伍健繽 陳坤豪 陳木溪 陳長(zhǎng)明

摘要：蕓薹屬蔬菜種質(zhì)資源豐富，是中國(guó)蔬菜產(chǎn)業(yè)的重要組成部分。游離小孢子培養(yǎng)是創(chuàng)造單倍體和雙單倍體的重要途徑，對(duì)提高蕓薹屬蔬菜的育種效率具有重要意義。為了研究蕓薹屬蔬菜游離小孢子的高效培養(yǎng)體系，歸納了植物材料、預(yù)處理方式、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)密度、高溫?zé)峒ぁ⒅仓暝偕?、植株的倍性鑒定與加倍等多個(gè)因素對(duì)小孢子培養(yǎng)的影響，提出了可通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)體系、遺傳轉(zhuǎn)化和共培養(yǎng)等方式提高蕓薹屬蔬菜小孢子培養(yǎng)效率的觀點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：蕓薹屬蔬菜;游離小孢子;胚胎發(fā)生;植株再生;雙單倍體;育種

中圖分類號(hào)： S603.6???? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A???? 論文編號(hào)：cjas2020-0172

Isolated Microspore Culture ofBrassica Vegetables： A Review

WU Jianbin ， CHEN Kunhao123，， CHEN Muxi2，3， CHEN Changming1

（1College ofHorticulture， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， Guangdong， China;2Guangdong Helinong Seeds， CO.， LTD.， Shantou 515800， Guangdong， China;3Guangdong Helinong Agricultural Research Institute， CO.， LTD.， Shantou 515800， Guangdong， China）

Abstract： Brassica vegetable is rich in germplasm resources and has very important role in China’s vegetable industry. Isolated microspore culture is a considerable way to create haploid and double haploid， and is significant to improve the breeding efficiency of Brassica vegetables. In order to study the efficient culture system of isolated microspore of Brassica vegetables， the effects of plant materials， pretreatment methods， medium composition， culture density， heat shock， plantlet regeneration， ploidy identification and diploid inducement on microspore culture were summarized. It is proposed that the efficiency of isolated microspore culture of Brassica vegetables could be improved by the optimization of cultivation system， genetic transformation and co-culture treatment.

Keywords： Brassica vegetables; isolated microspores; embryogenesis; plantlet regeneration; double haploid; breeding

0引言

十字花科蕓薹屬蔬菜在中國(guó)栽培歷史悠久，品種資源豐富，在蔬菜周年供應(yīng)上占據(jù)重要地位。蕓薹屬蔬菜為異花授粉作物，雜種優(yōu)勢(shì)明顯，而在優(yōu)勢(shì)雜交育種的過(guò)程中，獲得一個(gè)純合親本至少需要5～6代的連續(xù)自交和選擇，且在親本純化過(guò)程中需要嚴(yán)格的隔離措施，否則很容易造成混雜。采用單倍體育種的方法，經(jīng) 1～2代即可獲得純合的育種材料，顯著提高育種效率[1-2]，同時(shí)也能為基因工程[3-4]、細(xì)胞工程[5]等研究提供試驗(yàn)材料。單倍體育種的主要途徑有花藥或小孢子培養(yǎng)、未受精的胚珠培養(yǎng)、輻照處理花粉和種間或?qū)匍g雜交誘導(dǎo)孤雌生殖[6]。通過(guò)游離小孢子培養(yǎng)獲得的單倍體，可自發(fā)地或通過(guò)加倍劑進(jìn)行二倍體化，得到完全純合的雙單倍體植株[7]，大大縮短材料純化年限，是一種快速創(chuàng)造穩(wěn)定育種材料的方法。

1982年Lichter[8]首次報(bào)道在甘藍(lán)型油菜上通過(guò)游離小孢子培養(yǎng)的方法獲得了再生植株，并發(fā)現(xiàn)小孢子胚胎形成的再生植株產(chǎn)量遠(yuǎn)高于花藥培養(yǎng)。此后，游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)在白菜[9]、結(jié)球甘藍(lán)[10]、菜心[11]、青梗菜[12]、芥藍(lán)[13]等多種蕓薹屬蔬菜及種間雜交種[14]上陸續(xù)獲得成功，并應(yīng)用于雙倍體育種、突變育種、轉(zhuǎn)基因育種、遺傳分析和生理研究等領(lǐng)域[15-17]。吳江生等[18]育成的‘華雙3號(hào)’是中國(guó)應(yīng)用小孢子培養(yǎng)技術(shù)育成的第一個(gè)油菜品種。鄧英等[19]通過(guò)小孢子培養(yǎng)技術(shù)選育出耐抽薹的葉用芥菜DH系，可用于補(bǔ)充春淡市場(chǎng)。

近年，游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但這一過(guò)程的機(jī)理尚不明確[20]，誘導(dǎo)效率受到物種、基因型、供體條件、培養(yǎng)基、小孢子的發(fā)育階段、培養(yǎng)方式和培養(yǎng)條件等多方面因素的影響，高效的培養(yǎng)體系尚未建立，該技術(shù)還未得到廣泛的應(yīng)用。

1影響小孢子培養(yǎng)的因素

1.1 植物材料

1.1.1 基因型供體植株的基因型是影響游離小孢子培養(yǎng)的重要因素，不同基因型的植株的產(chǎn)胚率[21]、生成再生植株的能力[22]和自然加倍率[23]不同。Zhang等[24]對(duì)29個(gè)基因型的羽衣甘藍(lán)進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)，6個(gè)基因型產(chǎn)生了胚狀體，其中有4個(gè)基因型獲得了再生植株。馮輝等[25]對(duì)15個(gè)品種的青梗菜小孢子進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)胚率最高的‘菜園’比最低的‘TAIKO’高116 倍。

1.1.2 生理狀態(tài)花蕾的取材部位、采樣時(shí)間、栽培地等都對(duì)小孢子的成胚能力有影響[26]，溫室栽培的甘藍(lán)出胚率高于大田栽培的甘藍(lán)[27]，日照時(shí)間為11～12 h的芥藍(lán)植株的胚狀體誘導(dǎo)率是日照時(shí)間為5～6 h 的3～7 倍[28]。每天摘除將開(kāi)放的花，使植株停留在蕾期階段，從而使得小孢子發(fā)育同步化程度較高，有利于小孢子提高產(chǎn)胚率[29]。

1.1.3 發(fā)育時(shí)期通常情況下處于單核靠邊期的小孢子出胚率最高，一般以花蕾長(zhǎng)度或花瓣/花藥的長(zhǎng)度比值（P/A）來(lái)進(jìn)行判斷，現(xiàn)蕾后的生長(zhǎng)天數(shù)[30]、花藥顏色[19]也能作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。不同基因型[10]或不同生長(zhǎng)狀態(tài)[27]單核靠邊期對(duì)應(yīng)的花蕾長(zhǎng)度不同，故用P/A進(jìn)行判斷更準(zhǔn)確。李枸[31]對(duì)油菜品種‘危斯里歐’的觀察發(fā)現(xiàn)，3.0～4.8 mm的花蕾小孢子大部分處于單核靠邊期。王娜等[32]認(rèn)為2.0～2.5 mm的蕪菁花蕾含單核靠邊期小孢子的比例最高。張恩慧等[30]對(duì)甘藍(lán)的研究表明，花蕾長(zhǎng)度在4.50～5.49 mm時(shí)，花粉細(xì)胞發(fā)育所處的單核靠邊期的小孢子平均所占比例為76%。張振超[33]認(rèn)為P/ A≈1可作為甘藍(lán)、青花菜、羽衣甘藍(lán)選擇合適花蕾的標(biāo)準(zhǔn)。菜薹花蕾長(zhǎng)2.5～3.5 mm，P/A為1/2～4/5時(shí)，大部分小孢子處于單核靠邊期[34]，此時(shí)產(chǎn)胚率最高。

1.2 預(yù)處理

為提高胚狀體的誘導(dǎo)率，需要對(duì)花蕾進(jìn)行預(yù)處理。張小玲等[35]通過(guò)對(duì)花椰菜的花蕾進(jìn)行磁場(chǎng)預(yù)處理，顯著提高了花藥培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)率。4℃低溫脅迫處理24～48 h 可提高游離小孢子胚胎發(fā)生的能力，最佳處理時(shí)間和基因型密切相關(guān)[36-37]，低溫預(yù)處理過(guò)程中加入適當(dāng)濃度的乙烯合成抑制劑氨氧乙基乙烯基甘氨酸對(duì)孢子甘藍(lán)小孢子胚的發(fā)生有積極影響[38]。但也有研究認(rèn)為4℃處理抑制甘藍(lán)型油菜小孢子胚胎的發(fā)生[39]。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 基本培養(yǎng)基蕓薹屬蔬菜小孢子培養(yǎng)中常用的培養(yǎng)基是NLN培養(yǎng)基和B5培養(yǎng)基[40-41]，但也有學(xué)者認(rèn)為1/2 NLN 培養(yǎng)基不僅能擴(kuò)大出胚基因型的范圍，還能提高胚狀體的誘導(dǎo)率。王超楠對(duì)10個(gè)品種的小白菜進(jìn)行小孢子培養(yǎng)，在NLN培養(yǎng)基中有7個(gè)品種獲得了胚狀體，而在1/2 NLN培養(yǎng)基中10個(gè)品種均獲得了胚狀體，且產(chǎn)胚率最高的品種‘菜園’的小孢子胚誘導(dǎo)率較使用NLN培養(yǎng)基提高了4.2倍[42]。

1.3.2 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂有重要作用，蕓薹屬蔬菜小孢子培養(yǎng)中常用的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是NAA 和6- BA[43-45]，另外，適當(dāng)濃度的噻苯隆[46]可提高菜心小孢子的胚胎發(fā)生能力、存活率以及二倍體植株的比例。不同作物或同種作物不同基因型的材料對(duì)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的有無(wú)、種類和水平的反應(yīng)不同。蕓苔素內(nèi)酯可提高小白菜小孢子胚發(fā)生的頻率和植株再生率，基因型為XM2的小白菜蕓苔素內(nèi)酯的最佳使用濃度為0.001 mg/L，而XM1和XM3的最佳使用濃度為0.002 mg/L[47]。王改改[48]認(rèn)為0.5～1.5μmol/L 的褪黑素能顯著提高甘藍(lán)胚狀體誘導(dǎo)效果，但不同材料對(duì)褪黑素濃度的要求不同。也有學(xué)者認(rèn)為大多數(shù)小孢子胚胎的發(fā)生不需要外源激素誘導(dǎo)[7]，未添加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中大白菜小孢子胚的誘導(dǎo)率高于添加6-BA、IBA和 NAA 的培養(yǎng)基[49]。

1.3.3 糖類糖類既充當(dāng)碳源，也有調(diào)節(jié)滲透壓的作用。不同作物對(duì)糖的種類和濃度的要求不同[50]，小白菜、青花菜、蕪菁等蕓薹屬蔬菜一般添加13%的蔗糖作為碳源[16，51-52]，而添加13%的麥芽糖作為碳源完全抑制甘藍(lán)型油菜胚狀體的產(chǎn)生[53]。甘藍(lán)添加蔗糖的最適濃度為14%[48，54]，在大白菜中添加10%的蔗糖的小孢子胚誘導(dǎo)率顯著高于13%和16%[55]。用含17%蔗糖的NLN 培養(yǎng)基培養(yǎng)1 天后，換成含13%蔗糖的培養(yǎng)基能顯著提高菜心和小菘菜小孢子胚的誘導(dǎo)率[56-57]，但會(huì)降低蕓薹小孢子胚的誘導(dǎo)效率[58]。用含17%蔗糖的NLN 培養(yǎng)基培養(yǎng)甘藍(lán)小孢子3天后轉(zhuǎn)至含10%蔗糖的培養(yǎng)基可提高胚產(chǎn)量，較一直用含13%蔗糖的培養(yǎng)基的胚產(chǎn)量提高255.2%[59]。

1.3.4 其他添加物在培養(yǎng)基中添加活性炭可吸附在培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的有毒物質(zhì)，對(duì)胚狀體的發(fā)生和成熟都有促進(jìn)作用[60]，但活性炭也會(huì)吸附激素、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的等有益成分[61]，戴希剛等[62]認(rèn)為添加活性炭對(duì)小孢子胚的發(fā)生無(wú)促進(jìn)作用，因此活性炭應(yīng)酌情添加?？箟难猁}、胱谷甘肽等抗氧化劑[63]、組蛋白去乙酰化抑制劑[64]、等均可促進(jìn)蕓薹屬蔬菜小孢子胚的發(fā)生和植株再生。曾愛(ài)松等[65]添加10 mg/L的阿拉伯半乳聚糖或阿拉伯半乳糖蛋白可促進(jìn)胚狀體的形成。非離子型表面活性劑對(duì)小孢子胚的發(fā)生也有促進(jìn)作用，0.0001%的吐溫20、曲拉通X-100和普朗尼克F-68均能顯著增加紫菜苔小孢子胚發(fā)生的頻率，吐溫20可使植株再生率增加30%[66]。

1.4 培養(yǎng)密度

小孢子的培養(yǎng)密度也是影響胚胎誘導(dǎo)的重要培養(yǎng)條件，小孢子濃度過(guò)高和過(guò)低都不利于胚的發(fā)育。密度過(guò)高時(shí)，不僅會(huì)消耗大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還會(huì)使釋放的有毒物質(zhì)濃度升高;小孢子發(fā)育具有群體效應(yīng)，過(guò)低的密度同樣會(huì)影響小孢子胚的發(fā)生。大白菜[67]、芥菜[68]、青花菜[69]、菜心[70]等蕓薹屬蔬菜的小孢子培養(yǎng)密度一般在1×105～2×105個(gè)/mL 為宜。但不同種或同一品種不同基因型植株對(duì)相同的培養(yǎng)密度有不同反應(yīng)。基因型為 KTCBH-2085、KTCBH-6621和 KTCBH-6045的甘藍(lán)最適培養(yǎng)密度為4×106個(gè)/mL，而‘Golden Acre’的最適培養(yǎng)密度為6×106個(gè)/mL[10]。

1.5 高溫?zé)峒?/p>

高溫?zé)峒な切℃咦拥姆只瘑?dòng)所必須的[71]，可有效提高小孢子對(duì)稱分裂比例，增加胚狀體的形成[72]。同一物種不同基因型對(duì)相同的處理溫度、時(shí)間和培養(yǎng)密度有不同的反應(yīng)[10]。蕓薹屬蔬菜一般采用（32.5± 0.5）℃熱激處理24 h 來(lái)提高小孢子的成胚能力[61]，而（32±0.5）℃處理48 h對(duì)青花菜[16]、大白菜[55]的成胚誘導(dǎo)效果更好。Wang等[73]認(rèn)為32℃處理18 h有利于紫菜薹小孢子存活，維持細(xì)胞分裂并進(jìn)一步誘導(dǎo)胚狀體形成。

1.6 胚狀體發(fā)生及植株再生

少數(shù)游離小孢子在經(jīng)脅迫誘導(dǎo)后發(fā)生重編程，從配子體發(fā)育途徑轉(zhuǎn)變?yōu)榕咛グl(fā)生途徑，細(xì)胞死亡率高和重編程效率低是限制小孢子成胚的重要因素[7]。游離小孢子在高溫培養(yǎng)24 h后，可見(jiàn)部分小孢子直徑增大，此時(shí)小孢子膨大的數(shù)量及比例是快速評(píng)估最終產(chǎn)胚率的參考指標(biāo)[74]。3～4天后小孢子開(kāi)始第一次分裂，8～9天可見(jiàn)細(xì)胞團(tuán)，11～13天原胚出現(xiàn)，進(jìn)而發(fā)育成球形胚、心形胚、魚(yú)雷形胚子葉形胚或畸形胚。然后將胚移至MS 或B5培養(yǎng)基，給予光照，誘導(dǎo)植株再生。其中子葉型胚的植株再生頻率最高[75]，通過(guò)搖床震蕩培養(yǎng)可促進(jìn)子葉形胚形成，提高胚胎發(fā)育的同步性[76]。此外，胚的再生頻率還與基因型有關(guān)[36]。B5固體培養(yǎng)基中添加1%瓊脂、3.0 mg/L或5.0 mg/L硝酸銀，并在4℃下處理2天或5天可顯著提高植株的再生率[77]。

2植株的倍性鑒定與加倍

通過(guò)游離小孢子培養(yǎng)獲得的再生植株是單倍體、二倍體、多倍體和非整倍體構(gòu)成的混合群體[78]。植株倍性鑒定的方法主要有：形態(tài)學(xué)法[79]、花粉粒形態(tài)分辨法[80]、根尖或側(cè)枝生長(zhǎng)點(diǎn)染色體計(jì)數(shù)法[81]、氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體計(jì)數(shù)法[82]、氣孔長(zhǎng)直徑測(cè)量法[81]、DNA流式細(xì)胞儀法[83]等。

2.1 自然加倍

自然加倍可能來(lái)源于未減數(shù)分裂的配子，或最初幾次原胚的核內(nèi)有絲分裂，具有不會(huì)出現(xiàn)核畸變的優(yōu)點(diǎn)[84]。不同植株或不同培養(yǎng)條件所產(chǎn)生的再生植株自然加倍率不同，羽衣甘藍(lán)的植株的自然加倍率為23.33%～37.50%[85]，青花菜的自然加倍率為 30%～ 35%[16]。

2.2 人工加倍

通過(guò)加倍劑處理小孢子細(xì)胞或再生植株幼苗可實(shí)現(xiàn)人工加倍[86]，秋水仙素是一種常用的染色體加倍劑，但也具有較大的毒性[87]，使用濃度越高、處理時(shí)間越長(zhǎng)，植株死亡率越高[33]。因此需要權(quán)衡好濃度、處理時(shí)間和加倍效率之間的關(guān)系。用70 mg/L的秋水仙素處理羽衣甘藍(lán)幼苗 9～11天，加倍率達(dá) 54.55%[85];用200 mg/L秋水仙堿處理甘藍(lán)、青花菜和羽衣甘藍(lán)的再生植株幼苗20 h，獲得的效果最好[33]。但人工加倍產(chǎn)生嵌合株的比例高于自然加倍，用1%秋水仙素處理青花菜幼苗的嵌合株發(fā)生率為8%，高于自然加倍的5%[88]。 3展望

近年來(lái)，研究者們對(duì)小孢子胚胎發(fā)生的動(dòng)態(tài)過(guò)程、細(xì)胞學(xué)分析和分子基礎(chǔ)的認(rèn)識(shí)都有所提高，技術(shù)也越來(lái)越成熟[89-90]。但基因型仍是影響游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用的主要難題，不同種或者是同種不同基因型植株在同一培養(yǎng)條件下的產(chǎn)胚率存在差異，高效、通用的小孢子培養(yǎng)體系尚未建立。培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)密度等也都是影響小孢子培養(yǎng)的重要因素，且同一影響因素在不同的研究中作用效果不一。例如，一般認(rèn)為培養(yǎng)基中添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)小孢子胚的發(fā)生有促進(jìn)作用，而有的學(xué)者認(rèn)為小孢子胚的產(chǎn)生無(wú)需外源激素。這些影響因素的作用機(jī)制尚未研究透徹，不利于小孢子培養(yǎng)體系的優(yōu)化。

進(jìn)一步研究各因素對(duì)小孢子胚胎發(fā)生、植株再生和再生植株加倍的影響，深入探討小孢子發(fā)育的調(diào)控機(jī)理，對(duì)于蕓薹屬蔬菜的基礎(chǔ)研究和育種實(shí)踐尤為重要。為提高小孢子胚胎發(fā)生的頻率，可以從以下方面進(jìn)行嘗試。

（1）探討花蕾形態(tài)與小孢子發(fā)育時(shí)期的關(guān)系，明確最佳取材時(shí)間;從預(yù)處理方式、培養(yǎng)基成分、熱激處理、培養(yǎng)條件等方面繼續(xù)優(yōu)化蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養(yǎng)的體系，探索不同品種通用的高效培養(yǎng)體系。

（2）由于材料的基因型與出胚率密切相關(guān)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)胚狀體發(fā)生能力具有加性效應(yīng)，高胚發(fā)生能力由顯性核基因控制，因此先鑒定到影響胚狀體發(fā)生能力的關(guān)鍵基因，然后通過(guò)雜交或遺傳轉(zhuǎn)化等方式，將易成胚的基因轉(zhuǎn)化到難成胚的品種上，從而提高蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養(yǎng)的產(chǎn)胚率和植株再生率。

（3）張振超等[91]將甘藍(lán)類植物小孢子與青花菜小孢子共培養(yǎng)，提高了青花菜小孢子胚胎發(fā)生率、胚胎質(zhì)量及植株再生率。因此，將易成胚的材料與難成胚的材料共培養(yǎng)也是一個(gè)可以嘗試的新思路。

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