李東輝，吳紅偉，李國峰，楊新榮，李咸慰，宋沁潔，李 陽，李越峰*

1甘肅中醫(yī)藥大學(xué)；2甘肅省中藥制藥工藝工程研究中心，蘭州 730000

1956年，Harman提出自由基衰老學(xué)說，氧化反應(yīng)是誘導(dǎo)生物衰老與誘發(fā)多種疾病的主要起因，其中自由基主要由線粒體呼吸鏈電子泄露產(chǎn)生或經(jīng)酶促反應(yīng)催化產(chǎn)生，包括氧自由基與其他自由基[1]。一些活性物質(zhì)可直接或間接作用于自由基，以逆轉(zhuǎn)自由基對機體細(xì)胞的氧化攻擊。當(dāng)前，如丁基羥基茴香醚、二丁基羥基甲醚、沒食子酸丙酯等合成型抗氧化劑均具有一定的細(xì)胞毒性[2]。因此，從食品類、香料類及天然產(chǎn)物中尋找高效、低毒的抗氧化劑也倍受關(guān)注。DPPH法和ABTS法可用于大樣本測定及親水性和親脂性物質(zhì)的抗氧化能力測定。因此，有必要從天然產(chǎn)物中尋找高效、低毒抗氧化劑。大黃為我國傳統(tǒng)大宗中藥材，源于蓼科植物掌葉大黃RheumpalmatumL.、唐古特大黃RheumtanguticumMaxim.ex Balf.或藥用大黃RheumofficinaleBaill.的干燥根和根莖，主要含有游離型與結(jié)合型蒽醌類衍生物、鞣質(zhì)類、二苯乙烯苷類、多酚類等成分[3]，具有瀉下、抑菌、止血、抗氧化等藥理作用[4]。現(xiàn)已有研究表明，大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷及總蒽醌苷與體外抗氧化活性呈正相關(guān)[5]。沒食子酸、兒茶素或表兒茶素[6]、2-O-桂皮酰-沒食子酰葡萄糖等8種成分對ABTS自由基的清除能力較強[7]。

傳統(tǒng)篩選活性化合物的方式常采用分離、純化等，這無疑增大了勞動強度，且成本高耗時長。當(dāng)前，譜效關(guān)系已被廣泛用于中藥有效成分篩選，它是指通過建立指紋圖譜與藥效學(xué)實驗，利用數(shù)學(xué)軟件和計算機技術(shù)“譜”與“效”聯(lián)系起來，這種方法符合中醫(yī)藥理論體系[8]，又彌補了目前以化學(xué)指紋圖譜控制中藥質(zhì)量的不足。中藥指紋圖譜質(zhì)和量的特征和中藥材生物學(xué)活性研究結(jié)果相聯(lián)系建立關(guān)聯(lián)數(shù)學(xué)表達式可用于評價中藥材質(zhì)量。因此，本研究以HPLC法建立“譜”，以DPPH法及ABTS法建立體外抗氧化“效”，并測定20批大黃的總多酚含量，總蒽醌含量，旨在研究大黃化學(xué)成分與體外抗氧化作用之間的聯(lián)系，以便獲得大黃潛在抗氧化有效成分群。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀(美國Agilent科技公司)；UV-power型紫外分光光度計(北京萊伯泰科儀器股份有限公司)；BT125D型十萬分之一分析天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；PL-S60型康士潔牌數(shù)碼超聲波清洗機(東莞康士潔超聲波科技有限公司)。

1.2 試劑

甲醇、乙腈、磷酸(色譜級，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；無水碳酸鈉(分析純，煙臺市雙雙化工有限公司)；無水乙醇(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；1，1-二苯基-2-苦基肼(批號：S21J11M116469，DPPH)、2，2-聯(lián)氨-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(批號：CAS#30931-67-0，ABTS)，均由上海源葉生物科技有限公司提供；福林酚試劑(分析純，上海展云化工有限公司)；兒茶素(批號：PS020094)、表兒茶素(批號：PS010585)、沒食子酸(批號：PS000688)、蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷(批號：PS010709)、大黃酸-8-O-葡萄糖苷(批號：PS0011174)、大黃素-1-O-葡萄糖苷(批號：PS011196)、大黃酚-8-O-葡萄糖苷(批號：PS010712)、大黃素甲醚-8-O-葡萄糖苷(批號：PS011865)、蘆薈大黃素(批號：PS010375)、大黃酸(批號：PS010625)、大黃素(批號：PS000264)、大黃酚(批號：PS011322)、大黃素甲醚(批號：PS010626)，由成都普思生物科技有限公司提供，所有對照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%。

1.3 實驗樣品

20批掌葉大黃飲片購自藥店，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)王明偉副教授鑒定為蓼科植物掌葉大黃RheumpalmatumL.的干燥根或根莖。詳細(xì)信息如表1。

表1 大黃飲片樣品信息

2 結(jié)果與分析

2.1 供試品溶液制備

取1 g大黃粉末(過60目篩)，加30 mL 60%乙醇，置于具塞錐形瓶中，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，放冷，稱定質(zhì)量，用60%乙醇補足減失質(zhì)量，搖勻，濾紙濾過，取續(xù)濾液，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得[9]。

2.2 對照品溶液制備

精密稱取對照品沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷、大黃酸-8-O-葡萄糖苷、大黃素-1-O-葡萄糖苷、大黃酚-8-O-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-葡萄糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚各0.0251、0.0912、0.0422、0.0511、0.1521、0.0244、0.02312、0.0662、0.0374、0.0813、0.0355、0.1512、0.0072 g，以甲醇定容100 mL容量瓶以配制成0.25、0.91、0.42、0.51、1.5、0.24、0.23、0.66、0.37、0.81、0.35、1.52、0.72 mg/mL的混合對照品溶液，以鑒定樣品成分。

2.3 HPLC指紋圖譜的建立

2.3.1 色譜條件

色譜柱Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫：0～15 min，2%→15% A；15～20 min，15%→20% A；20～30 min，20%→20% A；30～60 min，20%→30% A；60～80 min，30%→55% A；80～90 min，55%→75% A；90～95 min，75%→80% A；95～100 min，80%→100% A；進樣量10 μL；檢測波長為254 nm；柱溫30 ℃；體積流量0.8 mL/min。

2.3.2 方法學(xué)考察

對精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性進行考察，結(jié)果表明樣品色譜圖相似度RSD均小于3%，符合要求。

2.3.3 指紋圖譜測定

各樣品按“2.1”項制備供試品溶液，按“2.3.1”項色譜條件進樣，建立大黃樣品HPLC指紋圖譜。圖1為對照圖譜，以鑒定大黃樣品中的成分。20批樣品色譜采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012版”軟件對指紋圖譜進行處理(見圖2)。結(jié)果表明各產(chǎn)地大黃飲片相似度在0.702～0.962之間，S1～S20相似度依次為 0.821、0.766、0.766、0.897、0.899、0.962、0.754、0.702、0.955、0.928、0.935、0.779、0.84、0.897、0.766、0.81、0.702、0.93、0.899、0.897。共確定14個共有峰，其中共有峰與對照指紋圖譜之間的相關(guān)系數(shù)均大于0.90，表明共有峰能夠標(biāo)示樣品成分特征。共有峰1～14的相對保留時間為3.31、4.08、8.07、8.87、9.41、18.71、25.91、67.11、74.88、77.56、79.21、86.44、92.72及95.53 min(見圖3)，峰面積如表2。通過對圖1與圖3的色譜圖對比發(fā)現(xiàn)共有峰1、2、3、4成分未知，共有峰5為沒食子酸、共有峰6為兒茶素，共有峰7為蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷，共有峰8未知，共有峰9為蘆薈大黃素，共有峰10為大黃酸，共有峰11未知，共有峰12為大黃素，共有峰13為大黃酚，共有峰14為大黃素甲醚。

表2 各共有峰峰面積

圖1 混合對照品(A)及大黃樣品(B)的HPLC色譜圖

圖2 樣品指紋圖譜

圖3 各共有峰圖譜

2.4 總多酚含量測定

配制沒食子酸濃度為0.51 mg/mL的對照品溶液。取“2.1”項供試品溶液0.02 mL、1 mL福林酚溶液、2.0 mL 15% Na2CO3溶液以蒸餾水定容10 mL容量瓶，40 ℃避光反應(yīng)40 min于760 nm 處測定吸光度A值。分取上述對照品溶液0.05、0.075、0.1、0.125、0.15、0.175 mL，按上述方法測定A值[10]，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，以吸光度值(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。總多酚含量以沒食子酸計。沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為y= 0.135 7x-0.093 1(R2=0.999 6，n=6)，線性范圍為0.002 5～0.008 9 mg/mL，線性關(guān)系良好，各樣品總多酚含量在4.92±0.21～10.12 ± 0.11 mg/g，如下圖4所示。

圖4 各樣品總多酚含量

2.5 總蒽醌含量測定

取樣品粉末1 g(過60目篩)，按照藥典方法制備[11]，甲醇-0.1%磷酸溶液(85∶15)，波長254 nm，進樣量10 μL。配制0.15、0.12、0.18、0.48、0.65 mg/mL的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的儲備溶液，按梯度稀釋，以峰面積為縱坐標(biāo)(y)，對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。色譜峰如下圖5所示。5種蒽醌類成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線如表3所示。總蒽醌含量如圖6所示，各樣品總蒽醌含量在1.06 ± 0.08～4.82 ± 0.12 mg/g之間，其中批號為170621的渭源縣產(chǎn)地大黃飲片總蒽醌含量不符合藥典要求。

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程

圖5 混合對照品(A)及大黃樣品(B)的HPLC色譜圖

圖6 各樣品總蒽醌含量

2.6 體外抗氧化試驗

2.6.1 DPPH 自由基清除能力測定

預(yù)先配置0.47 mg/L的DPPH溶液。取“2.1”項各供試品溶液0.01 mL稀釋至2 mL作樣品液。將試管標(biāo)記為A0、A1、A2。A0：2mL無水乙醇 + 2 mL DPPH溶液；A1：2 mL樣品 + 2 mL DPPH溶液；A2：2 mL樣品 + 2 mL無水乙醇；搖勻后避光反應(yīng)30 min，在517 nm處測吸光度A值[12]。DPPH自由基清除率按照如下公式計算。

2.6.2 ABTS清除能力測定

在避光、室溫條件下將20 mg ABTS與5 mL 2.4 mol/L的過硫酸鉀溶液混合反應(yīng)12 h得ABTS儲備液。以無水乙醇稀釋1.1 mL ABTS儲備液至100 mL作為工作液。依次加入4 mL ABTS工作液與0.02 mL供試液，室溫、避光放置30 min，于734 nm波長處測定，記為A1。A0：4 mL ABTS工作液 + 0.02 mL無水乙醇；A2：4 mL 無水乙醇 + 0.02 mL供試液[13]。ABTS自由基清除率如上“2.6.1”項公式計算。

各樣品對DPPH自由基清除能力與ABTS自由基清除能力各不同，其中對DPPH清除能力在(60.99± 0.09)%～(87.73 ± 0.22)%，對ABTS清除能力在(49.95 ± 0.11)%～(87.05 ± 0.21)%。各樣品清除率如表4所示。

表4 自由基清除率

2.7 建立大黃體外抗氧化譜效關(guān)系

采用DPS軟件、SIMCA 14.1軟件及IBM SPSS Statistics 26軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2.7.1 聚類分析

以共有峰峰面積為變量，以平方歐氏距離(Euclidean距離)為區(qū)間，采用組內(nèi)均連法對20批樣品指紋圖譜進行聚類熱圖(見圖7)。聚類分析結(jié)果可知，20批樣品可分為4類，S17、S7、S19、S5、S16等為一類，S15、S8、S12為一類，S13、S14、S4等為一類，其他為一類。即隴西縣、臨洮縣為一類；宕昌縣，禮縣為一類；岷縣，漳縣為一類，渭源縣為一類，結(jié)果表明各地區(qū)的掌葉大黃飲片質(zhì)量各異。

圖7 聚類熱圖

2.7.2 主成分分析(principal component analysis，PCA)

為進一步評價20批掌葉大黃飲片，以14種共有峰為變量進行PCA分析，結(jié)果見圖8。由PCA可知，結(jié)果與聚類分析基本一致。根據(jù)特征值和貢獻率選出主成分，結(jié)果見表5。以特征值>1，提取出主成分有5個，其累積貢獻率為 86.72%。完全符合累計貢獻率大于80%和以最少的主成分?jǐn)?shù)量來提供最多的原始數(shù)據(jù)所代表的信息的原則，故確定5個主成分。

表5 特征值與方差貢獻率

圖8 主成分分析圖

2.7.3 偏最小二乘回歸法(PLS)

基于主成分分析結(jié)果，建立了共有峰與DPPH清除率、ABTS清除率的偏最小二乘回歸分析?；貧w系數(shù)絕對值反映共有峰對自由基清除率的貢獻程度。變量重要性值(VIP)可評價自變量對因變量解釋的重要程度[15]，當(dāng)VIP >1表明自變量是重要因素。結(jié)果表明共有峰7(蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷)、1、10(大黃酸)、3、8、12(大黃素)具有清除DPPH自由基的作用。共有峰7、1、10、3、8、12及14(大黃素甲醚)具有清除ABTS自由基的作用(見圖9)。表明這些成分協(xié)同起到抗氧化作用。

圖9 各共有峰清除DPPH(A)和ABTS(B)自由基活性的變量重要性分析

2.7.4 灰色關(guān)聯(lián)度分析(grey relational analysis，GRA)

本實驗對原始數(shù)據(jù)采用初值化變換法，將清除率指標(biāo)作為母序列，以共有峰峰面積作為子序列[15]，結(jié)果見表6。關(guān)聯(lián)度越大則說明化學(xué)成分與抗氧化作用越強。由表6可知，共有峰與清除DPPH自由基活性的關(guān)聯(lián)度大于0.38，與清除ABTS自由基活性的關(guān)聯(lián)度大于0.34。共有峰2、9(蘆薈大黃素)、13(大黃酚)對清除DPPH自由基的貢獻最大，共有峰2、9、14(大黃素甲醚)對清除ABTS自由基貢獻最大，故可初步將這些化合物作為大黃抗氧化指紋圖譜藥效控制點。

表6 共有峰與抗氧化作用的灰色關(guān)聯(lián)度結(jié)果

2.7.5 總多酚、總蒽醌及自由基清除率的相關(guān)性分析

采用SPSS Statistics 26進行Pearson相關(guān)性分析。結(jié)果表明共有峰10(大黃酸)與清除DPPH自由基活性呈正相關(guān)。共有峰7(蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷)清除DPPH自由基活性呈負(fù)相關(guān)。以上結(jié)果說明，共有峰10(大黃酸)有利于清除DPPH自由基活性，而共有峰7(蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷)不利于清除DPPH自由基活性，這可能是因為DPPH法測定的機理是DPPH使待測有機物形成不穩(wěn)定的自由基中間體，進而雙分子偶聯(lián)，形成穩(wěn)定的最終產(chǎn)物，大黃酸屬單蒽核類1，8-二羥基蒽醌衍生物，1，8位羥基和9位羰基,形成完整的大π鍵共軛體系，在乙醇溶液中，大黃酸配合物可能不穩(wěn)定，易形成自由基中間體，從而表現(xiàn)抑制率較高，進而呈現(xiàn)正相關(guān)。而蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷在乙醇溶液中，較為穩(wěn)定，不易形成自由基中間體，從而表現(xiàn)抑制率較低，呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。共有峰13(大黃酚)與清除ABTS自由基活性呈弱正相關(guān)，這與文獻報道符合，大黃蒽醌類化合物具有較低的清除ABTS自由基活性能力，共有峰2、11與清除ABTS自由基活性負(fù)相關(guān)，這兩個化合物極有可能是不含或較少含有提供活性氫的羥基基團，清除ABTS自由基活性取決于化合物分子的結(jié)構(gòu)，酚羥基的數(shù)量和位置是影響其抗氧化活性的主要因素，能夠提供的活性氫越多，其抗氧化能力越強。這與沒食子酸、兒茶素或表兒茶素、雙花母草素等具有較強的清除ABTS自由基活性，而蒽醌類成分的清除作用較弱的研究結(jié)果一致[6]?？偠喾优c清除ABTS自由基活性顯著正相關(guān)，與清除DPPH自由基活性無顯著相關(guān)性?？傒祯c清除DPPH自由基活性負(fù)相關(guān)，與清除ABTS自由基活性無相關(guān)性。

2.8 體外抗氧化色譜峰對比

為了更清楚闡明大黃發(fā)揮抗氧化作用的成分，將大黃提取液分別與DPPH溶液及ABTS溶液反應(yīng)，通過反應(yīng)前后色譜峰面積說明發(fā)揮抗氧化作用的具體成分。操作步驟如下：取“2.1”項各供試品溶液0.05 mL作樣品液。將試管標(biāo)記為A0、A1、A2。A0：0.2 mL 60%乙醇 + 0.05 mL樣品液；A1：0.2 mL 2 mg/mL DPPH溶液 + 0.05 mL樣品液；A2：0.2 mL ABTS儲備液 + 0.05 mL樣品液；搖勻后避光反應(yīng)30 min，按“2.3.1”色譜條件進樣測定，即得大黃體外抗氧化反應(yīng)前后色譜圖(見圖10)。

圖10 A0、A1和A2的HPLC色譜圖

結(jié)果表明，大黃抗氧化作用是不同成分共同作用的結(jié)果，如表7在4.14 min共有峰2，9.45 min共有峰5(沒食子酸)峰面積明顯減少。清除ABTS自由基活性后，在23.84 min峰面積增加、而95.53 min共有峰14(大黃素甲醚)的峰面積顯著減少。清除DPPH自由基活性后，在92.93 min共有峰13(大黃酚)峰面積則顯著增加。

表7 反應(yīng)前后峰面積

3 討論與結(jié)論

20批大黃飲片總蒽醌含量在1.06 ± 0.08～4.82 ± 0.12 mg/g，總多酚含量在4.92 ± 0.21～10.12 ± 0.11 mg/g。可將20批大黃飲片可分為4類，即隴西縣、臨洮縣為一類，宕昌縣、禮縣為一類，岷縣、漳縣為一類，渭源縣為一類。共有峰7(蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷)、1、10(大黃酸)、2、9(蘆薈大黃素)具有清除DPPH自由基活性的作用，共有峰7、2、9、10、3、8、12(大黃素)、14(大黃素甲醚)具有清除ABTS自由基活性的作用，這與體外抗氧化色譜峰面積變化結(jié)果基本一致，表明大黃發(fā)揮抗氧化作用是多成分共同作用的結(jié)果。共有峰10(大黃酸)清除ABTS自由基呈現(xiàn)正相關(guān)，共有峰7(蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷)負(fù)相關(guān)。這可能是共有峰10(大黃酸)能形成完整的大π鍵共軛體系，在乙醇溶液中，大黃酸配合物可能不穩(wěn)定，易形成自由基中間體，從而表現(xiàn)抑制率較高，呈現(xiàn)正相關(guān)。共有峰7(蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷)在乙醇溶液中較為穩(wěn)定，不易形成自由基中間體，從而表現(xiàn)抑制率較低，呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。共有峰2、11清除ABTS自由基活性呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，這兩個化合物極有可能是不含或較少含有提供活性氫的羥基基團，清除ABTS自由基活性取決于化合物分子的結(jié)構(gòu)，酚羥基的數(shù)量和位置是影響其抗氧化活性的主要因素，能夠提供的活性氫越多，其抗氧化能力越強。因此，本課題后續(xù)完善上述未知共有峰的指認(rèn)和鑒定，從而進一步明確大黃體外抗氧化作用的藥效基礎(chǔ)。

本實驗考慮到多酚類成分因自身的不穩(wěn)定性，避免高溫條件對成分的損失而選擇超聲提取。對比色譜峰峰面積變化明顯的成分，后續(xù)通過制備液相分離出單體成進行抗氧化驗證，采用LC-MS技術(shù)及核磁技術(shù)鑒定分離產(chǎn)物，明確發(fā)揮作用的單一成分也是今后研究的方向。中藥指紋圖譜質(zhì)和量的特征和藥材生物學(xué)活性研究結(jié)果相聯(lián)系建立關(guān)聯(lián)數(shù)學(xué)表達式可用于評價中藥材質(zhì)量[9]。本文在建立大黃指紋圖譜，確定大黃飲片總蒽醌及總多酚含量的質(zhì)和量的基礎(chǔ)上進一步建立大黃體外抗氧化作用的譜效關(guān)系，明確了大黃清除DPPH自由基活性及ABTS自由基活性的有效群，明確了大黃發(fā)揮抗氧化作用的成分，如沒食子酸，大黃素，大黃素甲醚等，這為大黃抗氧化活性藥效物質(zhì)成分的篩選及區(qū)分不同產(chǎn)地大黃提供理論依據(jù)。