不同產(chǎn)地山茱萸中沒(méi)食子酸、莫諾苷及馬錢苷成分含量的測(cè)定及臨床意義

周瑞靜 田港 陳穎君 郭沅琪 周泓宇 俞薇 單琪媛 鄭平漢

山茱萸為山茱萸科植物山茱萸的干燥成熟果肉，具有補(bǔ)益肝腎、澀精固脫的作用［1］?，F(xiàn)代藥理研究顯示，山茱萸的主要成分有環(huán)烯醚萜類、黃酮、有機(jī)酸類等［2-3］，而環(huán)烯醚萜類的含量相對(duì)較高，其中含量較高的是莫諾苷和馬錢苷，能夠緩解骨性關(guān)節(jié)炎、調(diào)節(jié)免疫、緩解神經(jīng)痛等［4-8］。品種、種植環(huán)境及氣候條件等因素均可影響山茱萸藥材有效成分的物質(zhì)積累差異，進(jìn)而產(chǎn)生臨床療效和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的差別［9］。河南、陜西為山茱萸目前最大的產(chǎn)區(qū)，浙江臨岐有較豐富的野生山茱萸資源。野生因素、產(chǎn)地、品種對(duì)山茱萸成分含量的影響尚無(wú)報(bào)道。本文采用超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）指紋圖譜［10］比較不同產(chǎn)地與浙江野生山茱萸不同品種整體特征，并定量分析沒(méi)食子酸、莫諾苷、馬錢苷等三種指標(biāo)成分，以期為浙產(chǎn)道地藥材山茱萸的野生資源保護(hù)、山茱萸優(yōu)種優(yōu)育與藥材質(zhì)量提升提供參考，為臨床藥效保障提供基礎(chǔ)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備 ACQUITY UPLC H-Class Plus系列超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司），BSA124S電子天平（0.1 mg，sartorius，Germany），SQP電子天平（0.01 mg，sartorius，Germany），KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 材料及試劑 沒(méi)食子酸（成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-19032801），莫諾苷（樂(lè)美天醫(yī)藥，德思特生物，批號(hào)：DST200303-039），馬錢苷（成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-18080704），磷酸、甲醇、乙腈為色譜純，水（超純水，Unique-S*型多功能超純水系統(tǒng)，銳思捷水純化技術(shù)有限公司）。山茱萸的采購(gòu)、產(chǎn)地及批次信息，見(jiàn)表1，并經(jīng)由浙江中醫(yī)藥大學(xué)秦路平教授鑒定。

表1 山茱萸的產(chǎn)地及批次信息

1.3 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC? BEH C18（100 mm ×2.1 mm，1.7 μm）。流動(dòng)相：0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫程序見(jiàn)表2，流速為0.3 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為0.5 μL?；旌蠈?duì)照品溶液及山茱萸樣品溶液的色譜圖，見(jiàn)圖1。

圖1 混合對(duì)照品溶液（A）及山茱萸供試品溶液（B）的UPLC色譜圖

1.4 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取馬錢苷、莫諾苷、沒(méi)食子酸對(duì)照品適量，置10 mL容量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為80%甲醇溶解定容，分別制成濃度為30、200、120μg/mL的對(duì)照品溶液。

1.5 山茱萸供試品溶液的制備 精密稱取過(guò)3號(hào)篩的山茱萸粉末0.200 g，置25 mL錐形瓶中，加體積分?jǐn)?shù)80%甲醇溶液定容至刻度，稱重，超聲提?。üβ?00 W，頻率40 kHz）45 min，取出，再稱重，補(bǔ)足丟失的質(zhì)量，取上清液過(guò)0.22 μm微孔濾膜作供試液。

1.6 方法學(xué)考察 （1）線性關(guān)系考察：取對(duì)照品溶液，用體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇溶液逐級(jí)稀釋，制備7個(gè)濃度梯度的混合對(duì)照品溶液，按色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。（2）精密度試驗(yàn)：取山茱萸（S4）供試品，按色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次。（3）重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批山茱萸（S4）供試品6份，制備供試品溶液，按色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。（4）穩(wěn)定性試驗(yàn)：取山茱萸供試品溶液，按色譜條件分別在0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定。（5）加樣回收率試驗(yàn)：取同一批山茱萸供試品（S7）6份，分別精密加入等量的各對(duì)照品，制備供試品溶液，按色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。

1.7 樣品含量測(cè)定 取12批山茱萸樣品制備山茱萸供試品溶液，按色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。

1.8 指紋圖譜的建立 將12個(gè)不同產(chǎn)地、批次的山茱萸UPLC圖譜以CDF格式導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012.130723版本），將S1號(hào)批次（浙江省杭州市淳安縣臨岐鎮(zhèn)審豐村2019年采收）譜圖作為對(duì)照譜圖，采用中位數(shù)法，產(chǎn)生參照?qǐng)D譜，以多點(diǎn)校正法對(duì)各個(gè)色譜峰的保留時(shí)間進(jìn)行校正，校正的mark峰選擇沒(méi)食子酸、莫諾苷、馬錢苷3個(gè)共有峰。

1.9 聚類分析 相似度計(jì)算結(jié)果應(yīng)用SPSS軟件，參數(shù)設(shè)置為歐式距離，采用ward聚類方法計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 山茱萸中三種成分線性關(guān)系考察結(jié)果 三種成分在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好，以對(duì)照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制線性方程，見(jiàn)表3。

表3 山茱萸中三種成分線性關(guān)系考察結(jié)果

2.2 方法學(xué)考察的精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 以對(duì)照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制線性方程，精密度試驗(yàn)計(jì)算得到馬錢苷、莫諾苷、沒(méi)食子酸峰面積RSD分別為0.90%、1.04%和1.22%，表明儀器精密度良好。重復(fù)性試驗(yàn)計(jì)算得到馬錢苷、莫諾苷和沒(méi)食子酸峰面積的RSD分別為1.68%、1.54%和2.28%，表明該方法重復(fù)性良好。穩(wěn)定性試驗(yàn)中，計(jì)算得到馬錢苷、莫諾苷和沒(méi)食子酸峰面積的RSD分別為1.15%、1.98%和2.92%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3 山茱萸中三種成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 分別根據(jù)線性方程計(jì)算莫諾苷、馬錢苷、沒(méi)食子酸在精確稱量的樣品中加入對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品后的平均加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 山茱萸中三種成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4 山茱萸三種成分含量測(cè)定結(jié)果 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算12批樣品中三種成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 山茱萸三種成分含量測(cè)定結(jié)果（±s）

表5 山茱萸三種成分含量測(cè)定結(jié)果（±s）

編號(hào) 沒(méi)食子酸（mg/g） 莫諾苷（mg/g） 馬錢苷（mg/g）S1 0.31±0.01 10.22±0.06 3.11±0.04 S2 0.50±0.00 7.18±0.05 2.61±0.01 S3 0.92±0.02 8.11±0.15 2.65±0.05 S4 1.70±0.03 7.81±0.08 3.46±0.03 S5 0.65±0.01 7.02±0.03 2.35±0.01 S6 0.12±0.01 11.92±0.11 2.27±0.01 S7 0.74±0.00 8.95±0.05 2.17±0.03 S8 0.48±0.01 20.00±0.24 4.90±0.04 S9 1.74±0.01 5.38±0.06 2.37±0.03 S10 1.07±0.00 5.73±0.00 2.48±0.01 S11 0.91±0.02 6.03±0.03 2.45±0.03 S12 1.47±0.01 6.72±0.08 3.09±0.01

2.5 指紋圖譜 見(jiàn)圖2。

圖2 不同產(chǎn)地山茱萸的指紋圖譜

2.6 不同產(chǎn)地山茱萸指紋圖譜相似度分析 結(jié)果顯示，在不同產(chǎn)地、批次的山茱萸指紋圖譜之間存在著較高的相似度，但具體相似程度在不同批次之間也存在一些差異，與對(duì)照批次相比，S3（淳安瑤山天坪）相似度較高，在0.990以上，S9（杭州臨安）相似度較低，為0.821，其余批次譜圖相似度在0.961～0.986之間。見(jiàn)表6。

表6 不同產(chǎn)地山茱萸指紋圖譜相似度計(jì)算結(jié)果

2.7 聚類分析結(jié)果 見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，產(chǎn)地、品種、采收時(shí)間對(duì)于山茱萸指紋圖譜的相似度都有影響。S6、S7、S8三者為一類，對(duì)照批次信息可知三個(gè)批次產(chǎn)地均為臨岐，且采收時(shí)間相近，其中S6、S8兩者更為接近，對(duì)照信息兩者都為臨岐蘭林坑采收，而S7為棉花灣采收，說(shuō)明同一個(gè)鎮(zhèn)的不同地理位置對(duì)于山茱萸的品質(zhì)也有影響，原因可能為種植的土壤條件、海拔高度等產(chǎn)生的差異。S2、S5、S3、S1聚為一類，四個(gè)批次產(chǎn)地均為淳安縣，說(shuō)明淳安縣產(chǎn)地的山茱萸的有效成分較為相似。S10、S11、S12、S4聚為一類，這四個(gè)批次的產(chǎn)地為河南省和陜西省，說(shuō)明兩個(gè)省份的山茱萸品質(zhì)較為相近。S9（杭州市臨安區(qū)）與其他類別相差較遠(yuǎn)，原因可能為臨安產(chǎn)山茱萸的品種不同或是土壤種植條件、氣候等因素與其他地區(qū)存在較大的差異。

圖3 不同產(chǎn)地山茱萸聚類分析圖

3 討論

山茱萸的臨床應(yīng)用廣泛，是治療糖尿病、冠心病以及高血壓的常用藥，中成藥六味地黃丸、金匱腎氣丸及杞菊地黃丸中都用其作配伍，具有收斂固澀、補(bǔ)肝益氣、熄風(fēng)止痙等功效?，F(xiàn)代研究表明，山茱萸主要有免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抗衰老、抗氧化、腎臟保護(hù)等作用，其發(fā)揮臨床藥理作用的主要是環(huán)烯醚萜及其苷、三萜及多糖類、有機(jī)酸等［2］。該研究測(cè)定山茱萸中沒(méi)食子酸、莫諾苷和馬錢苷三種指標(biāo)成分，也是其主要藥理活性成分，具有較高的臨床藥用價(jià)值。

指紋圖譜聚類分析能夠明確區(qū)分出浙產(chǎn)山茱萸與其他產(chǎn)區(qū)山茱萸藥材，還能區(qū)分出野生藥材和栽培品種。浙江省杭州市淳安縣山茱萸總體主要有效成分含量較河南、陜西產(chǎn)區(qū)高，其中S1、S2、S3、S5為淳安縣山茱萸栽培品種，S6、S7、S8為臨岐山茱萸野生品種。產(chǎn)地、品種等因素對(duì)山茱萸主要藥理指標(biāo)成分莫諾苷含量影響較大，對(duì)馬錢苷、沒(méi)食子酸含量影響波動(dòng)較小。不同產(chǎn)地與品種的山茱萸樣品中，沒(méi)食子酸、莫諾苷、馬錢苷的含量范圍分別在0.1220～1.7373 mg/g，5.3753～19.9978 mg/g，2.1691～4.9048 mg/g。臨岐鎮(zhèn)的山茱萸（石磙棗、正青頭棗）莫諾苷含量較其他產(chǎn)地高，其中以S8野生山茱萸品種石磙棗的莫諾苷含量最高，約為河南、陜西產(chǎn)區(qū)栽培品種的2倍，表明臨岐道地產(chǎn)區(qū)的野生山茱萸種質(zhì)資源具有一定質(zhì)量?jī)?yōu)勢(shì)。S9（杭州市臨安區(qū)）和S10（陜西省丹鳳縣）的莫諾苷含量在12批次中較低，可能是產(chǎn)地與品種的不同導(dǎo)致的差異，也可能是因?yàn)橘?gòu)買年份較久，有效成分在貯存的過(guò)程中發(fā)生不同程度的損耗。山茱萸樹(shù)種間，品種、產(chǎn)量、果型、果實(shí)成熟時(shí)間、有效成分含量差異明顯，可結(jié)合品種、種植因素等多方面考察、基因轉(zhuǎn)錄水平的有效成分積累調(diào)控，充分利用優(yōu)質(zhì)野生品種進(jìn)行優(yōu)選優(yōu)育。

綜上所述，采用UPLC指紋圖譜法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地山茱萸中沒(méi)食子酸、莫諾苷和馬錢苷三種成分，方法簡(jiǎn)單，操作性和重復(fù)性較好，可為山茱萸藥材種質(zhì)資源保護(hù)、優(yōu)種優(yōu)育提供科學(xué)依據(jù)，為臨床藥效保障提供基礎(chǔ)支持。同時(shí)，山茱萸所含的有效成分各有其不同的作用，需要進(jìn)一步分離其有效成分并開(kāi)展藥理研究，以便更廣泛的應(yīng)用于臨床。