衛(wèi)燕紅，白紅娟，薛海龍，楊官娥，呂 寧，胡錦俊，宋 雨

(1. 中北大學(xué) 環(huán)境與安全工程學(xué)院，山西 太原 030051； 2. 華晉瑞海科技有限公司，山西 太原 030002；3. 山西醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，山西 太原 030001)

0 引言

光合細菌(Photosynthetic Bacteria，PSB)是具有原始光能合成體系的原核生物，能夠在厭氧光照條件下，以小分子有機化合物或二氧化碳為碳源進行不放氧光合作用[1]，特別是紫色非硫菌群，不僅能在厭氧光照的條件下進行光能異養(yǎng)生長，而且能在有氧黑暗條件下進行好氣異養(yǎng)生長，即具有隨著生存環(huán)境而靈活改變代謝類型的特性[2]. 光合細菌中的球形紅細菌含有多種營養(yǎng)物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多種B族維生素、輔酶Q等生理活性物質(zhì)，能分解苯及其衍生物類有機污染物，修復(fù)鉛、鎘和鉻污染土壤[3-4]； 沼澤紅假單胞菌在不同的自然環(huán)境下能表現(xiàn)出不同的生理生化功能，如固氮、產(chǎn)氫、分解有機污染物和修復(fù)鎘、砷污染土壤等，在自然界的氮、碳、硫循環(huán)中發(fā)揮著重要的作用[5-6]； 深紅紅螺菌不僅能夠合成聚羥基脂肪酸酯(PHA)，還能提高土壤肥力和促進植物生長，修復(fù)鉛、汞和鉻等重金屬污染土壤[7]. 然而，在實際應(yīng)用過程中，純菌株對原材料、設(shè)備和能源的利用率較低，功能單一，且易染雜菌[8]. 因此，為解決上述問題，采用混合培養(yǎng)方法制成含有球形紅細菌、沼澤紅假單胞菌和深紅紅螺菌等3株光合細菌的復(fù)合菌劑，為光合細菌應(yīng)用于修復(fù)多種有機污染物和多種重金屬復(fù)合污染提供支持.

菌種混合培養(yǎng)不僅活菌數(shù)遠遠高于純種培養(yǎng)，生理代謝功能也會增強[9]. 范金霞等[10]對4種纖維素降解菌進行單獨和混合培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，混合培養(yǎng)產(chǎn)生的纖維素酶活力最高，充分說明了纖維素菌混合培養(yǎng)能夠提高纖維素的降解率. Nguyen等[11]采用酵母菌-醋酸菌混菌培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，混菌培養(yǎng)可顯著提高活菌數(shù)和生理代謝功能. Nookongbut等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在鎘、砷污染嚴(yán)重的土壤中，施用光合細菌中的沼澤紅假單胞菌、膠質(zhì)紅假單胞菌、糞假單胞菌、苯甲酸鹽紅長命菌在使小麥、菜豆、煙草、水稻等作物穩(wěn)產(chǎn)的同時降低了作物對重金屬的吸收，比單一菌的實施效果更好.

目前，有關(guān)微生物混合培養(yǎng)的研究較少，且已有的報道大多數(shù)以獲取發(fā)酵產(chǎn)物為目的[13]，以獲取菌株為目的并且探究混合培養(yǎng)過程中菌株生長過程的研究較少. 為此，本文以球形紅細菌(H菌株)、沼澤紅假單胞菌(N菌株)和深紅紅螺菌(M菌株)為研究對象，探究光合細菌混合培養(yǎng)的生長規(guī)律，以期縮短培養(yǎng)時間，提高光合細菌的活菌數(shù)，為光合細菌混合菌劑的制備提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

球形紅細菌(Rhodobactersphaeroides，H菌株)、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris，N菌株)和深紅紅螺菌(Rhodospirilliumrubrum，M菌株)系光合細菌中的紫色非硫菌群，由山西大學(xué)光合細菌研究室分離、鑒定并提供[14].

1.1.2 試劑

蘋果酸，(NH4)2SO4，MgSO4，CaCl2等均為分析純； 酵母膏為生物試劑. 以上試劑均由天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn).

1.1.3 培養(yǎng)基

光合細菌(PSB)培養(yǎng)基：蘋果酸2.5 g，酵母膏1.0 g，(NH4)2SO41.25 g，MgSO40.2 g，CaCl20.07 g，K2HPO40.9 g，KH2PO40.6 g，用NaOH將pH值調(diào)為7，蒸餾水1 000 mL，121 ℃，103.4 kPa下高壓蒸汽滅菌20 min.

1.2 儀器與設(shè)備

主要實驗儀器與設(shè)備如表 1 所示.

表 1 主要儀器與設(shè)備一覽表Tab.1 The main instruments and equipment list

1.3 方法

1.3.1 PSB單一菌和混合種子液的制備

將H菌株、N菌株和M菌株按15%(體積比)的接種量分別接種到250 mL血清瓶中，用培養(yǎng)基填滿血清瓶，并用橡膠塞封口，在溫度為30 ℃、光照度為2 500 lx的光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h. 連續(xù)活化兩次后采用平板菌落計數(shù)法測定各自活菌數(shù)，保存在4 ℃冰箱中作為備用單一菌. 將3種菌株按 1∶1∶1(活菌數(shù)比)混合均勻即為PSB混合種子液.

1.3.2 不同理化因素對PSB混合菌生長的影響

將PSB混合種子液接種到250 mL血清瓶中，用培養(yǎng)基填滿血清瓶，并用橡膠塞封口. 每隔6 h測定PSB混合菌的活菌數(shù). 設(shè)定接種量(接種后的初始培養(yǎng)菌含量分別為7×108CFU/mL, 1.2×109CFU/mL, 1.7×109CFU/mL, 2.2×109CFU/mL，2.7×109CFU/mL)，初始pH值(分別為5, 6, 7, 8, 9)，培養(yǎng)溫度(分別為20 ℃, 25 ℃, 30 ℃, 35 ℃, 40 ℃)，光照供氧(分別為光照厭氧、光照好氧、黑暗厭氧和黑暗好氧)等條件進行優(yōu)化試驗，分別考察不同理化因素對混合菌株生長的影響. 厭氧條件采用光照培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)； 好氧條件采用搖床(振蕩速度為130 r/min)培養(yǎng)； 光照度為2 500 lx； 黑暗條件采用7層黑布包裹. 采用稀釋涂布平板法(吸取0.1 mL菌液于培養(yǎng)皿涂布均勻，晾干后將培養(yǎng)皿置于溫度為 30 ℃、光照度為2 500 lx的人工氣候箱，培養(yǎng)120 h 后數(shù)活菌數(shù))測定菌株數(shù)，每次試驗做3個平行.

1.3.3 動力學(xué)模型的建立

選擇修正的Gompertz[15]方程式對實驗數(shù)據(jù)進行擬合，見式(1).

(1)

式中：t為時間，h；yt為t時刻的菌液濃度，CFU/mL；ymin為最小菌液濃度，CFU/mL；A為菌數(shù)增長的對數(shù)值；μmax為最大比生長速率，h-1；λ為延滯期，h.

將式(1)經(jīng)過變形得到式(2)，即

(2)

在不同條件下，每隔6 h測定PSB混合菌的活菌數(shù)，結(jié)合式(2)進行非線性回歸后建立不同條件下的生長動力學(xué)模型，分別考察接種量、初始pH、溫度及光照供氧對PSB混合菌生長的影響，并探究在本文研究的適宜條件下PSB單一菌和混合菌的生長曲線和動力學(xué)參數(shù)，方程擬合度由R2進行評估.

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

按照修正的Compertz 模型進行生長動力學(xué)擬合.

2 結(jié)果與討論

2.1 PSB混合菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.1.1 接種量對PSB混合菌生長的影響

不同接種量下，PSB混合菌生長曲線如圖 1 所示. 當(dāng)接種量由7×108CFU/mL增加到1.7×109CFU/mL時，隨著接種量的增加，活菌數(shù)也隨之增加； 接種量為1.7×109CFU/mL時48 h到達穩(wěn)定期，此時的活菌數(shù)為7.03×109CFU/mL. 當(dāng)接種量由1.7×109CFU/mL繼續(xù)增大到2.2×109CFU/mL時，活菌數(shù)反而下降. 當(dāng)接種量為2.7×109CFU/mL時，雖然接種量最大，但培養(yǎng)效果最差，在48 h時活菌數(shù)僅為6.08×109CFU/mL. 這可能是由于培養(yǎng)環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)不足以供應(yīng)細菌的生存，菌體間競爭加劇，導(dǎo)致生存環(huán)境惡劣，使一部分菌被淘汰或者提前進入衰老期[16]. 另外，接種量達到上限，此時接種量已經(jīng)不再是影響細菌生長的主要因素[17]. 總體來說，接種量對活菌數(shù)沒有顯著影響，當(dāng)接種量為 1.7×109CFU/mL時，菌株的生長情況最好，而過多的接種量并不能有效提高活菌數(shù), 反而會增加成本. 綜合考慮, 本文采用1.7×109CFU/mL 作為最適接種量.

圖 1 接種量對PSB混合菌生長的影響Fig.1 Effect of inoculation quantity on the growth of PSB

2.1.2 培養(yǎng)基初始pH值對PSB混合菌生長的影響

不同初始pH值下PSB混合菌生長的情況如圖 2 所示.

圖 2 初始pH值對PSB生長的影響Fig.2 Effect of initial pH on the growth of PSB

由圖 2 可知，PSB混合菌受pH值影響顯著. 初始pH值為5和9時，PSB混合菌生長緩慢，54 h 到達穩(wěn)定期，且各自的活菌數(shù)分別為3.81×109CFU/mL和4.16×109CFU/mL. 除此之外，混合菌在pH值為9的培養(yǎng)基中，還生成了一些絮狀物. pH值為6時的菌株生長情況也較差，說明光合細菌不適合在酸性環(huán)境下生存. 當(dāng)pH值為8時，細菌菌液濃度略低于pH值為7時的菌液濃度，但總體生長情況良好. 當(dāng)pH值為7時，混合菌的生長速度最快，48 h達到穩(wěn)定期，活菌數(shù)也最高，為7.03×109CFU/mL. 所以，PSB混合菌適合在中性或弱堿環(huán)境中生存. 分析原因為pH值的升高打破了培養(yǎng)基中離子間的化學(xué)平衡，使化學(xué)平衡發(fā)生移動，故有絮狀物產(chǎn)生，導(dǎo)致培養(yǎng)基中的無機鹽濃度降低，故菌種的活性降低[18]. 除此之外，pH值過高和過低都會破壞酶和各種生物大分子的穩(wěn)定，使細胞生物活性降低，或者引起細胞膜電荷的變化，影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[19-20].

2.1.3 培養(yǎng)溫度對PSB混合菌生長的影響

不同培養(yǎng)溫度下PSB混合菌的生長曲線如圖 3 所示，可以看出PSB混合菌受溫度影響顯著. 當(dāng)溫度為20 ℃和25 ℃時，混合菌生長緩慢，分別在66 h和54 h到達穩(wěn)定期，此時的活菌數(shù)分別為4.07×109CFU/mL和5.38×109CFU/mL； 當(dāng)溫度為35 ℃時，混合菌的生長情況良好，生長較快，但35 ℃時菌液濃度略低于30 ℃； 當(dāng)溫度為40 ℃時，混合菌生長最慢，在54 h到達穩(wěn)定期的活菌數(shù)僅為3.73×109CFU/mL. 分析原因[8]，其一可能是因為隨著溫度的升高，有些菌株生長過快提前進入衰亡期，影響菌株的生長周期，混合培養(yǎng)產(chǎn)物中活菌數(shù)降低； 其二是因為超過35 ℃時，菌體就會有自溶的風(fēng)險； 其三是溫度過高或過低都會影響酶的活性，進而影響各種生化反應(yīng)的速率，影響微生物的生長. 綜上所述，30 ℃時PSB混合菌的生長情況最好，活菌數(shù)最大，所以選擇30 ℃作為PSB混合菌的培養(yǎng)溫度.

圖 3 溫度對PSB生長的影響Fig.3 Effect of temperature on the growth of PSB

2.1.4 光照供氧對PSB混合菌生長的影響

各光照供氧下PSB混合菌的生長曲線如圖 4 所示，可以看出PSB混合菌受光照供氧影響較顯著. 在光照厭氧條件下，PSB具有類似葉綠體的光反應(yīng)中心，PSB混合菌利用光能進行厭氧生長，菌液由淡紅色變?yōu)樯罴t色，且生長情況最好，生長速率最快，48 h進入穩(wěn)定期后活菌數(shù)也高于其他3種情況，為7.03×109CFU/mL. 在光照好氧條件下，PSB混合菌的菌液呈現(xiàn)淡紅色，菌株雖有生長，但生長較緩慢，54 h進入穩(wěn)定期的活菌數(shù)為6.29×109CFU/mL，分析原因為氧氣抑制了細菌葉綠素和類胡蘿卜素的生成，靠消耗自身合成的有機物產(chǎn)生能量，改變了代謝途徑[21]，所以, PSB混合菌生長速率減慢. 在黑暗好氧和黑暗厭氧條件下，PSB雖然無法進行光合作用，但菌株也可以生長. 總的來說，PSB具有在不同生長環(huán)境下靈活改變代謝的特性.

圖 4 光照供氧對PSB生長的影響Fig.4 Effect of illumination and oxygen supply on the growth of PSB

2.2 PSB的生長動力學(xué)分析

在菌體生長動力學(xué)中，一級生長動力學(xué)模型是一個數(shù)學(xué)方程或數(shù)學(xué)函數(shù)，表示微生物數(shù)量與時間的關(guān)系，包括初始菌數(shù)、遲滯期、生長速率、細菌最大濃度等與時間變化之間的關(guān)系. 目前，常用的細胞生長動力學(xué)模型有Monod方程、Logistic方程、修正Gompertz方程等. Monod方程、Logistic方程的模型應(yīng)用比較方便，但都不能很好地模擬細胞生長的整個過程，特別是延遲期. 在使用過程中，Monod方程忽略了底物濃度對細菌生長的限制作用，而Logistic方程是以指數(shù)函數(shù)為基礎(chǔ)，準(zhǔn)確性不高[22]. 本文選擇修正的Gompertz方程分析不同培養(yǎng)條件對PSB混合菌的最大比生長速率和延滯期的影響及其生長曲線.

2.2.1 不同培養(yǎng)條件對PSB混合菌生長的影響

不同的接種量、初始pH值、培養(yǎng)溫度及光照供氧的動力學(xué)方程及參數(shù)見表 2～表 5. 從表中可以看出，本試驗條件下的生長動力學(xué)均符合修正的Compertz動力學(xué)模型. 由表 2 可以看出，隨著接種量從7×108CFU/mL增至1.7×109CFU/mL，PSB混合菌的最大比生長速率μmax逐漸增大，延滯期λ逐漸減小，繼續(xù)增大接種量，結(jié)果卻相反.

表 2 不同接種量下PSB混合菌的生長動力學(xué)Tab.2 Growth kinetics of PSB mixed bacteria under different inoculation quantity

由表 3 可以看出，當(dāng)初始pH值從5增加到7再到9時，最大比生長速率從0.009 h-1增加到 0.025 h-1再降到0.01 h-1，延滯期從17.8 h減小至9.9 h 再增大至19.1 h，在pH值為7時PSB混合菌的最大比生長速率最大，延滯期最小，說明PSB混合菌適合在中性條件下生存. 由表 4 可以看出，隨著溫度從20 ℃增至30 ℃，PSB混合菌的生長速率μmax逐漸增大，延滯期λ逐漸減小，再增大溫度時，結(jié)果則沒有在30 ℃的情況好. PSB混合菌在30 ℃下生長最好. 由表 5 可以看出，在厭氧光照條件下，PSB混合菌的最大比生長速率最大，為 0.025 h-1，延滯期最短，為9.9 h.

表 3 不同初始pH值下PSB混合菌的生長動力學(xué)Tab.3 Growth kinetics of PSB mixed bacteria under different initial pH

表 4 不同溫度下PSB混合菌的生長動力學(xué)Tab.4 Growth kinetics of PSB mixed bacteria under different temperature

表 5 不同光照供氧下PSB混合菌的生長動力學(xué)Tab.5 Growth kinetics of PSB mixed bacteria under different illumination oxygen supply

2.2.2 PSB的生長曲線分析

在接種量為1.7×109CFU/mL，初始pH值為7，溫度為30 ℃，厭氧光照的條件下，分別培養(yǎng)PSB單一菌和混合菌96 h. 采用修正的Compertz動力學(xué)模型進行擬合，生長動力學(xué)曲線擬合及動力學(xué)參數(shù)見圖 5 和表 6.

圖 5 PSB單一菌和混合菌生長動力學(xué)曲線Fig.5 Growth kinetics curves of PSB single and mixed bacteria

如圖 5 所示，擬合值與實驗結(jié)果基本保持一致，擬合菌體生長曲線與測得的實驗值保持同步變化，且都存在一個延滯期，隨后進入指數(shù)生長期，最后到達穩(wěn)定期. 除此之外，H菌株、N菌株和M菌株分別在54 h到達穩(wěn)定期，而混合菌在48 h到達穩(wěn)定期，比單一菌株提前了6 h. 在48 h時，混合菌的活菌數(shù)為7.03×109CFU/mL，較H菌株、N菌株和M菌株3種單一菌株的活菌數(shù)分別提高了15.2%, 21.2%和23.3%，表明混合培養(yǎng)能夠促進細菌的生長.

將表6中菌種純種培養(yǎng)和混合培養(yǎng)時的生長特征參數(shù)進行比較發(fā)現(xiàn)，混合后PSB混合菌的最大比生長速率μmax較H菌株、N菌株和M菌株3種單一菌株分別增大了 0.003 h-1，0.006 h-1及0.003 h-1，延滯期λ分別減小了11.1 h，12.7 h 及10.6 h，極大地提高了生產(chǎn)效率，縮短了培養(yǎng)時間.

表 6 PSB的生長動力學(xué)Tab.6 Growth kinetics of PSB

3 結(jié) 論

接種量、初始pH值、培養(yǎng)溫度和光照供氧對PSB混合菌的生長都有不同程度的影響，優(yōu)化后的適宜培養(yǎng)條件為：接種量(接種后的初始培養(yǎng)菌含量)為1.7×109CFU/mL，初始pH值為7，溫度為30 ℃和光照厭氧. 通過建立菌體生長動力學(xué)模型，模擬培養(yǎng)過程中菌體的動態(tài)變化過程，混合培養(yǎng)前后動力學(xué)模型的預(yù)測值和實測值擬合效果良好(R2均大于0.95)，所建模型能較好反映混合菌和單一菌培養(yǎng)過程中的動力學(xué)變化. 在最優(yōu)條件下，混合菌培養(yǎng)48 h到達穩(wěn)定期，比H菌株、N菌株和M菌株3種單一菌株的穩(wěn)定期均提前 6 h，此時混合菌活菌數(shù)為7.03×109CFU/mL，比單一菌株H菌株、N菌株和M菌株分別提高了15.2%，21.2%和23.3%.