吳敬峰，趙亞丹，朱文明，及 超，李聰杰 (.保定市第二醫(yī)院骨二科,河北 保定 07000;.河北大學(xué)附屬醫(yī)院骨科,河北 保定 07000)

骨質(zhì)疏松癥是一種慢性代謝性骨病，主要表現(xiàn)為骨的脆性增加，極易發(fā)生骨折，骨量減少和骨微結(jié)構(gòu)的破壞是其基礎(chǔ)病理特征，多見于絕經(jīng)婦女[1]。目前常用激素替代療法防治絕經(jīng)婦女的骨質(zhì)疏松癥，但存在致癌風(fēng)險(xiǎn)和陰道出血等不良反應(yīng)，患者接受度較低[2]。在骨損傷或骨科手術(shù)后，患者常使用阿片類藥物緩解急性疼痛，然而阿片類藥物對(duì)骨形成和骨愈合存在負(fù)面影響，可能增加骨折的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[3]。有研究指出，阿片類藥物瑞芬太尼可上調(diào)成骨前C2C12細(xì)胞中Runx2/osterix表達(dá)，從而促進(jìn)骨形成[4]。舒芬太尼屬于阿片受體激動(dòng)藥物[5]，但其在骨形成與骨愈合中是否也具有調(diào)控作用尚不清楚。故本研究采用雙側(cè)卵巢切除術(shù)(ovariectomy，OVX)建立絕經(jīng)骨質(zhì)疏松大鼠模型，探討舒芬太尼對(duì)模型大鼠骨小梁結(jié)構(gòu)及骨代謝的影響，以期為骨質(zhì)疏松癥的臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

50只雌性SPF級(jí)SD大鼠，3月齡(未經(jīng)產(chǎn))，體質(zhì)量240～280 g，購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公共服務(wù)平臺(tái)，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(冀)2020-001。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度22～24 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，每12 h晝夜交替照明。

1.2 藥物與試劑

枸櫞酸舒芬太尼注射液購于宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司，規(guī)格2 mL/100 μg；TRAP染色試劑盒購于德國(guó)Sigma Aldrich；成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子抗體(osteogenesis-related transcription factor antibody，Osx)、膠原蛋白Ⅰ(collagen Ⅰ，Colla1)、遠(yuǎn)中缺失同源盒基因2(distal-less homeobox 2，Dlx2)、破骨細(xì)胞相關(guān)受體(osteoclast-associated receptor，OSCAR)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)蛋白一抗工作液購于美國(guó)Abcam。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物造模、分組及給藥 50只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組、OVX組、OVX+低、中、高劑量舒芬太尼組(1、2、4 μg/kg)[6]，每組10只。所有大鼠腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，假手術(shù)組僅切除卵巢周圍部分脂肪組織，其他組均行雙側(cè)OVX，術(shù)后注意預(yù)防感染。術(shù)后第8周，采用雙能X射線檢測(cè)大鼠股骨骨密度，確定骨質(zhì)疏松大鼠造模是否成功[7]。造模成功后OVX+低、中、高劑量舒芬太尼組分別腹腔注射1、2、4 μg/kg舒芬太尼，假手術(shù)組和OVX組給予等體積生理鹽水，每周給藥1次，連續(xù)8周。

1.3.2 樣本采集 完成給藥后禁食12 h，麻醉大鼠取出股骨，剔除肌肉組織，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗后置于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 uCT檢測(cè)骨組織形態(tài) 取大鼠股骨，以浸潤(rùn)生理鹽水的紗布包裹，垂直放于樣品杯中，隨后放入uCT掃描儀(瑞士Scanco Medical)內(nèi)進(jìn)行骨小梁微結(jié)構(gòu)分析，觀察參數(shù)包括骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁分離度(trabecular separation，Tb.Sp)、骨體積分?jǐn)?shù)(bone volume/total volume，BV/TV)、骨小梁數(shù)量及軟骨數(shù)量。

1.3.4 HE染色觀察股骨組織損傷情況 將大鼠股骨組織置于4%多聚甲醛固定24 h，再用EDTA脫鈣液處理15 d，制備4 μm石蠟切片，行常規(guī)HE染色，觀察大鼠股骨組織病理損傷情況。

1.3.5 TRAP染色檢測(cè)破骨細(xì)胞數(shù)量變化情況 取股骨組織石蠟切片，經(jīng)常規(guī)脫蠟水化后，滴加固定液固定組織30 s，再添加TRAP染色劑，37 ℃避光孵育1 h，甲基綠復(fù)染30 s后封片保存，光鏡下觀察骨小梁表面黏附的破骨細(xì)胞數(shù)量變化情況。

1.3.6 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)骨勻漿液中骨標(biāo)記基因mRNA水平 取股骨組織制備骨勻漿液，加入Trizol裂解液提取總RNA，確定RNA質(zhì)量后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA鏈，再經(jīng)實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 5 min，變性95 ℃ 15 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，以GAPDH為內(nèi)參，應(yīng)用2-ΔΔCt公式計(jì)算Osx、Colla1、Dlx2、OSCAR、TRAP mRNA水平。

1.3.7 蛋白印跡檢測(cè)骨勻漿液中骨標(biāo)記蛋白表達(dá) 取股骨組織制備骨勻漿液，加入RIPA裂解液提取總蛋白，測(cè)定蛋白濃度后經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，再采用濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行電轉(zhuǎn)，取出PVDF膜浸于5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h，接著浸于1∶1 000一抗工作液中4 ℃搖床孵育過夜，次日浸于1∶5 000二抗工作液中37 ℃搖床孵育45 min，最后添加ECL發(fā)光試劑顯影。以β-actin為內(nèi)參，Osx、Colla1、Dlx2、OSCAR、TRAP蛋白灰度值與β-actin灰度值的比值表示其相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 舒芬太尼對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠股骨骨小梁微結(jié)構(gòu)的影響

與假手術(shù)組比較，OVX組大鼠股骨BV/TV、Tb.Th水平均降低，Tb.Sp水平升高(P<0.05)；與OVX組比較，OVX+中、高劑量舒芬太尼組BV/TV、Tb.Th水平均升高，Tb.Sp水平降低(P<0.05)，見圖1。

a：股骨骨小梁微結(jié)構(gòu)uCT掃描圖像；b：BV/TV；c：Tb.Th；d：Tb.Sp 1：假手術(shù)組；2：OVX組；3：OVX+低劑量舒芬太尼組；4：OVX+中劑量舒芬太尼組；5：OVX+高劑量舒芬太尼組；*：與假手術(shù)組比較，P<0.05；#：與OVX組比較，P<0.05

2.2 舒芬太尼對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠股骨組織損傷的影響

HE染色顯示，假手術(shù)組骨小梁結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，排列完整；OVX組骨小梁結(jié)構(gòu)明顯破壞，排列無規(guī)則；與OVX組比較，OVX+低、中、高劑量舒芬太尼組骨小梁結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，排列趨于緊密，見圖2。

箭頭：骨小梁

2.3 舒芬太尼對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨小梁數(shù)量及軟骨數(shù)量的影響

與假手術(shù)組比較，OVX組大鼠骨小梁數(shù)量及軟骨數(shù)量均減少(P<0.05)；與OVX組比較，OVX+中、高劑量舒芬太尼組骨小梁數(shù)量及軟骨數(shù)量均增加(P<0.05)，見圖3。

a：骨小梁數(shù)量；b：軟骨數(shù)量 1：假手術(shù)組；2：OVX組；3：OVX+低劑量舒芬太尼組；4：OVX+中劑量舒芬太尼組；5：OVX+高劑量舒芬太尼組；*：與假手術(shù)組比較，P<0.05；#：與OVX組比較，P<0.05

2.4 舒芬太尼對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨標(biāo)記基因mRNA和蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，OVX組大鼠骨勻漿液中Osx、Colla1、Dlx2 mRNA及蛋白表達(dá)水平均降低(P<0.05)；與OVX組比較，OVX+中、高劑量舒芬太尼組Osx、Colla1、Dlx2 mRNA及蛋白表達(dá)水平均升高(P<0.05)，見圖4。

a：mRNA水平；b：蛋白表達(dá)水平 1：假手術(shù)組；2：OVX組；3：OVX+低劑量舒芬太尼組；4：OVX+中劑量舒芬太尼組；5：OVX+高劑量舒芬太尼組；*：與假手術(shù)組比較，P<0.05；#：與OVX組比較，P<0.05

2.5 舒芬太尼對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠破骨細(xì)胞分化的影響

TRAP染色顯示，與假手術(shù)組比較，OVX組大鼠TRAP染色陽性的破骨細(xì)胞數(shù)量明顯增加；與OVX組比較，OVX+中、高劑量舒芬太尼組TRAP染色陽性的破骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少，見圖5。

箭頭：TRAP染色陽性細(xì)胞

2.6 舒芬太尼對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨吸收功能相關(guān)mRNA和蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，OVX組大鼠骨勻漿液中OSCAR、TRAP mRNA及蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；與OVX組比較，OVX+中、高劑量舒芬太尼組OSCAR、TRAP mRNA及蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，見圖6。

a：mRNA水平；b：蛋白表達(dá)水平 1：假手術(shù)組；2：OVX組；3：OVX+低劑量舒芬太尼組；4：OVX+中劑量舒芬太尼組；5：OVX+高劑量舒芬太尼組；*：與假手術(shù)組比較，P<0.05；#：與OVX組比較，P<0.05

3 討論

骨是一種特殊形式的結(jié)締組織，是成骨細(xì)胞合成骨和破骨細(xì)胞吸收骨形成動(dòng)態(tài)平衡的骨代謝過程，當(dāng)這種平衡偏向破骨細(xì)胞激活時(shí)可導(dǎo)致多種臨床疾病的發(fā)生，如骨質(zhì)減少和骨質(zhì)疏松癥[8]。其中，絕經(jīng)婦女體內(nèi)雌激素缺乏導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥是原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥最常見的類型，雌激素降低引起的骨量減少及骨組織結(jié)構(gòu)變化會(huì)增加骨脆性，導(dǎo)致患者容易骨折，而骨折會(huì)引起疼痛、骨骼變形、相關(guān)合并癥，甚至死亡，嚴(yán)重影響絕經(jīng)女性群體的健康及生活質(zhì)量[9]。本研究采用雙側(cè)OVX建立骨質(zhì)疏松大鼠模型，給予不同劑量舒芬太尼處理8周后，觀察其對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨小梁微結(jié)構(gòu)、骨形成及骨吸收相關(guān)標(biāo)記物的影響。

研究表明，骨質(zhì)疏松骨組織的改變包括骨小梁微結(jié)構(gòu)的退變，這種內(nèi)在結(jié)構(gòu)的變化不僅影響骨強(qiáng)度，還會(huì)改變骨生物力學(xué)性能[10]。本研究采用uCT對(duì)各組大鼠股骨進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示，切除卵巢會(huì)導(dǎo)致骨小梁結(jié)構(gòu)發(fā)生損傷，與假手術(shù)組比較，OVX組BV/TV、Tb.Th、骨小梁數(shù)量、軟骨數(shù)量均下降/減少，而Tb.Sp升高；給予舒芬太尼處理后，OVX+中、高劑量舒芬太尼組股骨骨小梁結(jié)構(gòu)得到明顯改善；同時(shí)，HE染色結(jié)果也顯示，舒芬太尼處理可明顯修復(fù)卵巢切除后引起的骨小梁損傷。

據(jù)報(bào)道，促進(jìn)骨形成或抑制骨吸收在骨質(zhì)疏松的治療中具有重要意義，可指導(dǎo)藥物作用靶點(diǎn)的新藥研究[11]。成骨細(xì)胞是骨形成細(xì)胞，可以合成骨基質(zhì)，調(diào)節(jié)礦化，最終分化為骨細(xì)胞或骨內(nèi)襯細(xì)胞[12]。成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化包括3個(gè)階段，涉及多種特有基因的表達(dá)：①細(xì)胞持續(xù)增殖，主要表達(dá)Colla1、纖維連接蛋白和骨鈣蛋白；②細(xì)胞外基質(zhì)成熟，主要表達(dá)堿性磷酸酶、Colla1等多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白；③骨鈣素、骨涎蛋白及骨鈣蛋白的表達(dá)，使基質(zhì)礦化并富集[13-14]。同時(shí)，Osx、Dlx2等成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄激活后，可增加骨小梁數(shù)量、礦化基質(zhì)及骨密度，并誘導(dǎo)Colla1、骨鈣蛋白等成骨細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)[15]。本研究結(jié)果顯示，Osx、Colla1、Dlx2等成骨標(biāo)志物在OVX組中表達(dá)降低，而在OVX+中、高劑量舒芬太尼組中表達(dá)升高，提示舒芬太尼可能通過促進(jìn)Osx、Colla1、Dlx2表達(dá)，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，從而促進(jìn)骨形成。

破骨細(xì)胞是專門用于骨吸收的大型多核細(xì)胞，主要由單核巨噬細(xì)胞分化而來，核遺傳程序的激活引起破骨細(xì)胞分化成熟因子OSCAR、TRAP表達(dá)上調(diào)，使TRAP陽性的單核細(xì)胞，即破骨細(xì)胞前體細(xì)胞，逐漸融合為成熟的破骨細(xì)胞[16]。本研究結(jié)果顯示，與OVX組比較，OVX+中、高劑量舒芬太尼組破骨細(xì)胞數(shù)量和骨勻漿液中OSCAR、TRAP表達(dá)均顯著減少/降低，表明舒芬太尼可能通過下調(diào)OSCAR、TRAP水平抑制破骨細(xì)胞分化成熟，從而在骨質(zhì)疏松中發(fā)揮抑制骨吸收的作用。

綜上所述，舒芬太尼可通過減輕骨質(zhì)疏松大鼠骨小梁的損傷進(jìn)行骨重塑，可能途徑有：改善骨小梁微結(jié)構(gòu)；上調(diào)Osx、Colla1、Dlx2表達(dá)，促進(jìn)骨形成；下調(diào)OSCAR、TRAP水平，抑制骨吸收。本研究通過雙側(cè)OVX建立絕經(jīng)骨質(zhì)疏松大鼠模型，揭示了舒芬太尼對(duì)大鼠骨小梁結(jié)構(gòu)及骨代謝的影響，但舒芬太尼在骨質(zhì)疏松中的骨代謝調(diào)控機(jī)制仍有待深入探究。