李偉泰，黃登婧，李昌霞，王春蕾，閆梅，廖偉彪

(甘肅農(nóng)業(yè)大學園藝學院，甘肅 蘭州 730070)

蘭州百合(Liliumdavidiivar.unicolor)是百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)多年生草本植物，是川百合的一個變種[1]，是藥食兩用的甜百合[2]。碳水化合物代謝對百合鱗莖的生長發(fā)育至關重要，淀粉是百合鱗莖中碳水化合物的重要貯藏形式，百合的整個生長過程其實就是淀粉積累的過程[3]。蔗糖是植物生長發(fā)育所必需的可溶性碳水化合物，百合鱗莖的蔗糖含量占總糖含量的絕大部分，蔗糖的變化決定著總糖的變化[4]。因此，研究淀粉和蔗糖的代謝機制對了解百合鱗莖的生長發(fā)育具有重要的意義。

海藻糖是由兩個分子葡萄糖組成的一種非還原性雙糖，廣泛存在于真菌、細菌、動物、植物等生物體內(nèi)，具有重要的生物學功能[5]。海藻糖可能是調(diào)節(jié)植物基因表達和生長發(fā)育的重要信號因子[6]。研究表明，施加一定濃度的外源海藻糖可以提高植物的抗逆性。如外源海藻糖可以減輕高溫脅迫對小麥幼苗的損傷[7]，也可緩解鎘對水稻幼苗的脅迫[8]，此外海藻糖還可以維護滲透脅迫下西瓜細胞的正常生長，保護其亞細胞結構[9]。目前，海藻糖和海藻糖代謝已被證實在滲透保護、耐脫水、儲存能量碳源、耐熱性、生長發(fā)育調(diào)節(jié)和糖信號傳遞等過程中發(fā)揮作用[10]。在番茄中引入酵母海藻糖6-磷酸合酶(TPS1)可以提高番茄的葉綠素和淀粉含量，增強番茄對干旱、鹽和氧化脅迫的耐受性[11]。但是海藻糖對百合鱗片扦插繁殖過程中碳水化合物含量的影響未見報道。因此，本文研究了外源海藻糖對百合鱗片扦插繁殖過程中母鱗片糖代謝的影響，以期為深入研究百合鱗片扦插繁殖中糖代謝機制、百合種球繁育體系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

百合種球購買于甘肅省蘭州市西果園。

1.2 試驗方法

將新鮮種球用蒸餾水清洗干凈，在500倍多菌靈溶液浸泡30 min。將種球用蒸餾水沖洗2次，從基部剝?nèi)≈袑咏训镊[片，晾干表面水分備用。用濃度梯度為0(對照)、10、50、100、200和500 mmol/L的海藻糖溶液分別浸泡百合鱗片基部2 h。之后將百合鱗片扦插到基質(蛭石：珍珠巖體積比為3∶1)，在光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)75 d(晝溫：(23±2)℃；夜溫：(19±2)℃)。各處理每隔8 d澆灌1次同等濃度海藻糖，在培養(yǎng)的第25、50、75天分別對母鱗片進行取樣，每次15片，重復3次。取樣后置于液氮中速凍，保存于-80 ℃超低溫冰箱中待用。

采用蒽酮比色法測定淀粉和可溶性糖的含量[12]。蔗糖的含量測定用間苯二酚比色法[13]。

海藻糖含量及蔗糖合成酶(SuSy)、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGP)和6-磷酸海藻糖合酶(TPS)活性使用ELISA試劑盒(遠慕生物，中國上海)根據(jù)說明書進行測定。檢測液的提取步驟具體為：取0.5 g樣本用pH 7.4 的PBS緩沖液漂洗，之后加入0.05 mol/L Tris-HCl，充分研磨。將制備好的勻漿液在常溫下4 000g離心15 min，取上清液進行測定。

總RNA的提取使用Trizol法[14-15]并加以改動。用液氮將樣本研磨至粉末，加入1 mL TRIzol試劑，靜置10 min。隨后加入200 μL氯仿，離心取上清液，加入異丙醇于-20 ℃ 沉淀至少1 h。用75%的乙醇洗滌2次后45 μL無酶去離子水收集RNA。使用Evo M-ML V反轉錄試劑預混液(艾克瑞生物，中國湖南)合成cDNA。用SYBR Green Premix Pro Tap HS預混型qPCR試劑盒(艾克瑞生物，中國湖南)進行RT-qPCR。試驗中所用到的相關引物列于表1。

表1 實時熒光定量引物序列

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 不同濃度海藻糖對百合扦插過程中子鱗莖數(shù)量的影響

如圖1所示，不同濃度的外源海藻糖對百合鱗片扦插繁殖過程中子鱗莖的發(fā)生數(shù)量有顯著的影響。與對照相比，10和50 mmol/L海藻糖處理下母鱗片上子鱗莖的發(fā)生數(shù)量明顯增加，其中50 mmol/L海藻糖促生的子鱗莖數(shù)量最多，10 mmol/L次之(圖1)。當海藻糖溶液的濃度達到100 mmol/L之后，子鱗莖的發(fā)生數(shù)量隨著海藻糖濃度的增加呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢，說明高濃度的海藻糖可能會抑制子鱗莖的萌發(fā)。因此，本研究選用50 mmol/L的海藻糖處理進行后續(xù)的試驗。

2.2 外源海藻糖對百合扦插過程中母鱗片的淀粉、蔗糖、內(nèi)源海藻糖和可溶性糖含量的影響

在外源海藻糖處理的鱗片扦插繁殖過程中，母鱗片的淀粉含量呈現(xiàn)整體下降的趨勢(圖2-A)。與對照相比，外源海藻糖處理的母鱗片淀粉含量均顯著高于對照，在75 d達到極顯著，比對照高29.92 mg/g。外源海藻糖也顯著的提高了母鱗片的蔗糖含量，其中在50和 75 d極顯著地高于對照(圖2-B)。母鱗片中內(nèi)源海藻糖的含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在25 d達到最高為4.39 mg/g。其中外源海藻糖處理的內(nèi)源海藻糖含量均顯著高于對照(圖2-C)。扦插繁殖過程中母鱗片可溶性糖含量在對照中呈現(xiàn)下降趨勢，而外源海藻糖處理的可溶性糖含量在0～25 d時降低，而在25～75 d時開始升高，分別比對照高6.4%、42.4%和92.5%(圖2-D)。

圖1 不同濃度海藻糖對百合鱗片扦插過程中子鱗莖數(shù)量的影響Figure 1 Effects of different concentrations of trehalose on the number of daughter bulbs during lily scale cutting

*表示對照和海藻糖處理處理之間的差異顯著性；*表示0.05水平差異顯著，**表示0.01水平差異顯著。*Indicates the significance of the difference between the control and trehalose treatments；* Indicates a significant difference at the 0.05 level,** indicates a significant difference at the 0.01 level.圖2 外源海藻糖對百合鱗片扦插過程中母鱗片淀粉、蔗糖和內(nèi)源海藻糖和可溶性糖含量的影響Figure 2 The effect of exogenous trehalose on the content of mother scale starch,sucrose,endogenous trehalose and soluble sugar during lily scale cutting

2.3 外源海藻糖對百合扦插過程中糖代謝相關酶活性的影響

母鱗片淀粉合成相關酶AGP的活性在扦插過程中持續(xù)降低，但外源海藻糖的處理緩解了它的降低并在50、75 d時效果顯著(圖3-A)。以水解蔗糖為主的SuSy的活性在扦插繁殖過程中呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，其在對照中的活性明顯高于外源海藻糖處理(圖3-B)。TPS活性在扦插過程中逐漸增加，外源海藻糖處理顯著提高了其活性的增加，且在50 d時呈現(xiàn)出極顯著的差異(圖3-C)。

2.4 外源海藻糖對百合扦插過程中糖代謝相關基因轉錄水平的影響

如圖4所示，SSS1轉錄水平在扦插過程中呈現(xiàn)下降的趨勢。在外源海藻糖處理的第25天， 其轉錄水平顯著低于對照，但在50、75 d顯著高于對照(圖4-A)。相反地，SBE和AGP1的轉錄水平在扦插過程中呈上升趨勢，且在外源海藻糖處理均顯著高于對照高(圖4-B～C)。相比于對照，外源海藻糖顯著的降低了扦插過程中SuSy1和INV2基因的轉錄水平(圖4-D～E)，其中，SuSy1的轉錄水平被外源海藻糖極顯著抑制，在75 d時對照中SuSy1的轉錄水平達到最大，比海藻糖處理高755.7%。TPS6、TPS7和TPS9的轉錄水平在扦插過程中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在25 d時其基因轉錄水平達到最高。相比于對照，海藻糖處理推遲了TPS6和TPS7的下降。在50、75 d，外源海藻糖處理減緩了TPS6、TPS7和TPS9的轉錄水平，并在50 d存在顯著性差異(圖4-F～H)。

*表示對照和海藻糖處理處理之間的差異顯著性；*表示0.05水平差異顯著，**表示0.01水平差異顯著。*Indicates the significance of the difference between the control and trehalose treatments；* Indicates a significant difference at the 0.05 level,** indicates a significant difference at the 0.01 level.圖3 外源海藻糖對百合鱗片扦插過程中母鱗片ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、蔗糖合成酶和6-磷酸海藻糖和酶酶活性的影響Figure 3 Effects of exogenous trehalose on ADP-glucose pyrophosphorylase,sucrose synthase,trehalose 6-phosphate and enzymatic activities of mother scales during lily scale cutting

3 討論

海藻糖在許多生物體中被用作碳水化合物的儲備物質和應激保護劑。因其所具有的不同于其他碳水化合物的獨特生物學特性，海藻糖可以在干旱、高溫、冷凍、脫水、高滲透等惡劣環(huán)境下保護生物體的細胞、蛋白質、糖類、核酸等組分不受損傷[16-18]。鄒德堂等[19]研究發(fā)現(xiàn)，10 mmol/L海藻糖處理的水稻幼苗總根長、根數(shù)、株高、存活率都有所提高，并且可以緩解堿脅迫對水稻幼苗造成的傷害。魏彬[20]的研究表明，海藻糖還可以提高低溫脅迫小麥幼穗的可孕天數(shù)，增加穗粒數(shù)。在本研究中，我們探討了外源海藻糖對百合扦插繁殖過程的影響，結果發(fā)現(xiàn)低濃度的外源海藻糖處理顯著提高了百合鱗片子鱗莖的發(fā)生，而高濃度的海藻糖會抑制子鱗莖的發(fā)生。陳素麗等[21]研究認為，高濃度的海藻糖可能會影響植物對碳水化合物的利用，從而抑制植物的生長。同樣金軍民等[22]也表明適宜濃度的海藻糖能夠促進生菜根系的生長。外源施用高濃度的海藻糖可能會取代植物中蔗糖的地位，進而影響韌皮部運輸蔗糖的進程。因此，高濃度的海藻糖會影響植物的生長發(fā)育?？梢?，海藻糖對植物的生理生化特性會產(chǎn)生一定的影響，并且能夠維持逆境下植物的正常生長并提高產(chǎn)量。在植物中，海藻糖可以作為一種信號分子參與代謝，也可以作為代謝產(chǎn)物調(diào)控植物代謝和基因表達[23]。在外源海藻糖處理的母鱗片中，內(nèi)源海藻糖的含量和TPS活性都顯著高于對照，說明外源海藻糖可能通過增強TPS活性，促進內(nèi)源海藻糖的形成，進而參與鱗片扦插過程的調(diào)節(jié)。

*表示對照和海藻糖處理處理之間的差異顯著性；*表示0.05水平差異顯著，**表示0.01水平差異顯著。*Indicates the significance of the difference between the control and trehalose treatments；* Indicates a significant difference at the 0.05 level,** indicates a significant difference at the 0.01 level.圖4 外源海藻糖對百合鱗片扦插過程中母鱗片淀粉、蔗糖和內(nèi)源海藻糖代謝相關基因轉錄水平的影響Figure 4 The effect of exogenous trehalose on the transcription level of mother scale starch,sucrose,and endogenous trehalose metabolism-related genes during lily scale cutting

在百合的繁殖生長過程中，蔗糖對子鱗莖的形態(tài)建成起著非常重要的作用，而淀粉對子鱗莖的發(fā)生和發(fā)育至關重要[4]。有研究表明母鱗片的碳水化合物含量在鱗片扦插繁殖過程中會持續(xù)下降[9,24]。這與我們的結果一致。此外，研究發(fā)現(xiàn)外源海藻糖處理減緩了鱗片扦插繁殖中淀粉和蔗糖含量的下降。AGP被認為是植物體中淀粉合成需要的第一步關鍵酶[25]，SuSy的主要功能是分解蔗糖，可以調(diào)控蔗糖參與調(diào)節(jié)碳水化合物等代謝途徑[26]。在百合鱗片扦插中，外源海藻糖處理的AGP活性顯著高于對照，而SuSy活性相反，說明外源海藻糖可以提高AGP活性從而增加母鱗片中淀粉的含量，相反的，抑制SuSy活性從而減少了蔗糖的降解。這一結果與孫紅梅等[24]在IBA與GA3調(diào)控百合鱗片扦插繁殖中的研究有差異。他們認為外源激素的施用促進了百合扦插鱗片中淀粉的快速降解、蔗糖合成。在轉錄水平中，外源海藻糖處理增加了淀粉合成相關基因SSS1、SBE和AGP1的相對表達量，而蔗糖代謝相關基因SuSy1和INV2的表達量相對于對照顯著下降。這與淀粉和蔗糖相關酶活性的變化趨勢一致?？扇苄蕴遣粌H作為光合作用的主要產(chǎn)物，也是碳水化合物代謝和能量暫時儲存的主要形式[27]。本研究發(fā)現(xiàn)外源海藻糖處理下百合鱗片中可溶性糖含量在扦插生長后期呈增加趨勢，這與孫漢青等[28]的研究結果相似，即干旱條件下施加外源ABA和海藻糖可以促進蘋果果實中可溶性糖含量的增加。馬光恕[29]也報道了不同濃度的海藻糖處理可以提高鹽脅迫下甜瓜幼苗的可溶性糖含量和根系活力。

4 結論

本研究發(fā)現(xiàn)，50 mmol/L的外源海藻糖處理顯著提高了扦插繁殖過程子鱗莖的數(shù)量，說明海藻糖對百合扦插繁殖具有促進作用。在百合鱗片的扦插繁殖過程中，母鱗片的碳水化合物含量持續(xù)下降，而外源海藻糖的施用顯著減緩了這一損失。此外，外源海藻糖顯著增加了淀粉合成相關酶活性及其基因表達，而蔗糖分解相關酶活性和基因的表達被顯著抑制。最后，外源海藻糖增加了內(nèi)源海藻糖的含量及其合成相關酶活性和基因的表達?？梢?，外源海藻糖可能是通過增加其內(nèi)源糖合成和抑制糖降解來調(diào)節(jié)鱗片中的糖以及子鱗莖的發(fā)生。