，GLU含量采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定，TC、TG、TP、LDL、HDL 和ALB 含量使用南京建成生物工程研究所有限公司試劑盒測(cè)定。

1.4.4 肝臟酶活性指標(biāo)測(cè)定

取保存于-80 ℃的肝臟，4 ℃冰箱解凍，濾紙吸干表面血液和水分，以生理鹽水為勻漿介質(zhì)按照1：9的比例制成組織勻漿液，3 000 r/min 冷凍離心（4 ℃）10 min，取上清液用于過(guò)氧化氫酶（CAT）和總超氧化物歧化酶（T-SOD）測(cè)定。CAT 使用北京索萊寶科技有限公司檢測(cè)試劑盒測(cè)定，T-SOD使用南京建成生物工程研究所有限公司試劑盒測(cè)定。

1.4.5 抗氧化及糖代謝相關(guān)基因表達(dá)量

肝臟總RNA 參照Trizol 試劑盒（Invitrogen，USA）提取，提取肝臟樣品中的總RNA。然后利用Prime?ScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄后檢測(cè)cDNA濃度并用DEPC水稀釋到200 ng/μL。分裝后置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。利用已有的目的基因白?xì)胞介素10（Interleukin-10，IL-10）、白細(xì)胞介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子α（Tu?mor necrosis factor α，TNF-α）、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α（Peroxisome proliferators-activated receptor α，PPARα）、脂肪酸合酶（Fatty acid synthase，F(xiàn)AS）、葡萄糖激酶（GK）、己糖激酶（HK）、丙酮酸激酶（PK）、6磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDH）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）和葡萄糖6磷酸酶（G6Pase）的引物序列合成引物，引物序列如表2所示。定量PCR體系為20 μL，其中2×SYBR Green qPCR Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 1 μL和7 μL超純水。定量?jī)x器為實(shí)時(shí)定量PCR 儀（Bio-Rad CFX96）。實(shí)時(shí)定量PCR 程序?yàn)?4 ℃持續(xù)3 min；94 ℃持續(xù)15 s，退火溫度58 ℃持續(xù)15 s，72 ℃持續(xù)20 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。得到各基因的Ct值，并根據(jù)2-??Ct方法測(cè)定目的基因的表達(dá)量。

表2 大口黑鱸抗氧化和糖代謝相關(guān)基因的實(shí)時(shí)定量PCR引物

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 17.0（SPSS Incorporation，USA）統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），若差異顯著（P<0.05），組間比較采用最小顯著差法（LSD）進(jìn)行多重比較分析。數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 新型植物提取物添加劑對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)性能的影響（見(jiàn)表3）

如表3所示，經(jīng)過(guò)8周的生長(zhǎng)試驗(yàn)，試驗(yàn)組大口黑鱸增重率（WGR）和存活率均顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。飼料系數(shù)（FCR）則呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)（P<0.05）。

表3 新型植物提取物添加劑對(duì)大口黑鱸幼魚生長(zhǎng)性能的影響

2.2 新型植物提取物添加劑對(duì)大口黑鱸體組成的影響（見(jiàn)表4）

如表4所示，在本試驗(yàn)條件下，大口黑鱸體組織水分、粗蛋白、粗脂肪和灰分含量各組間沒(méi)有顯著差異（P>0.05），但粗蛋白、粗脂肪有隨著新型植物提取物添加劑添加呈升高的趨勢(shì)。

表4 新型植物提取物添加劑對(duì)大口黑鱸幼魚體成分的影響（%）

2.3 新型植物提取物添加劑對(duì)大口黑鱸血漿生化指標(biāo)的影響（見(jiàn)表5）

表5 新型植物提取物添加劑對(duì)大口黑鱸血漿生化指標(biāo)的影響

如表5所示，血漿總蛋白（TP）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）隨著新型植物提取物添加劑添加而升高，高水平添加組（S3）顯著高于對(duì)照組和低水平添加組（P<0.05）；低密度脂蛋白（LDL）和白蛋白（ALB）S3組顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。

2.4 新型植物提取物添加劑對(duì)大口黑鱸肝臟抗氧化能力的影響（見(jiàn)表6）

由表6 可知，在本試驗(yàn)條件下，大口黑鱸肝臟超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）活性隨著新型植物提取物添加劑添加量升高顯著下降（P<0.05）。

表6 新型植物提取物添加劑對(duì)大口黑鱸肝臟抗氧化酶活性的影響(U/mg prot.)

2.5 新型植物提取物添加劑對(duì)大口黑鱸肝臟炎癥因子及腫瘤壞死因子基因表達(dá)的影響（見(jiàn)圖1）

圖1 新型植物提取物添加劑對(duì)大口黑鱸肝臟炎癥相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖1 可知，肝臟炎癥因子白細(xì)胞介素IL-10 和IL-1β在1 500 mg/kg 添加組表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05），腫瘤壞死因子α（TNF-α）的表達(dá)在3 000 mg/kg新型植物提取物添加劑添加組顯著下調(diào)（P<0.05）。

2.6 新型植物提取物添加劑對(duì)大口黑鱸糖脂代謝基因表達(dá)的影響（見(jiàn)圖2～圖3）

圖2 新型植物提取物添加劑對(duì)大口黑鱸肝臟相關(guān)脂肪代謝基因相對(duì)表達(dá)量的影響

如圖2、圖3 可知，在本試驗(yàn)條件下，肝臟過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）、脂肪酸合酶（FAS）表達(dá)量在S2 組顯著上調(diào)（P<0.05）。肝臟葡萄糖激酶（GK）、己糖激酶（HK）和6 磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDH）表達(dá)量在S2 組顯著上調(diào)（P<0.05）。丙酮酸激酶（PK）、糖原磷酸化酶（GPase）和磷酸烯醇式丙酮酸激酶（PEPCK）表達(dá)量則隨著新型植物提取物添加劑添加而顯著升高（P<0.05）。

圖3 新型植物提取物添加劑對(duì)大口黑鱸肝臟相關(guān)糖代謝基因GK、HK、G6PDH（A）；PK、G6Pase、PEPCK（B）相對(duì)表達(dá)量的影響

3 討論

3.1 新型植物提取物添加劑對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)性能的影響

近年來(lái)針對(duì)大口黑鱸碳水化合物代謝及其調(diào)控的研究已經(jīng)成為行業(yè)熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)膽汁酸、肉堿等添加劑均能夠通過(guò)促進(jìn)大口黑鱸脂肪代謝、提高肝臟抗氧化能力起到促進(jìn)大口黑鱸生長(zhǎng)的效果[11-12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)飼料中添加1 500、3 000 mg/kg 新型植物提取物添加劑能夠顯著提高大口黑鱸的成活率和生長(zhǎng)性能。主要原因是新型植物提取物添加劑的作用機(jī)制與其組成有關(guān)，其組成中含有大量的桑葉黃酮和少部分功能性氨基酸，前期研究曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)桑葉黃酮在羅非魚和凡納濱對(duì)蝦上均有一定的促生長(zhǎng)作用[13-14]，而大菱鲆幼魚因攝食功能性氨基酸后生長(zhǎng)性能也大大提升[15]，以上研究結(jié)果與本文研究結(jié)果相同，說(shuō)明桑葉黃酮和功能性氨基酸是調(diào)控生長(zhǎng)作用的組成成分。

3.2 新型植物提取物添加劑對(duì)大口黑鱸抗氧化及炎癥因子的影響

魚類機(jī)體的健康情況與抗氧化水平高低有直接關(guān)系，與冰鮮魚相比，含高碳水化合物的配合飼料導(dǎo)致大口黑鱸肝糖原含量升高，攝食率和增重率顯著降低[16]，同時(shí)肝臟氧化應(yīng)激嚴(yán)重[9]。本研究發(fā)現(xiàn)大口黑鱸肝臟SOD和CAT活性隨新型植物提取物添加劑添加量升高呈顯著下降，是由于桑葉黃酮和單寧酸的共同作用，緩解了大口黑鱸的肝臟氧化應(yīng)激，在前期研究中，桑葉黃酮和單寧酸已被證實(shí)對(duì)哺乳動(dòng)物、水產(chǎn)動(dòng)物均有抗氧化作用[17-18]，與本研究結(jié)果一致。同樣的作用也展現(xiàn)在膽汁酸添加劑中，其能夠緩解由于高淀粉或高脂肪導(dǎo)致大口黑鱸肝臟氧化應(yīng)激[19]。這些添加劑消除肝臟氧化應(yīng)激的具體機(jī)制還值得進(jìn)一步研究。

魚體肝臟促炎和抗炎細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)與植物提取物添加有關(guān)系[20]。適度高表達(dá)轉(zhuǎn)錄的促炎細(xì)胞因子有利于維持免疫平衡，增強(qiáng)抗感染能力[21]。添加劑調(diào)控促炎細(xì)胞因子高轉(zhuǎn)錄是否導(dǎo)致炎癥或免疫調(diào)節(jié)目前尚未清楚，但植物提取物類似免疫興奮劑，能夠通過(guò)上調(diào)促炎細(xì)胞因子起到免疫調(diào)節(jié)的作用[22]。在本研究中，抗炎因子IL-10 和促炎因子IL-1β均表現(xiàn)出先上調(diào)再下調(diào)的趨勢(shì)，特別是IL-1β與對(duì)照組相比上升4 倍。該結(jié)果與膽汁酸添加后的炎癥因子反應(yīng)類似[23]。但是與膽汁酸添加不同的是在新型植物提取物添加劑高劑量添加后TNF-α表達(dá)量顯著下調(diào)，而膽汁酸是通過(guò)激活TNF-α起到改善大口黑鱸肝糖應(yīng)激的作用[23]。這些差異背后的調(diào)控機(jī)制都值得深入研究和討論。

3.3 新型植物提取物添加劑對(duì)大口黑鱸糖脂代謝的影響

膽汁酸作為市面上常見(jiàn)的魚類飼料添加劑，對(duì)大口黑鱸氧化應(yīng)激調(diào)控機(jī)制是激活肝臟膽汁酸-FXR信號(hào)通路，促進(jìn)糖原合成，并使糖酵解、脂肪合成相關(guān)基因表達(dá)受到抑制[24]。同時(shí)，F(xiàn)XR通過(guò)誘導(dǎo)SHP的表達(dá)，抑制由肝臟X受體（LXR）/LRH所介導(dǎo)的SREBP-1c的反式激活，從而抑制脂肪生成相關(guān)基因的表達(dá)[25]。而本研究的結(jié)果則發(fā)現(xiàn)飼料中添加新型植物提取物添加劑能夠顯著促進(jìn)大口黑鱸體內(nèi)脂肪合成（FAS）和脂肪分解（PPARα）。同時(shí)，添加新型植物提取物添加劑上調(diào)糖原磷酸化酶（GPase）以及6磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDH）。這些結(jié)果說(shuō)明新型植物提取物添加劑調(diào)節(jié)大口黑鱸糖脂代謝的作用機(jī)制是一種嶄新途徑，與市面上傳統(tǒng)的膽汁酸添加劑是不同的。一方面，桑葉黃酮通過(guò)促進(jìn)磷酸戊糖途徑使部分體內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)化為脂肪，同時(shí)通過(guò)上調(diào)PPARα促進(jìn)體內(nèi)脂肪的β氧化，從而使葡萄糖通過(guò)脂肪分解途徑得到了利用。另一方面，單寧酸在一定水平時(shí)可以促進(jìn)肝臟糖原分解，同時(shí)促進(jìn)糖酵解的相關(guān)酶的表達(dá)，從而促進(jìn)了糖酵解進(jìn)行。本研究結(jié)果顯示新型植物提取物添加劑添加后S2組GK 表達(dá)量上升近150倍，S3組上升約8 倍，糖酵解過(guò)程中HK、PK、PEPCK 都有不同程度上調(diào)表達(dá)。因此，新型植物提取物添加劑可通過(guò)影響糖酵解途徑降低糖原積累，從而減輕大口黑鱸的肝糖應(yīng)激。但新型植物提取物添加劑的添加量與糖代謝酶活性沒(méi)有呈線性影響，可能是桑葉黃酮和單寧酸的復(fù)配結(jié)果對(duì)大口黑鱸糖酵解的調(diào)節(jié)作用仍是不充分的。這方面的作用機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

大口黑鱸作為典型肉食性魚類，其糖異生水平更高[26]，而通過(guò)糖酵解分解葡萄糖和棕櫚鹽產(chǎn)生的ATP的能力非常有限。本研究結(jié)果顯示，添加新型植物提取物添加劑促進(jìn)了糖酵解和磷酸戊糖途徑，對(duì)其糖異生關(guān)鍵酶PEPCK 也具有一定的表達(dá)促進(jìn)作用。但是與糖酵解作用的促進(jìn)相比，這種上調(diào)的效果是有限的?？梢酝茰y(cè)新型植物提取物添加劑作為一種生理活性成分，對(duì)大口黑鱸的機(jī)體調(diào)控是通過(guò)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控進(jìn)行的，在消除大口黑鱸攝食碳水化合物后的一系列肝糖應(yīng)激反應(yīng)，如消除炎癥因子、提高抗氧化能力、改善糖脂代謝途徑等方面均具有一定的積極作用，從而起到促進(jìn)大口黑鱸生長(zhǎng)、改善大口黑鱸健康的作用。

4 小結(jié)

在本研究條件下，添加不同梯度的新型植物提取物添加劑能顯著提高大口黑鱸的成活率和生長(zhǎng)性能；新型植物提取物添加劑可通過(guò)影響糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑，促進(jìn)肝臟糖原分解，降低糖原積累，緩解大口黑鱸肝臟氧化應(yīng)激。但因養(yǎng)殖條件受限，本養(yǎng)殖周期為8 周，雖然養(yǎng)殖效果明顯，但較低于飼料源評(píng)價(jià)周期，因此新型植物提取物添加劑在更長(zhǎng)的養(yǎng)殖周期內(nèi)出現(xiàn)的效果還需要進(jìn)一步探討。