武營雪，康帥，劉靜，戴忠，馬雙成

中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

魚腥草為三白草科植物蕺菜Houttuynia cordataThunb.的新鮮全草或干燥地上部分[1]，又名折耳根，主要分布于我國中部、東南及西南各省。其味辛、性寒，具有清熱解毒、消癰排膿、利尿通淋等功效。魚腥草中含有揮發(fā)油、黃酮和生物堿類等成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒等多種藥理活性[2-5]。其中生物堿類成分有70 多種，主要包括阿樸菲型生物堿、馬兜鈴內(nèi)酰胺生物堿、酰胺類生物堿、吡啶類生物堿和其他類生物堿[6]。2017 年，一項馬兜鈴酸及其衍生物與肝癌相關的研究引起了人們對馬兜鈴酸類成分的廣泛關注[7]。馬兜鈴酸類成分為結構相似的一類物質，包括各種馬兜鈴酸和馬兜鈴內(nèi)酰胺類成分。馬兜鈴酸在體內(nèi)代謝可產(chǎn)生馬兜鈴內(nèi)酰胺，自然界中也存在馬兜鈴內(nèi)酰胺類成分[8]。

目前研究發(fā)現(xiàn)，馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴酸Ⅱ具有明確的腎毒性和致癌性，但對于馬兜鈴內(nèi)酰胺類成分的安全性研究還不充分[9-11]。Chan 等[12]利用高靈敏度和高選擇性的液相色譜-質聯(lián)法（LC-MS/MS）未在魚腥草中檢出馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴酸Ⅱ（檢出限為2 ng·g-1）。陳宏降等[13]發(fā)現(xiàn)，魚腥草地上部分、魚腥草根莖、三白草地上部分和根莖95%乙醇提取物對斑馬魚成魚和胚胎具有一定的急性毒性和胚胎發(fā)育毒性，半數(shù)致死量（LD50）分別為2.85、10.40、2.54、1.19 mg·L-1，致畸的主要表現(xiàn)為心包水腫和卵黃囊水腫；同時研究發(fā)現(xiàn)馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ和三白草內(nèi)酰胺0.5 mg·L-1可導致斑馬魚胚胎腎包膜水腫。研究者從魚腥草中分離出馬兜鈴內(nèi)酰胺BⅡ、馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ、馬兜鈴內(nèi)酰胺FⅠ、馬兜鈴內(nèi)酰胺FⅡ和胡椒內(nèi)酰胺B、胡椒內(nèi)酰胺D 等馬兜鈴內(nèi)酰胺類成分，但是對于其含量和毒性的研究都比較缺乏[14-17]。

本研究采用超高效液相色譜-質譜法（UPLCMS/MS）對不同產(chǎn)地野生或種植的魚腥草中3 個馬兜鈴內(nèi)酰胺類成分進行含量測定研究，為魚腥草中馬兜鈴內(nèi)酰胺類成分后續(xù)安全性研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC MS-8050 型超高效液相色譜-質譜儀（日本島津公司）；KQ-300DA 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Mili-Q 型純水儀（美國密理博公司）；Sartorius MSA6.6S-CE 型電子分析天平（德國賽多利斯公司）；XS105 型電子分析天平（瑞士梅特勒公司）；11B S025 型粉碎機（德國IKA公司）。

1.2 試藥

對照品馬兜鈴內(nèi)酰胺A Ⅱ（批號：X27S11L-125977，純度：98%）、馬兜鈴內(nèi)酰胺FⅠ（批號：X09M11-L112632，純度：98%）、馬兜鈴內(nèi)酰胺BⅡ（批號：X09M11-112631，純度：97%）均購自上海源葉生物科技有限公司；甲醇（美國Fisher Chemical公司）；乙腈（德國Merck 公司）；甲酸（賽默飛世爾科技有限公司）。

魚腥草藥材購自河北安國中藥材市場、安徽亳州藥材市場和四川成都，共14 批，編號分別為S1～S14，見表1。經(jīng)中國食品藥品檢定研究院中藥所中藥標本館康帥副研究員鑒定為三白草科植物蕺菜Houttuynia cordataThunb.的干燥地上部分。

表1 魚腥草樣品信息

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備

取魚腥草樣品粉碎，取約0.20 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質量，超聲處理30 min（300 W，40 kHz），放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，放置30 min，取上清液，0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 對照品溶液的制備

取對照品馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ、馬兜鈴內(nèi)酰胺FⅠ和馬兜鈴內(nèi)酰胺BⅡ適量，精密稱定，加甲醇制成含馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ111.7 μg·mL-1、馬兜鈴內(nèi)酰胺FⅠ72.9 μg·mL-1和馬兜鈴內(nèi)酰胺BⅡ269.7 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱為Agilent SB-C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm），以乙腈-0.1%甲酸（31∶69）為流動相，流速為0.3 mL·min-1，柱溫為30 ℃，進樣體積為1 μL。

2.4 質譜條件

電噴霧離子源（ESI），采用多反應監(jiān)測（MRM）模式，霧化氣流速為3 L·min-1，干燥氣流速為9 L·min-1，加熱氣流速為10 L·min-1，加熱模塊溫度為400 ℃，脫溶劑管溫度為250 ℃，離子源溫度為300 ℃，正離子采集模式，待測化合物質譜檢測參數(shù)見表2，混合對照品及樣品離子流色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品溶液和魚腥草供試品溶液的離子流圖

表2 待測化合物質譜檢測參數(shù)

2.5 方法學考察

2.5.1線性關系考察 分別精密吸取混合對照品溶液適量，加甲醇溶液稀釋至不同質量濃度，搖勻，制得系列混合對照品溶液，依2.3和2.4項下的色譜及質譜條件進樣分析，以定量離子峰面積（Y）對分析物質量濃度（X）進行線性回歸，繪制標準曲線。結果表明，各成分在各自的線性范圍內(nèi)具有良好的線性關系。將混合對照品溶液進一步稀釋，以信噪比（S/N）=10 的進樣質量濃度為定量限（LOQ），以S/N=3 的進樣質量濃度為檢測限（LOD），結果見表3。

表3 魚腥草中3個馬兜鈴內(nèi)酰胺成分的回歸方程、線性范圍、LOD、LOQ

2.5.2精密度試驗 取編號為S14 的樣品，按2.1項下方法制備供試品溶液，按2.3和2.4項下色譜及質譜條件進行測定，連續(xù)進樣6 次，連續(xù)3 d 進樣，測得各成分的峰面積，計算日內(nèi)精密度和日間精密度的RSD。結果表明，馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ、馬兜鈴內(nèi)酰胺FⅠ和馬兜鈴內(nèi)酰胺BⅡ的日內(nèi)精密度RSD分別為2.66%、0.79%和0.73%，日間精密度RSD分別為3.35%、1.79%和0.85%。結果表明該儀器及方法的精密度良好。

2.5.3穩(wěn)定性試驗 取編號為S14 的樣品，按2.1項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h 按2.3 和2.4 項下色譜及質譜條件進行測定，測得各成分峰面積的RSD。結果表明，馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ、馬兜鈴內(nèi)酰胺FⅠ和馬兜鈴內(nèi)酰胺BⅡ峰面積的RSD 分別為2.56%、0.73%和0.83%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4重復性試驗 取編號為S14 的樣品，按2.1項下方法制備6 份供試品溶液，按2.3 和2.4 項下色譜及質譜進行條件測定，每份進樣3 針，測得各成分的平均含量和RSD。結果表明，馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ、馬兜鈴內(nèi)酰胺FⅠ和馬兜鈴內(nèi)酰胺BⅡ的平均質量分數(shù)分別為2.964、2.364、9.718 μg·g-1，RSD 分別為3.94%、5.36%、4.41%，該方法重復性良好。

2.5.5加樣回收率試驗 精密量取對照品適量，配制成一定質量濃度的混合對照品溶液，取已知含量的S14樣品9份，每份約0.1 g，分成3組，分別精密加入相當于樣品中各成分質量分數(shù)80%（低）、100%（中）、120%（高）的混合對照品溶液，按2.1項方法下制備供試品溶液，按2.3和2.4項下色譜及質譜進行條件測定，每份進樣3 針，測定各成分的峰面積，并計算3個馬兜鈴內(nèi)酰胺類成分的平均回收率，結果見表4，加樣回收率為83.77%～105.61%，RSD 為1.14%～11.46%，符合方法學要求。

表4 魚腥草中3個馬兜鈴內(nèi)酰胺類成分加樣回收率結果

2.6 樣品含量測定

取不同批號的樣品0.2 g，精密稱定，按2.1 項下方法制備供試品溶液，按2.3和2.4項下色譜及質譜條件進行測定，每份進樣3 針，測定各成分的峰面積，計算魚腥草中3 個馬兜鈴內(nèi)酰胺類成分的含量，結果見表5。

表5 魚腥草中3個馬兜鈴內(nèi)酰胺類成分質量分數(shù)（,n=3）μg·g-1

表5 魚腥草中3個馬兜鈴內(nèi)酰胺類成分質量分數(shù)（,n=3）μg·g-1

2.7 數(shù)據(jù)處理與分析

2.7.1箱線圖和差異性分析 采用SPSS 26.0 數(shù)據(jù)處理軟件對測定結果進行處理，對14 批魚腥草中3個馬兜鈴內(nèi)酰胺類成分含量進行分析，繪制箱線圖（圖2）。結果表明，樣品S13（湖北野生）中3 個成分的含量較高；其余樣品中馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ質量分數(shù)為0.757～14.692 μg·g-1；馬兜鈴內(nèi)酰胺FⅠ質量分數(shù)為1.418～10.305 μg·g-1，馬兜鈴內(nèi)酰胺BⅡ質量分數(shù)為2.893～28.339 μg·g-1。

圖2 魚腥草中3個馬兜鈴內(nèi)酰胺類成分質量分數(shù)的箱線圖

采用SPSS 26.0數(shù)據(jù)處理軟件，單因素方差分析的方法對魚腥草種植（10批）和野生（4批）樣品中3個馬兜鈴內(nèi)酰胺含量進行差異性分析，差異無統(tǒng)計學意義；對5個不同省份產(chǎn)魚腥草樣品中3個馬兜鈴內(nèi)酰胺含量進行差異性分析，差異無統(tǒng)計學意義。

2.7.2聚類分析 將14批不同來源魚腥草樣品3個馬兜鈴內(nèi)酰胺成分的含量數(shù)據(jù)導入SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件，選用組間聯(lián)接聚類方法，以歐氏平方距離法進行系統(tǒng)聚類分析，結果見圖3。當歐氏平方距離為25 時，所有樣品首先聚為兩大類，S13（湖北野生）聚為Ⅱ類，其余13 個樣品聚為Ⅰ類；當歐氏平方距離為4 時，Ⅰ類可分為2 個小類，S11（四川種植）樣品聚為Ⅰb 類，其余樣品為Ⅰa類；當歐氏平均距離為2 時，Ⅰa 類可分為2 類，S2（湖北恩施種植）、S4（湖北十堰種植）和S8（四川廣漢種植）為一類，其余樣品為另一類。

圖3 不同來源魚腥草中3個馬兜鈴內(nèi)酰胺含量聚類分析

2.7.3主成分分析（PCA）將14批樣品中3個成分含量的平均值為變量，導入SIMCA-P 14.1軟件進行PCA，前2個主成分累積方差貢獻率為98%，其中第一主成分（PC1）方差貢獻率為95.5%，第二主成分（PC2）方差貢獻率為2.47%，見圖4，圖中每個點代表1個樣品，與聚類分析的分類結果基本一致。

圖4 不同來源魚腥草中3個馬兜鈴內(nèi)酰胺含量PCA

2.7.4相關性分析 利用SPSS 26.0 對3 種成分含量的相關性分析，結果見表6，馬兜鈴內(nèi)酰胺BⅡ、馬兜鈴內(nèi)酰胺FⅠ和馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ的含量之間存在顯著相關關系。

表6 魚腥草中3種馬兜鈴內(nèi)酰胺成分相關性分析

3 討論

3.1 色譜、質譜條件的選擇

分別考察了乙腈-0.1%甲酸水溶液和乙腈-0.1%甲酸水溶液（含5 mmol·mL-1乙酸銨）流動相系統(tǒng)，結果發(fā)現(xiàn)不加乙酸銨的溶劑系統(tǒng)靈敏度高，色譜峰型好。本實驗用UPLC-MS/MS 對馬兜鈴內(nèi)酰胺類成分定量，均采用MRM 模式。將3個馬兜鈴內(nèi)酰胺分別在正、負離子模式下檢測，待測物在正離子模式下更穩(wěn)定、靈敏度更高；在正離子模式下檢測，同時獲取母離子和子離子信息，并且優(yōu)選出最佳碰撞電壓。與紫外檢測器相比，MRM模式靈敏度高，適合于微量物質的分析。

3.2 馬兜鈴內(nèi)酰胺質譜裂解分析

根據(jù)質譜裂解規(guī)律，馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ的最佳離子對為m/z266→251，為[M-CH3+H]+峰，定性離子m/z195為[M-CH3+H-2CO]+峰；馬兜鈴內(nèi)酰胺FⅠ與馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ是同分異構體，定量離子與定性離子相同；馬兜鈴內(nèi)酰胺BⅡ的最佳離子對為m/z280→264，為[M-CH4+H]+峰，定性離子m/z236 為[M-CH4-CO+H]+峰；以上的質譜裂解特征是UPLC-MS/MS 定量分析識別檢測成分的信號特征，構成采用UPLC-MS/MS 檢測馬兜鈴內(nèi)酰胺類成分的理論基礎[18]。

3.3 魚腥草中馬兜鈴內(nèi)酰胺生物堿含量相關性分析

經(jīng)差異性分析魚腥草中馬兜鈴內(nèi)酰胺生物堿含量發(fā)現(xiàn)，含量與魚腥草的產(chǎn)地、野生或種植無關，可能與采集時間、儲藏條件和植株高度等其他影響因素有關；聚類分析和PCA 結果一致，收集的14個樣本中湖北野生（S13）各成分含量最高；相關性分析表明，3個成分的含量之間呈顯著正相關，能夠為其后續(xù)質量控制指標的選擇及兼顧經(jīng)濟適用性方面提供參考。

本研究建立UPLC-MS/MS 測定魚腥草中3 個馬兜鈴內(nèi)酰胺含量的方法，發(fā)現(xiàn)14 批魚腥草樣品中馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ、馬兜鈴內(nèi)酰胺FⅠ和馬兜鈴內(nèi)酰胺BⅡ質量分數(shù)分別為0.757～19.538、1.418～15.971、2.893～70.131 μg·g-1，為后續(xù)魚腥草中馬兜鈴內(nèi)酰胺類成分的安全性研究提供參考。該方法簡便、快速、靈敏、專屬性強，可為其他藥用植物中馬兜鈴內(nèi)酰胺類成分的測定提供參考。