袁宗勝

摘要 研究了毛竹內(nèi)生拮抗細(xì)菌JL-B05和JL-B16對(duì)3種食用菌病原菌的生防機(jī)理。結(jié)果表明，不同濃度內(nèi)生拮抗細(xì)菌過(guò)濾液和滅菌液對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)均具有顯著的抑制效果，其中濃度為20%的內(nèi)生拮抗細(xì)菌JL-B05過(guò)濾液對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果最好，對(duì)疣孢病菌的抑制率達(dá)86.37%，對(duì)油疤病菌的抑制率為78.81%，對(duì)蛛網(wǎng)病菌的抑制率為76.76%，抑制效果均優(yōu)于內(nèi)生拮抗細(xì)菌JL-B16過(guò)濾液。濃度為20%的內(nèi)生拮抗細(xì)菌JL-B16滅菌液對(duì)油疤病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率為72.11%，對(duì)疣孢病菌抑制率為62.51%，對(duì)蛛網(wǎng)病菌的抑制率為61.88%，抑制效果均優(yōu)于內(nèi)生拮抗細(xì)菌JL-B05滅菌液。在內(nèi)生拮抗細(xì)菌發(fā)酵液和滅菌液對(duì)病原菌孢子萌發(fā)抑制效果測(cè)定中，濃度為40%內(nèi)生拮抗細(xì)菌JL-B05、JL-B16過(guò)濾液和滅菌液對(duì)3個(gè)病原菌的抑制效果均較為顯著。內(nèi)生細(xì)菌JL-B05、JL-B16揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)均表現(xiàn)出一定的抑制作用。

關(guān)鍵詞 毛竹;內(nèi)生拮抗細(xì)菌;食用菌病害;生防機(jī)理

中圖分類(lèi)號(hào) S 476? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2022）08-0126-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.08.034

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

The Biological Control Mechanism of Endophytic Antagonistic Bacteria in Phyllostachys edulis on Edible Fungi Diseases

YUAN Zong-sheng

（Institute of Oceanography， Minjiang University， Fuzhou， Fujian? 350108）

Abstract The biological control mechanism of endophytic antagonistic bacteria JL-B05 and JL-B16 against three edible fungus pathogens was studied. The results showed that different concentrations of endophytic antagonistic bacterial filtration solution and sterilized solution had significant inhibitory effect on the growth of pathogenic mycelia， among which the 20% endophytic antagonistic bacteria JL-B05 filtration solution had the best inhibitory effect on the growth of pathogenic mycelia， the inhibition rate of Mycogone perniciosa was 86.37%， the inhibition rate of Scytalidium lignicola was 78.81%， the inhibition rate of Cladobotryum semicirculare was 76.76%， and the overall inhibition effect was better than that of endophyte JL-B16 filtration solution. The inhibition rate of endophytic antagonistic bacteria JL-B16 sterilized solution with concentration of 20% on mycelial growth of Scytalidium lignicola was 72.11%，62.51% on Mycogone perniciosa and 61.88% on Cladobotryum semicirculare， and the overall effect was better than that of endophytic antagonistic bacteria JL-B05 sterilized solution. In the determination of the inhibitory effect of endophytic antagonistic bacterial filtration solution and sterilized solution on the spore germination of pathogenic bacteria， the concentration of 40% endophytic antagonistic bacteria JL-B05， JL-B16 filter solution and sterilized solution on the three pathogens was more significant. Endophytic bacteria JL-B05， JL-B16 volatile substances also showed a certain inhibition on the growth of pathogenic mycelia.

Key words Phyllostachys edulis;Endophytic antagonistic bacteria;Edible fungi disease;Biological control mechanism

植物內(nèi)生細(xì)菌指其生活史的一定階段或全部階段均生活在健康植物的各種組織和器官內(nèi)部，并與植物建立了和諧聯(lián)合關(guān)系的細(xì)菌 [1]。植物內(nèi)生菌能夠引起廣泛關(guān)注主要是由于它能夠產(chǎn)生多種多樣的具有農(nóng)藥活性的次生代謝產(chǎn)物 [2]，在自然界中具有重要的生態(tài)學(xué)作用。內(nèi)生細(xì)菌通過(guò)自身產(chǎn)生代謝產(chǎn)物或借助信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)宿主植物生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生重要影響，主要在促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)、增強(qiáng)宿主植物抗性及提高植物修復(fù)能力等方面 [3-7]，如Microbacterium具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用 [8]，Bacillus具有良好的生防潛力 [9]，Sphingomonas具有植物自我修復(fù)功能 [10]等。內(nèi)生菌對(duì)植物病害的防病機(jī)理主要是通過(guò)幾個(gè)方面：一產(chǎn)生抗生素類(lèi)物質(zhì)，在低濃度下可以對(duì)微生物產(chǎn)生影響 [11];二產(chǎn)生水解酶，可降解某些致病因子 [12];三產(chǎn)生生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑 [13]，內(nèi)生菌也可以產(chǎn)生植物生物激素類(lèi)物質(zhì)促進(jìn)植物生長(zhǎng);四內(nèi)生菌與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使病原菌得不到必要的營(yíng)養(yǎng)供給而死亡以及增強(qiáng)宿主植物的抵抗力以及誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性等途徑抑制病原菌的生長(zhǎng) [14]。

我國(guó)食用菌產(chǎn)業(yè)在近30年發(fā)展迅速，但在食用菌生產(chǎn)栽培過(guò)程中，常受到害蟲(chóng)和病菌的危害，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，由于病蟲(chóng)的危害導(dǎo)致減產(chǎn)10%～30%，嚴(yán)重的情況下甚至?xí)w粒無(wú)收 [15]。防治病蟲(chóng)害最常見(jiàn)的方法是化學(xué)藥劑，但長(zhǎng)時(shí)間使用單一的化學(xué)藥劑會(huì)使得病蟲(chóng)害的抗性增強(qiáng)，防治效果下降，而且藥品的殘留量會(huì)對(duì)身體健康造成威脅，也會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境污染，生物防治則具有許多優(yōu)點(diǎn)，因此近幾年受到了世界各地的普遍重視 [16]。國(guó)內(nèi)外研究者在內(nèi)生菌對(duì)于防治植物病害方面進(jìn)行了大量研究，也取得了非常顯著的效果。但內(nèi)生菌在食用菌病害防治方面研究較少，因此，筆者選取對(duì)主要食用菌病原菌（疣孢病菌、蛛網(wǎng)病菌、油疤病菌）具有較好拮抗效果的內(nèi)生細(xì)菌菌株JL-B05、JL-B16，研究其對(duì)食用菌病害的生防機(jī)理，將對(duì)食用菌病害的生物防治及促進(jìn)食用菌產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

1.1.1 內(nèi)生拮抗細(xì)菌。內(nèi)生細(xì)菌菌株JL-B05、JL-B16，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室從毛竹竹鞭中分離并篩選出對(duì)食用菌主要病原菌具有較好拮抗效果的內(nèi)生細(xì)菌。

1.1.2 食用菌病原菌。疣孢病菌，疣孢霉（Mycogone perniciosa）;蛛網(wǎng)病菌，葡枝霉（Cladobotryum semicirculare）;油疤病菌，木棲柱孢霉（Scytalidium lignicola）。

1.2 培養(yǎng)基及主要試劑

內(nèi)生細(xì)菌培養(yǎng)采用NA培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，NaCl 5 g，瓊脂18 g，水1 000 mL，pH 7.0～7.2（液體培養(yǎng)基則不加瓊脂）。

LB液體培養(yǎng)基，主要成分是酵母粉、氯化鈉、胰蛋白胨;PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、瓊脂粉20 g、葡萄糖20 g。

所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 內(nèi)生拮抗細(xì)菌發(fā)酵過(guò)濾液和發(fā)酵滅菌液的制備

1.3.1 內(nèi)生拮抗細(xì)菌發(fā)酵過(guò)濾液的制備。

取供試內(nèi)生拮抗細(xì)菌JL-B05、JL-B16，分別用無(wú)菌接種環(huán)挑取單菌落，接種于裝液量為 100 mL 的LB液體培養(yǎng)基三角瓶中，在28 ℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)3 d，通過(guò)離心（4 ℃，10 000 r/ min，15 min）取得上清液，在無(wú)菌條件下，經(jīng) 0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾后所得濾液，即為內(nèi)生拮抗細(xì)菌發(fā)酵過(guò)濾液。

1.3.2 內(nèi)生拮抗細(xì)菌發(fā)酵滅菌液的制備。

取供試內(nèi)生拮抗細(xì)菌JL-B05、JL-B16，分別用無(wú)菌接種環(huán)挑取單菌落，接種于裝液量為 100 mL 的LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在28 ℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)3 d，放入高壓滅菌鍋，121 ℃條件下滅菌30 min，即為內(nèi)生拮抗細(xì)菌發(fā)酵滅菌液。

1.4 內(nèi)生拮抗細(xì)菌的生防機(jī)理

1.4.1 內(nèi)生拮抗細(xì)菌發(fā)酵過(guò)濾液對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響。

采用菌落生長(zhǎng)法測(cè)定內(nèi)生拮抗細(xì)菌過(guò)濾液的抑菌活性，將上述內(nèi)生拮抗細(xì)菌過(guò)濾液與PDA培養(yǎng)基混合制成混合平板（濃度分別為5%、10%、15%、20%），以不加過(guò)濾液的PDA平板為對(duì)照。分別在平板中央接入病原菌菌原片，每個(gè)處理3次重復(fù)，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)，然后觀察病原菌的菌絲生長(zhǎng)狀況，待對(duì)照CK滿板時(shí)采用十字交叉法測(cè)量菌絲直徑。

采用下列公式計(jì)算抑制率：

相對(duì)抑制率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100%

1.4.2 內(nèi)生拮抗細(xì)菌發(fā)酵滅菌液對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響。

采用菌落生長(zhǎng)法測(cè)定內(nèi)生拮抗細(xì)菌滅菌液的抑菌活性，將上述內(nèi)生拮抗細(xì)菌滅菌液與PDA培養(yǎng)基混合制成混合平板（濃度分別為5%、10%、15%、20%），以不加滅菌液的PDA平板為對(duì)照。分別在平板中央接入病原菌菌原片，每個(gè)處理3次重復(fù)，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)，然后觀察病原菌的菌絲生長(zhǎng)狀況，待對(duì)照CK滿板時(shí)采用十字交叉法測(cè)量菌絲直徑。

采用下列公式計(jì)算抑制率：

相對(duì)抑制率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100%

1.4.3 內(nèi)生拮抗細(xì)菌發(fā)酵過(guò)濾液對(duì)病原菌孢子萌發(fā)的影響。

取上述內(nèi)生拮抗細(xì)菌JL-B05、JL-B16過(guò)濾液，將過(guò)濾液按照20%、40%這2個(gè)比例與PDA培養(yǎng)基混合，分別制成混合培養(yǎng)基平板。在生長(zhǎng)成熟的3個(gè)病原菌的培養(yǎng)皿中加入無(wú)菌水，收集病原菌孢子，制成孢子懸浮液。然后用移液槍將孢子懸浮液加入上述混合培養(yǎng)基平板上，用涂布棒均勻涂抹。每個(gè)處理3次重復(fù)，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)，然后觀察病原菌的孢子萌發(fā)狀況。

采用下列公式計(jì)算抑制率：

相對(duì)抑制率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100%

1.4.4 內(nèi)生拮抗細(xì)菌發(fā)酵滅菌液對(duì)病原菌孢子萌發(fā)的影響。

取上述內(nèi)生拮抗細(xì)菌JL-B05、JL-B16滅菌液，將滅菌液按照20%、40%這2個(gè)比例與PDA培養(yǎng)基混合，分別制成混合培養(yǎng)基平板。在生長(zhǎng)成熟的3個(gè)病原菌的培養(yǎng)皿中加入無(wú)菌水，收集病原菌孢子，制成孢子懸浮液。然后用移液槍將孢子懸浮液加入上述混合培養(yǎng)基平板上，用涂布棒均勻涂抹。每個(gè)處理3次重復(fù)，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)，然后觀察病原菌的孢子萌發(fā)狀況。

采用下列公式計(jì)算抑制率：

相對(duì)抑制率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100%

1.4.5 內(nèi)生拮抗細(xì)菌揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響。

將3個(gè)病原菌菌株（疣孢病菌、蛛網(wǎng)病菌、油疤病菌）和內(nèi)生拮抗細(xì)菌菌株JL-B05、JL-B16分別轉(zhuǎn)接到不同的PDA平板上，并分別在適宜的溫度條件下培養(yǎng)2 d后在無(wú)菌條件下，去掉平板蓋，將接有病原菌的培養(yǎng)皿相對(duì)扣合，并用封口膜沿邊緣封口，防止揮發(fā)性物質(zhì)漏出。以不接內(nèi)生拮抗細(xì)菌的作為對(duì)照，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。觀察病原菌的菌絲生長(zhǎng)情況并計(jì)算抑菌率。

采用下列公式計(jì)算抑制率：

相對(duì)抑制率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100%

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)繪圖用Excel，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用 DPS（V7.05）的相應(yīng)分析功能進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生拮抗細(xì)菌發(fā)酵過(guò)濾液對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果

通過(guò)對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察，統(tǒng)計(jì)不同種不同比例內(nèi)生菌過(guò)濾液對(duì)病原菌的抑制率，結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可以看出，內(nèi)生拮抗細(xì)菌JL-B05對(duì)疣孢病菌的抑制效果最好，且效果最佳菌液濃度為20%。菌液濃度為20%內(nèi)生拮抗細(xì)菌JL-B16對(duì)油疤病菌原菌的抑制效果最好。

2.2 內(nèi)生拮抗細(xì)菌發(fā)酵滅菌液對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果

通過(guò)對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察，統(tǒng)計(jì)不同種不同比例內(nèi)生菌滅菌液對(duì)病原菌的抑制率，結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可以看出，濃度為20%的內(nèi)生拮抗細(xì)菌JL-B05滅菌液對(duì)病原菌的抑制效果最佳，其中濃度為20%內(nèi)生拮抗細(xì)菌JL-B05和JL-B16滅菌液均對(duì)油疤病菌表現(xiàn)出較好的抑制效果，其次是疣孢病菌、蛛網(wǎng)病菌。

2.3 內(nèi)生拮抗細(xì)菌發(fā)酵過(guò)濾液對(duì)病原菌孢子萌發(fā)的抑制效果

通過(guò)對(duì)病原菌孢子萌發(fā)生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察，統(tǒng)計(jì)不同種內(nèi)生菌過(guò)濾液對(duì)病原菌的抑制率，結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可以看出，內(nèi)生拮抗細(xì)菌JL-B05過(guò)濾液對(duì)病原菌的抑制效果較好，濃度為40%的內(nèi)生拮抗細(xì)菌JL-B05和JL-B16對(duì)于3個(gè)病原菌都很理想，都能較好地抑制孢子的萌發(fā)。

2.4 內(nèi)生拮抗細(xì)菌發(fā)酵滅菌液對(duì)病原菌孢子萌發(fā)的抑制效果

通過(guò)對(duì)病原菌孢子萌發(fā)生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察，統(tǒng)計(jì)不同種內(nèi)生菌滅菌液對(duì)病原菌孢子萌發(fā)的抑制效果，結(jié)果見(jiàn)表4。從表4可以看出，濃度為40%內(nèi)生拮抗細(xì)菌JL-B05和JL-B16發(fā)酵滅菌液對(duì)病原菌的抑制效果較好。濃度為40%的內(nèi)生拮抗細(xì)菌JL-B16發(fā)酵滅菌液對(duì)病原菌的抑制效果較好，對(duì)疣孢病菌和油疤病菌的抑制效果最佳。

2.5 內(nèi)生拮抗細(xì)菌揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果

通過(guò)觀察病原菌與內(nèi)生拮抗細(xì)菌對(duì)密封培養(yǎng)皿中病原菌的菌絲生長(zhǎng)狀況，結(jié)果表明，內(nèi)生拮抗細(xì)菌揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)具有一定的抑制作用。從表5可以看出，內(nèi)生拮抗細(xì)菌JL-B05和JL-B16的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)于油疤病菌、蛛網(wǎng)病菌的抑制效果較好，對(duì)于疣孢病菌的抑制效果相對(duì)較弱。

3 結(jié)論與討論

從內(nèi)生拮抗細(xì)菌對(duì)3種食用菌病原菌的生防效果可以看出，不同濃度內(nèi)生拮抗細(xì)菌過(guò)濾液和滅菌液對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)均具有一定的抑制效果。其中濃度為20%的內(nèi)生拮抗細(xì)菌JL-B05過(guò)濾液對(duì)病原菌的抑制效果最好，對(duì)疣孢病菌的抑制率達(dá)86.37%，對(duì)油疤病菌的抑制率為78.31%，對(duì)蛛網(wǎng)病菌的抑制率為76.76%。濃度為20%的內(nèi)生拮抗細(xì)菌JL-B16滅菌液對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果最好，對(duì)油疤病菌的抑制率達(dá)72.11%，對(duì)疣孢病菌的抑制效果為62.51%，對(duì)蛛網(wǎng)病菌的抑制率為61.88%。

不同濃度內(nèi)生拮抗細(xì)菌過(guò)濾液和滅菌液對(duì)病原菌孢子萌發(fā)的測(cè)定中，濃度為40%內(nèi)生拮抗細(xì)菌JL-B05、JL-B16對(duì)3個(gè)病原菌的抑制效果都非常明顯。內(nèi)生拮抗細(xì)菌揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)也表現(xiàn)出一定的抑制作用，對(duì)于疣孢病菌的整體抑制效果低于50%，JL-B16對(duì)于蛛網(wǎng)病菌和油疤病菌的抑制效果相對(duì)較好。從上述分析可以看出內(nèi)生拮抗細(xì)菌JL-B05、JL-B16對(duì)3個(gè)病原菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)均表現(xiàn)出一定的抑制效果。

內(nèi)生菌對(duì)植物病害的生物防治已研究多年并取得了很好的應(yīng)用效果，何紅等 [17]也證明分離自辣椒的內(nèi)生芽孢桿菌對(duì)辣椒炭疽病菌有拮抗活性。用植物內(nèi)生的枯草芽孢桿菌處理辣椒苗，然后再接種病原菌，能夠?qū)l(fā)病率降低81.49%～93.34%。內(nèi)生菌的拮抗效果除實(shí)驗(yàn)室的抑菌效果測(cè)定外，還需要進(jìn)行大田生產(chǎn)過(guò)程中的實(shí)際應(yīng)用，以進(jìn)一步驗(yàn)證內(nèi)生菌的拮抗效果。研究表明植物內(nèi)生細(xì)菌是一個(gè)很好的外源基因載體，利用分子生物技術(shù)構(gòu)建工程內(nèi)生細(xì)菌的研究工作在國(guó)內(nèi)外已相繼開(kāi)展，快速發(fā)展，并取得許多成功的報(bào)道，如抗蟲(chóng)工程菌、防病工程菌、固氮工程菌等，這將是今后內(nèi)生細(xì)菌的研究熱點(diǎn)。

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