黃方舟，黃 艷，馮 習(xí)，黃佩琦 (長(zhǎng)沙市第四醫(yī)院急診急救中心,湖南 長(zhǎng)沙 410006)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是由各種直接或間接損傷因素導(dǎo)致的臨床綜合征，特征為肺水腫、炎癥反應(yīng)和表面活性物質(zhì)功能障礙，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征和低氧血癥等[1-2]。因此，探索新的ALI治療方法和治療靶點(diǎn)非常有必要。

造成肺損傷的主要原因是機(jī)體炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激失衡。炎癥反應(yīng)涉及炎癥細(xì)胞的活化和炎癥細(xì)胞因子的釋放，會(huì)引起肺損傷和進(jìn)一步的急性低氧性呼吸功能不全或呼吸衰竭[3]。當(dāng)機(jī)體受到不利刺激時(shí)，氧化和抗氧化過(guò)程會(huì)變得不平衡，導(dǎo)致過(guò)氧化產(chǎn)物，包括活性氧(reactive oxygen species，ROS)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)積累，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[4]。此外，過(guò)氧化產(chǎn)物的積累也與炎癥反應(yīng)的激活有關(guān)。ROS可通過(guò)核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)途徑和染色質(zhì)重塑調(diào)節(jié)促炎因子的表達(dá)。據(jù)報(bào)道，抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激可有效減輕脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的ALI[5]。這種抑制作用是通過(guò)阻斷Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)/NF-κB途徑和核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)/血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1，HO-1)途徑實(shí)現(xiàn)的[6]。因此，炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激可能是ALI的治療靶標(biāo)。甲潑尼龍是一種人工合成的糖皮質(zhì)激素，具有較強(qiáng)的抗炎活性，對(duì)多種疾病(如內(nèi)分泌失調(diào)、風(fēng)濕性疾病、膠原性病、皮膚疾病、過(guò)敏反應(yīng)等)具有治療作用。糖皮質(zhì)激素治療呼吸道疾病的應(yīng)用價(jià)值已得到臨床證實(shí)，甲潑尼龍也被廣泛應(yīng)用于呼吸道疾病的治療[7-9]。甲潑尼龍作為一種免疫抑制劑在減少COVID-19患者的呼吸道炎癥方面效果理想[10]；靜脈注射甲潑尼龍可迅速改善非感染性葡萄膜炎；甲潑尼龍可減輕圍產(chǎn)期中風(fēng)缺氧缺血模型大鼠持續(xù)的缺血后炎癥反應(yīng)，對(duì)L-精氨酸誘導(dǎo)的急性胰腺炎具有抗炎和抗氧化作用[11]；甲潑尼龍琥珀酸鈉可減少顱內(nèi)出血模型小鼠的血腦屏障破壞和炎癥；甲潑尼龍?jiān)诜谓M織中具有很強(qiáng)的滲透性，可用于治療慢性阻塞性肺病，起效迅速且抗炎作用顯著。另外，靜脈滴注甲潑尼龍還可以促進(jìn)藥物對(duì)全身的作用，減少機(jī)體的炎癥反應(yīng)，對(duì)緩解患者癥狀效果較好。但目前甲潑尼龍治療呼吸道疾病的作用機(jī)制尚不明確，因此，本研究通過(guò)探討甲潑尼龍對(duì)ALI的作用和相關(guān)分子機(jī)制，旨在為其臨床應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑

LPS(阿拉丁，上海)，甲潑尼龍(批號(hào)：100828-201603，常州四藥制藥有限公司)，地塞米松(批號(hào)：101116-202002，成都天臺(tái)山制藥有限公司)，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和白介素-6(interleukin-6，IL-6)試劑盒(博士德生物工程有限公司，武漢)，MDA、過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒(碧云天，上海)，高遷移率族蛋白β1(chigh mobility group protein 1,HMGB1)、TLR4和TLR5抗體(Proteintech中國(guó)分公司，武漢)，Myd88、p65、p-P65、IκBα、p-IκBα一抗(Cincinnati，USA)，anti-GAPDH(Santa Cruz，USA)。

1.2 動(dòng)物

48只SPF級(jí)雄性SD大鼠(湖南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SCXK湘2016-0001)，體質(zhì)量250～300 g，動(dòng)物自由攝食飲水，飼養(yǎng)于溫度22～25 ℃和黑暗12 h/白天12 h的環(huán)境下，本研究通過(guò)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 ALI造模與分組

48只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組(ALI)、低劑量(甲潑尼龍0.4 mg/kg)組、中劑量(甲潑尼龍4 mg/kg)組、高劑量(甲潑尼龍40 mg/kg)組和陽(yáng)性藥(地塞米松2 mg/kg)組，每組8只。參考文獻(xiàn)[12-13]，給予LPS(2 mg/kg)前1 h，對(duì)照組和模型組腹腔注射生理鹽水，甲潑尼龍組和陽(yáng)性藥組腹腔注射相應(yīng)劑量的甲潑尼龍或地塞米松，然后LPS刺激12 h，處死大鼠。

1.4 蘇木精—伊紅(HE)染色

收集肺組織樣本，用10%甲醛固定24 h，然后石蠟包埋，并切片(5 μm)。根據(jù)說(shuō)明書用蘇木精和伊紅染色，顯微鏡下觀察肺組織病理變化。參考文獻(xiàn)[14]進(jìn)行肺損傷評(píng)分，肺泡充血、肺泡壁增厚和水腫、肺泡細(xì)胞浸潤(rùn)等3個(gè)指標(biāo)按照無(wú)、輕度、中度、嚴(yán)重4個(gè)等級(jí)分為0、1、2、3分，最高分別為3分，總分為9分。

1.5 肺濕干重比值(wet/dry weight ratio,W/D)

解剖分離新鮮的大鼠肺組織，測(cè)量肺組織的濕重；然后將肺組織置于70 ℃的烤箱中24 h，去除所有水分，測(cè)量干重，計(jì)算肺組織的W/D。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)

使用ELISA試劑盒根據(jù)說(shuō)明書檢測(cè)肺灌洗液中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。

1.7 肺組織中MDA、MPO和SOD含量

將肺組織勻漿并離心，使用放射免疫沉淀裂解緩沖液裂解細(xì)胞，然后將裂解物離心以獲得上清液。采用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，然后用生理鹽水稀釋至1 mg/mL。隨后，根據(jù)說(shuō)明書使用MDA、MPO和SOD試劑盒測(cè)定含量。

1.8 Western blot

提取肺組織總蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。通過(guò)10% SDS-PAGE分離等量(20 μg)的蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，將蛋白與一抗(HMGB1、TLR4、TLR5、Myd88、p65、p-p65、IκBα、p-IκBα、GAPDH，按1∶1 000稀釋)在4 ℃下孵育過(guò)夜。隨后，將膜與HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體或羊抗鼠二抗(1∶5 000)在室溫下孵育2 h。用化學(xué)發(fā)光試劑顯色，并通過(guò)Gel-Pro-Analyzer軟件分析光密度值。將GAPDH作為內(nèi)參，以標(biāo)準(zhǔn)化目標(biāo)蛋白表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 甲潑尼龍對(duì)ALI大鼠肺損傷和W/D的影響

組織病理學(xué)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組出現(xiàn)肺泡出血和肺泡隔水腫，中性粒細(xì)胞大量浸潤(rùn)到肺泡內(nèi)間隔和肺泡間隙；低劑量組也出現(xiàn)了上述變化；但與模型組比較，中劑量組、高劑量組及陽(yáng)性藥組上述炎癥變化顯著減弱(圖1a)。肺損傷評(píng)分和W/D結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺損傷評(píng)分和W/D增加(P<0.001)，但中劑量組、高劑量組及陽(yáng)性藥組肺損傷評(píng)分和W/D較模型組均減少(P<0.01)，見(jiàn)圖1b、c。

a：HE染色結(jié)果；b：肺損傷評(píng)分；c：肺組織W/D ###：與對(duì)照組比較，P<0.001；***：與模型組比較，P<0.001

2.2 甲潑尼龍對(duì)ALI大鼠肺灌洗液中炎癥因子的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺灌洗液中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β的含量顯著增加(P<0.001)；與模型組比較，低劑量組、中劑量組和高劑量組及陽(yáng)性藥組大鼠肺灌洗液中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β含量顯著降低(P<0.01)，但陽(yáng)性藥組與高劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2。

a：TNF-α含量；b：IL-6含量；c：IL-1β含量 ###：與對(duì)照組比較，P<0.001；**：與模型組比較，P<0.01;***：與模型組比較，P<0.001

2.3 甲潑尼龍對(duì)ALI大鼠肺組織氧化應(yīng)激因子的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織中MPO活性和MDA含量顯著增加(P<0.001)，SOD活性顯著降低(P<0.001)；與模型組比較，中劑量組、高劑量組及陽(yáng)性藥組大鼠肺組織中MPO活性和MDA含量顯著降低(P<0.05)，SOD活性增加(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

a：MPO活性；b：MDA含量；c：SOD活性 ###：與對(duì)照組比較，P<0.001；*：與模型組比較，P<0.05；**：與模型組比較，P<0.01；***：與模型組比較，P<0.001

2.4 甲潑尼龍對(duì)ALI大鼠肺組織NF-κB信號(hào)分子表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織中p-p65和p-IκBα蛋白表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05)；低劑量組、中劑量組、高劑量組和陽(yáng)性藥組大鼠肺組織中p-p65和p-IκBα蛋白表達(dá)水平較模型組下調(diào)(P<0.05)，但各組大鼠肺組織中p65蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖4。

#：與對(duì)照組比較，P<0.05；*：與模型組比較，P<0.05

2.5 甲潑尼龍對(duì)HMGB1/TLRs信號(hào)分子表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織中HMGB1、TLR4和TLR5蛋白表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05)；中劑量組、高劑量組和陽(yáng)性藥組大鼠肺組織中HMGB1、TLR4和TLR5蛋白表達(dá)水平較模型組下調(diào)(P<0.05)；高劑量組與陽(yáng)性藥組HMGB1、TLR4和TLR5蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖5。

#：與對(duì)照組比較，P<0.05；*：與模型組比較，P<0.05

3 討論

ALI作為一種嚴(yán)重的炎癥性疾病，是急性呼吸衰竭綜合征，由與肺炎、嚴(yán)重膿毒癥、胃食管反流、肺泡出血等相關(guān)的肺泡—毛細(xì)血管屏障障礙引起，其發(fā)病率和病死率均較高。但目前臨床尚無(wú)有效的ALI藥物，故預(yù)防具有重要意義。糖皮質(zhì)激素是一類有效的抗炎藥，其主要通過(guò)與細(xì)胞質(zhì)糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合發(fā)揮作用。糖皮質(zhì)激素受體復(fù)合物可與特定的DNA序列(糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件)結(jié)合，從而激活基因轉(zhuǎn)錄，或與DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子(如NF-κB和激活蛋白-1)結(jié)合,調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子(如IL-6、IL-17a和TNF-α等)的轉(zhuǎn)錄。此外，糖皮質(zhì)激素與天然抗炎細(xì)胞因子(如IL-1、IL-4、IL-10和IL-13受體拮抗劑)具有協(xié)同作用。但目前臨床關(guān)于人工合成型糖皮質(zhì)激素甲潑尼龍抗ALI的研究較少，故本研究就甲潑尼龍的抗ALI活性和相關(guān)機(jī)制展開(kāi)探討。

炎癥反應(yīng)是肺損傷的重要原因，在炎癥過(guò)程中，炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)級(jí)聯(lián)炎癥信號(hào)。TNF-α具有很強(qiáng)的炎癥破壞能力，是人體內(nèi)最強(qiáng)的炎癥介質(zhì)之一；IL-6是表征炎癥性疾病嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)；IL-1β是炎癥的主要介質(zhì)，可破壞血管內(nèi)皮和肺上皮細(xì)胞。有研究發(fā)現(xiàn)，在肺損傷動(dòng)物模型和急性呼吸窘迫綜合征患者中均觀察到嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)和大量的炎癥因子(IL-1β、TNF-α和IL-6)[15-16]。此外，有研究表明包括IL-6在內(nèi)的炎癥因子的高表達(dá)還與急性呼吸窘迫綜合征患者的預(yù)后不良有關(guān)[17]。本研究結(jié)果顯示，LPS處理的大鼠炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量增加，與先前的結(jié)果一致[5]；而甲潑尼龍可以顯著降低ALI大鼠肺灌洗液中的炎癥因子含量，并且能夠抑制中性粒細(xì)胞大量浸潤(rùn)到肺泡內(nèi)間隔和肺泡間隙，對(duì)ALI大鼠表現(xiàn)出抗炎活性。

氧化應(yīng)激是造成肺損傷的另一個(gè)重要原因，其不僅可以直接損傷肺組織，還可以通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)間接損傷肺組織[18]。氧化應(yīng)激指標(biāo)包括MPO、MDA和SOD等。MPO活性是肺組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的標(biāo)志，隨著ALI發(fā)展，大量的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)到肺泡間隙，MPO活性增加。SOD是體內(nèi)的一種抗氧化酶，當(dāng)肺組織受損時(shí)，清除的氧自由基被大量消耗，SOD活性降低。MDA是一種脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，當(dāng)肺組織受損時(shí)，會(huì)與氧自由基含量成比例增加。本研究結(jié)果顯示，甲潑尼龍可以顯著抑制ALI大鼠肺組織MPO活性，并降低MDA含量，同時(shí)提高SOD活性，說(shuō)明甲潑尼龍具有良好的抗氧化活性。以LPS誘導(dǎo)動(dòng)物模型可引起肺組織中MPO和MDA的積累，與肺損傷患者臨床變化一致，表明氧化應(yīng)激在誘導(dǎo)肺損傷中起關(guān)鍵作用[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的藥物可有效減輕肺損傷，包括蝦青素、蟲(chóng)草素和蒙花苷等[19-20]。上述研究結(jié)果說(shuō)明甲潑尼龍可能通過(guò)調(diào)控機(jī)體氧化應(yīng)激發(fā)揮抗肺損傷活性。

HMGB1是高度保守的非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，與多種肺部疾病有關(guān)，包括肺炎、肺結(jié)核、慢性阻塞性肺部疾病、肺纖維化等[21-22]。正常情況下，HMGB1主要集中于細(xì)胞核，但當(dāng)細(xì)胞受損或壞死時(shí)，HMGB1的賴氨酸殘基被乙酰化并遷移到細(xì)胞質(zhì)，然后在溶血磷脂酰膽堿作用下被分泌到細(xì)胞外[23]。細(xì)胞外HMGB1作用于Toll受體，通過(guò)激活NF-κB參與炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)[24]。HMGB1是TLR4的上游調(diào)節(jié)劑，在LPS誘導(dǎo)的肺損傷中，HMGB1介導(dǎo)了TLR4/NF-κB信號(hào)通路的激活，而HMGB1的下調(diào)阻斷了TLR4/NF-κB信號(hào)通路[25]。在LPS刺激下，IκBα磷酸化，且與NF-κB二聚體(p65和p50)分離，隨后被蛋白酶體降解?；罨腘F-κB從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，與靶基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子中的κB位點(diǎn)結(jié)合，然后p65被蛋白激酶磷酸化，引發(fā)炎癥因子和氧化應(yīng)激相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄[26]。因此，NF-κB通路對(duì)于誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激至關(guān)重要。此外，研究發(fā)現(xiàn)TLR4/NF-κB途徑的阻斷可有效抑制肺部的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[27]。因此，HMGB1/TLR4/NF-κB途徑是誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的重要通路。據(jù)報(bào)道，TLR5在炎癥性疾病和組織中高表達(dá)，TLR5的敲低顯著降低了炎癥因子的釋放，TLR5也可以激活NF-κB通路[28-29]。本研究結(jié)果顯示，LPS處理上調(diào)了肺組織中HMGB1、TLR4、TLR5、p-p65和p-IκBα的表達(dá)水平，但甲潑尼龍抑制了其表達(dá)。這說(shuō)明甲潑尼龍可能通過(guò)HMGB1/TLRs/NF-κB途徑抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激。

綜上所述，LPS可引發(fā)ALI，并伴有肺水腫、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的增加，而甲潑尼龍可以通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激緩解ALI。此外，甲潑尼龍還可通過(guò)阻斷HMGB1/TLRs/NF-κB途徑減輕LPS誘導(dǎo)的ALI。