陳保華 朱志賢 陳國(guó)寶

關(guān)鍵詞：大米發(fā)酵液;保濕;修護(hù);美白;抗氧化;功效評(píng)價(jià)

大米發(fā)酵產(chǎn)物因?yàn)槠渚N選擇和工藝控制的不同，發(fā)酵產(chǎn)品中成分和用途及其功效會(huì)有所差異。該研究通過(guò)對(duì)川藏高原海拔3700m雪山線附近土壤中酵母菌進(jìn)行了篩選，通過(guò)平板畫線法，純化分離出19個(gè)菌株。對(duì)每個(gè)菌株進(jìn)行了擴(kuò)繁工作，并選取了對(duì)紫外線抵抗能力強(qiáng)、胞外酶較為單一的一株作為本實(shí)驗(yàn)的菌株母本進(jìn)行擴(kuò)大培育。通過(guò)分段控溫、控氧的方式進(jìn)行放大發(fā)酵，主要目標(biāo)產(chǎn)物為活性低聚糖和小分子肽類、氨基酸，并對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行了保濕、修護(hù)、抗氧化、美白的體外功效評(píng)價(jià)。

01功效評(píng)價(jià)方案

1.1基于DPPH自由基清除的抗氧化評(píng)價(jià)

抗氧化成分可以通過(guò)清除自由基來(lái)減緩肌膚的衰老。可通過(guò)原料清除DPPH自由基的能力，來(lái)評(píng)估抗氧化活性的大小。

1.2基于角質(zhì)形成細(xì)胞遷移的修護(hù)效果評(píng)價(jià)

皮膚受到損傷后，皮膚內(nèi)的各種細(xì)胞主要通過(guò)細(xì)胞遷移到達(dá)損傷部位來(lái)進(jìn)行修復(fù)活動(dòng)，角質(zhì)形成細(xì)胞的迀移能力對(duì)表皮損傷修復(fù)具有重要作用[1-2]?？梢酝ㄟ^(guò)評(píng)估樣品是否具有提升角質(zhì)形成細(xì)胞遷移的能力，說(shuō)明產(chǎn)品是否具有肌膚修護(hù)功效。

1.3基于免疫熒光法測(cè)定AQP3蛋白含量的保濕效果評(píng)價(jià)

水通道蛋白3（AQP3）可以促進(jìn)內(nèi)源性甘油以及皮脂腺中的甘油三酯運(yùn)輸進(jìn)入表皮，影響皮膚保濕功效，因此上調(diào)AQP3可以達(dá)到保濕功效[3]。可以通過(guò)測(cè)試基于角質(zhì)形成細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)樣品作用后，AQP3蛋白表達(dá)量的變化，評(píng)價(jià)待測(cè)樣品的保濕功效。

1.4基于酪氨酸酶活性抑制、黑色素細(xì)胞的黑色素含量的美白效果評(píng)價(jià)

在皮膚黑色素生物合成中，酪氨酸酶是關(guān)鍵酶。評(píng)估原料對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用，以及通過(guò)離體培養(yǎng)人黑色素中的黑色素含量測(cè)定，可評(píng)估培養(yǎng)基中添加受試原料對(duì)黑色素的生成抑制來(lái)判定產(chǎn)品是否具有美白效果。

1.5測(cè)試材料

1.5.1主要試劑

無(wú)水乙醇、乙醚、氫氧化鈉、氨水、一水合檸檬酸、十二水合磷酸氫二鈉、DPPH（2，2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl）、維生素E、MTT、DMSO、酪氨酸酶、左旋多巴、黑色素標(biāo)準(zhǔn)品、KC2500、胰酶、DMEM、抗萍滅劑、Hochest33342、PBS、無(wú)表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、PBS、4%多聚甲醛、檸檬酸鈉、Anti-AQP3抗體、Anti-Mouse-488（山羊抗鼠）、即用型山羊血清、曲酸、Medium-254、HMGS、胎牛血清。

1.5.2主要設(shè)備

酶標(biāo)儀（BioTek，Epoch）、CO2培養(yǎng)箱（Thermo，150I）、超凈工作臺(tái)（蘇凈安泰，SW-CJ-1F）、倒置顯微鏡（Olympus，CKX41）、微量振蕩器（其林貝爾，MM-1）、熒光顯微鏡（Leica，DM2500）、高速冷凍離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀，H1850R）、數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國(guó)華，HH-4A）。

1.6測(cè)試方法

1.6.1DPPH自由基清除

（1）測(cè)試系統(tǒng)：以維生素E為陽(yáng)性對(duì)照，同受試物用95%乙醇溶解稀釋成不同濃度梯度進(jìn)行自由基清除試驗(yàn)。

（2）檢測(cè)：參照表1，設(shè)立樣品管（T）、樣品本底（T0）、DPPH管（C）和溶劑本底（C0），每一樣品的每個(gè)受試濃度的樣品管（T）及DPPH管（C）需設(shè)立3支平行管，按要求加液反應(yīng)5min后在517nm處測(cè)定吸光值。

（3）計(jì)算DPPH自由基清除率。

1.6.2角質(zhì)形成細(xì)胞遷移

（1）接種：角質(zhì)形成細(xì)胞以2.5E5個(gè)/孔的接種密度接種至6孔板，培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中孵育過(guò)夜。

（2）配液：按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表2）配置樣品工作液。

（3）給藥：根據(jù)表2試驗(yàn)分組設(shè)計(jì)，待6孔板中細(xì)胞鋪板率達(dá)到70%以上時(shí)，進(jìn)行分組給藥，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔給藥量為2mL。培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h。

（4）劃痕、清洗、培養(yǎng)：孵育結(jié)束后，進(jìn)行劃痕后用PBS清洗，加入正常的細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。

（5）拍照分析：劃痕后0h在4倍鏡下拍照;劃痕24h后，用PBS清洗一次，4倍鏡下拍照。應(yīng)用GraphPadPrismProgram軟件作圖分析。

1.6.3免疫熒光法測(cè)定AQP3蛋白含量生成促進(jìn)

（1）測(cè)試系統(tǒng)：人體角質(zhì)形成細(xì)胞傳代培養(yǎng)按4E4個(gè)/孔接種至24孔板，培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中孵育過(guò)夜。

（2）配液：按試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表3）分別配制受試物工作液。

（3）給藥：根據(jù)上述表3試驗(yàn)具體設(shè)計(jì)，待24孔板中細(xì)胞鋪板率達(dá)到30%～50%時(shí)，進(jìn)行分組給藥，每孔加樣1mL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。給藥完成后將24孔板放置在培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中培養(yǎng)24h。

（4）處理：孵育培養(yǎng)結(jié)束后，吸棄舊液，1mL/孔PBS清洗3次，每孔加1mL4%的多聚甲醛室溫固定爬片15min。固定結(jié)束后將24孔板放置于4℃下保存?zhèn)溆谩＝?jīng)羊血清封閉，一抗、二抗孵育，滴加Hochest33342染色。

（5）封片觀察拍照：用針頭挑出爬片，在載玻片上滴加一滴抗淬滅劑并將爬片反放于載玻片上。24h內(nèi)熒光顯微鏡拍照，分析檢測(cè)結(jié)果。

1.6.4酪氨酸酶活性抑制、黑色素細(xì)胞的黑色素含量

（1）測(cè)試系統(tǒng)：采用培養(yǎng)傳代人黑色素細(xì)胞為基礎(chǔ)，設(shè)定不同濃度梯度曲酸作為陽(yáng)性對(duì)照，受試物用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液稀釋為多級(jí)濃度樣品。

使用1mLEp管，設(shè)立樣品管（T）、樣品本底（T0）、酶反應(yīng)管（C）和溶劑（C0），按要求加液，置37℃水浴槽孵育l0min。依次在各管中加入400μL的左旋多巴溶液，控制每管反應(yīng)時(shí)間為5min，即刻將各管反應(yīng)溶液在475nm處測(cè)定吸光值。

樣品加液要求具體見表4。

A.計(jì)算酪氨酸酶抑制率。

（2）黑色素含量檢測(cè)

A.接種：按5E4個(gè)/孔的接種密度接種細(xì)胞至6孔板，培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中孵育過(guò)夜。

B.配液：按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表5）配置受試物工作液。

.給藥：根據(jù)表5試驗(yàn)設(shè)計(jì)，待6孔板中細(xì)胞鋪板率達(dá)到40%～50%時(shí)，進(jìn)行分組給藥，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔給藥量為2mL。培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72h。

D.細(xì)胞消化提?。号囵B(yǎng)結(jié)束PBS清洗一次，加入胰酶消化，收集細(xì)胞至Eppendorf管中，離心棄上清液。加入1.2mL混合液（蒸循水：無(wú)水乙醇：乙醚=2：5：5，v/v/v），渦旋振蕩，室溫放置30min后，離心棄上清液，加入DMSO的NaOH水溶液，采用封口膜封口，放置于80℃水浴中加熱40min。

E.檢測(cè)分析：加熱結(jié)束后，待溫度平衡至室溫后，在405nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度值，數(shù)值進(jìn)行軟件分析。

02功效評(píng)價(jià)結(jié)果

2.1基于DPPH自由基清除的抗氧化效果

檢測(cè)結(jié)果顯示，較高濃度條件下，該大米發(fā)酵液可通過(guò)對(duì)DPPH自由基清除達(dá)到抗氧化效果。

2.2基于角質(zhì)形成細(xì)胞遷移的修護(hù)效果評(píng)價(jià)

基于測(cè)試方法，將空白對(duì)照組遷移率歸一，計(jì)算各組相對(duì)遷移率，細(xì)胞遷移照片見圖2所示，數(shù)據(jù)分析結(jié)果見表7和圖3所示。

與BC組相比，PC組的細(xì)胞相對(duì)遷移率顯著上升，說(shuō)明測(cè)試體系有效。

與BC組相比，樣品組酵母菌/大米發(fā)酵產(chǎn)物濾液-1.0%、酵母菌/大米發(fā)酵產(chǎn)物濾液-2.5%和酵母菌/大米發(fā)酵產(chǎn)物濾液-4.0%組的細(xì)胞相對(duì)遷移率均顯著提高。說(shuō)明該產(chǎn)品有修護(hù)皮膚屏障的功效。

2.3基于免疫熒光法測(cè)定AQP3蛋白含量的保濕效果評(píng)價(jià)

孵育培養(yǎng)結(jié)束后，細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，結(jié)果匯總見圖4、表8及圖5。

與BC組相比，PC組的AQP3蛋白含量顯著上升，樣品組大米發(fā)酵液-0.5%、大米發(fā)酵液-1.0%和大米發(fā)酵液-2.5%的AQP3蛋白含量均顯著上升。該大米發(fā)酵液在濃度為0.5%、1.0%和2.5%時(shí)，可通過(guò)提高AQP3蛋白的表達(dá)而發(fā)揮保濕功效。

2.4基于酪氨酸酶活性抑制、黑色素細(xì)胞的黑色素含量的美白效果評(píng)價(jià)

2.4.1酪氨酸酶抑制率檢測(cè)結(jié)果

基于測(cè)試方法，進(jìn)行酪氨酸酶抑制率檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果匯總?cè)绫?所示，趨勢(shì)圖如圖6所示：

2.4.2黑色素含量抑制率檢測(cè)結(jié)果

基于測(cè)試方法，進(jìn)行收集細(xì)胞，進(jìn)行黑色素含量抑制率測(cè)定，結(jié)果如表10所示，變化趨勢(shì)圖如圖7所示：

與BC組相比，PC（光甘草定）組黑色素含量顯著下降，黑色素含量抑制率為21.22%，說(shuō)明本次測(cè)試有效。

與BC組相比，樣品組酵母菌/大米發(fā)酵產(chǎn)物濾液-2.5%的黑色素含量顯著下降，黑色素含量抑制率為21.42%。

由此說(shuō)明，該大米發(fā)酵液可通過(guò)抑制酪氨酸酶活性和降低黑色素含量，發(fā)揮美白功效。

結(jié)論

選取支鏈淀粉及蛋白質(zhì)含量更加豐富的優(yōu)質(zhì)有機(jī)大米為原料，經(jīng)高海拔、強(qiáng)紫外線、極端溫差的自然環(huán)境中篩選出胞外酶單一性較好的特殊菌種使用分段控溫供氧工藝發(fā)酵，得到的產(chǎn)品保留了大米的特殊清香，沒有一般釀酒酵母發(fā)酵可能產(chǎn)生的乳酸、丙酸、丁酸的氣味，減少了有機(jī)酸對(duì)皮膚的刺激性，產(chǎn)品更易為消費(fèi)者所接受。

另通過(guò)體外生化法與細(xì)胞法進(jìn)行功效評(píng)價(jià)，結(jié)果表明該產(chǎn)品體外功效評(píng)價(jià)顯示：在10%、25%、50%、75%、100%濃度時(shí)，DPPH清除率分別為0.39%、3.14%、5.49%、7.37%、12.08%，表明產(chǎn)品可通過(guò)清除自由基的方式達(dá)到抗氧化的作用。離體培養(yǎng)角質(zhì)成形細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示在濃度為1.0%、2.5%和4.0%時(shí)，可以通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞遷移達(dá)到修護(hù)功效。在濃度為0.5%、1.0%和2.5%時(shí)，可通過(guò)提高角質(zhì)成形細(xì)胞中AQP3蛋白的表達(dá)而發(fā)揮保濕功效。酪氨酸酶活性抑制IC50為18.3%，基于人黑色素細(xì)胞，濃度2.5%時(shí)黑色素含量抑制率21.42%，可以達(dá)到美白效果。

基于發(fā)酵產(chǎn)物的多樣性而言，目前可以通過(guò)硫酸苯酚法測(cè)定總糖含量、茚三酮顯色法測(cè)定氨基酸含量。但具體糖類組分構(gòu)成尚不明確，混合肽類成分的氨基酸連接形式也尚不明確，故具體起到保濕、美白、修護(hù)和抗氧化作用的成分有待進(jìn)一步深入研究。