熊向英，王志成，劉旭佳，姚坤志，梁志輝

(1.廣西海洋研究所有限責(zé)任公司，廣西北海 536000;2.廣西科學(xué)院，廣西北部灣海洋研究中心，廣西近海海洋環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530007)

魚類腸道內(nèi)定植著大量的微生物，這些微生物參與了魚類的營(yíng)養(yǎng)代謝、抑制病原微生物等多方面生理過(guò)程[1]，查明腸道菌群的組成有助于了解魚類的生長(zhǎng)情況。近年來(lái)大量研究報(bào)道了不同因素下魚類腸道菌群的組成，如魚類生長(zhǎng)階段、環(huán)境、病害的發(fā)生以及飼料等[2-4]。但由于魚類種類繁多，已有的報(bào)道尚不能全面反映魚類腸道細(xì)菌的多樣性及其影響因素。

工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖模式具有節(jié)水、節(jié)地、排放廢水少、對(duì)環(huán)境污染小、可實(shí)現(xiàn)常年生產(chǎn)等諸多優(yōu)點(diǎn)[5,6]，是水產(chǎn)養(yǎng)殖綠色發(fā)展的重要方向之一。工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖模式下魚類腸道微生物組成及其與養(yǎng)殖海水的相關(guān)性值得關(guān)注。珍珠龍膽石斑魚(Epinephelusfuscoguttatus♂×E.lanceolatu♀)和紅鰭笛鯛(Lutjanuserythropterus)都具有生長(zhǎng)速度快、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、經(jīng)濟(jì)效益顯著等特點(diǎn)，為中國(guó)南方重要的優(yōu)良經(jīng)濟(jì)魚種[7,8]。本研究通過(guò)16S rDNA高通量測(cè)序的方法，初步分析了在工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖模式下兩種魚類腸道細(xì)菌多樣性及其與養(yǎng)殖環(huán)境的關(guān)系，以期為魚類腸道菌群的組成和影響因素提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)

工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)建于廣西北海市廣西海洋研究所海水增養(yǎng)殖基地試驗(yàn)車間，該車間用于試驗(yàn)養(yǎng)殖的水池有13個(gè)，每個(gè)池面積17.34 m2(5.1 m×3.4 m)，水深90 cm，有效養(yǎng)殖水體15.6 m3/個(gè)，其中4個(gè)池養(yǎng)殖珍珠龍膽石斑魚，密度為71尾/m3；另外9個(gè)池養(yǎng)殖紅鰭笛鯛，密度為160尾/m3。循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)處理順序?yàn)轸~池→沉淀池→蛋白質(zhì)分離器→生物濾池→海馬齒浮床→紫外殺菌→魚池。

1.2 養(yǎng)殖管理

試驗(yàn)期間循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)水質(zhì)條件為水溫28.5-31.4℃，溶解氧濃度7.87-9.05 mg/L，鹽度28-31，pH值7.8-8.1。養(yǎng)殖期間每天早上和下午分別喂1次，投喂量約為魚體重量的3%-5%，根據(jù)其攝食情況投喂。珍珠龍膽石斑魚投喂廣東恒興石斑魚配合飼料，紅鰭笛鯛投喂廣東恒興海水魚膨化飼料，兩種飼料成分對(duì)比見(jiàn)表1。

1.3 樣品采集及DNA提取

隨機(jī)捕撈珍珠龍膽石斑魚和紅鰭笛鯛各3尾置于解剖盤中，用75%酒精對(duì)其體表進(jìn)行消毒，用滅菌的剪刀、鑷子解剖取其腸道后迅速放入-80℃冰箱保存。取樣時(shí)珍珠龍膽石斑魚平均體長(zhǎng)為15.9 cm，平均體質(zhì)量為136.4 g；紅鰭笛鯛平均體長(zhǎng)為11.4 cm，平均體質(zhì)量為42.1 g。用組織勻漿機(jī)對(duì)珍珠龍膽石斑魚和紅鰭笛鯛腸道勻漿，然后采用Soil DNA Kit試劑盒(Omega Bio-Tek，美國(guó))提取腸道中微生物總DNA。珍珠龍膽石斑魚養(yǎng)殖池和紅鰭笛鯛養(yǎng)殖池水樣則采用多點(diǎn)取樣法，每池從3個(gè)點(diǎn)各取1 L水混合均勻后，取其中1 L水樣先經(jīng)5 μm孔徑的混合纖維膜預(yù)過(guò)濾去除雜質(zhì)后用0.22 μm無(wú)菌聚醚砜膜(天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)抽濾，將帶有水體宏基因組的濾膜剪碎，用E.Z.N.A.Water DNA Extraction Kit試劑盒(Omega Bio-Tek，美國(guó))提取水體中微生物總DNA。

1.4 PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序

對(duì)16S rDNA基因可變區(qū)V3-V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用引物序列為細(xì)菌特異性引物341F (5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和806R (5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)。PCR產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，送北京百邁克生物信息科技有限公司進(jìn)行基于Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)的高通量測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

對(duì)原始測(cè)序序列使用FLASH軟件(版本1.2.11)進(jìn)行拼接，將拼接得到的序列使用Trimmomatic軟件(版本0.33)進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾，并利用UCHIME軟件(版本8.1)去除嵌合體，得到高質(zhì)量序列(Tags)。分析過(guò)程中刪除古菌、葉綠體、未知序列以及只檢測(cè)到1次的序列。利用USEARCH (版本10.0)軟件對(duì)所有樣品的Tags進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97%的一致性(Identity)將序列聚類成為可操作分類單元(Operational Taxonomic Unit，OTU)，得到每個(gè)樣品的OTU數(shù)目，利用Venn圖分析樣品之間共有、特有的OTU數(shù)目，與SILVA的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，對(duì)其進(jìn)行物種注釋分析。通過(guò)α多樣性分析，統(tǒng)計(jì)各樣品在97%相似度水平下的Chao1、Shannon及Simpson指數(shù)，研究單個(gè)樣品內(nèi)部的物種多樣性；通過(guò)β多樣性分析，根據(jù)距離矩陣獲得相應(yīng)距離下的PCoA分析，比較不同樣品間的物種多樣性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 珍珠龍膽石斑魚和紅鰭笛鯛腸道、養(yǎng)殖水體的細(xì)菌多樣性分析

珍珠龍膽石斑魚和紅鰭笛鯛腸道、養(yǎng)殖水體中的細(xì)菌多樣性見(jiàn)表2。從表2可以看出，珍珠龍膽石斑魚和紅鰭笛鯛腸道菌群Chao1指數(shù)高于養(yǎng)殖水體，表明兩種魚腸道菌群豐度要高于養(yǎng)殖水體。珍珠龍膽石斑魚腸道Shannon指數(shù)在所有樣品中最高，Simpson指數(shù)在所有樣品中最低，表明珍珠龍膽石斑魚腸道菌群多樣性高于其養(yǎng)殖水體和紅鰭笛鯛。紅鰭笛鯛腸道Shannon指數(shù)在所有樣品中最低，Simpson指數(shù)在所有樣品中最高，表明紅鰭笛鯛腸道菌群多樣性比其養(yǎng)殖水體低。

表2 珍珠龍膽石斑魚和紅鰭笛鯛腸道及養(yǎng)殖水體中的細(xì)菌多樣性

2.2 珍珠龍膽石斑魚和紅鰭笛鯛腸道、養(yǎng)殖池水的細(xì)菌相關(guān)性分析

所有樣品共有的OTUs為72個(gè)；珍珠龍膽石斑魚腸道及其養(yǎng)殖池水共有的OTUs為179個(gè)；紅鰭笛鯛腸道及其養(yǎng)殖池水共有的OTUs為208個(gè)；珍珠龍膽石斑魚和紅鰭笛鯛腸道菌群中的OTUs分別有19.39%和25.68%與其養(yǎng)殖水體中的OTUs一致。珍珠龍膽石斑魚和紅鰭笛鯛腸道中共有的OTUs為696個(gè)；珍珠龍膽石斑魚腸道中有高達(dá)75.41%的OTUs與紅鰭笛鯛一致(圖1)。

Epi表示珍珠龍膽石斑魚腸道；Lut表示紅鰭笛鯛腸道；EpiPro表示珍珠龍膽石斑魚養(yǎng)殖池水；LutPro表示紅鰭笛鯛養(yǎng)殖池水

從圖2可知，珍珠龍膽石斑魚和紅鰭笛鯛腸道菌群明顯分離，珍珠龍膽石斑魚和紅鰭笛鯛腸道微生物與其各自養(yǎng)殖池水體微生物明顯分離。珍珠龍膽石斑魚和紅鰭笛鯛腸道菌群的相似性要高于二者與其各自養(yǎng)殖水體中細(xì)菌的相似性。

2.3 珍珠龍膽石斑魚和紅鰭笛鯛腸道細(xì)菌群落組成及相對(duì)豐度

在門分類水平上，珍珠龍膽石斑魚腸道中相對(duì)豐度較高的細(xì)菌門類為厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、放線菌門和酸桿菌門，平均相對(duì)豐度分別為32%、28%、13%、8%和7%。紅鰭笛鯛腸道中優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門和疣微菌門，平均相對(duì)豐度為73%和3%。珍珠龍膽石斑魚和紅鰭笛鯛腸道中共有的細(xì)菌門類為變形菌門，但相對(duì)豐度差異較大(圖3)。

Epi表示珍珠龍膽石斑魚腸道；Lut表示紅鰭笛鯛腸道；EpiPro表示珍珠龍膽石斑魚養(yǎng)殖池水；LutPro表示紅鰭笛鯛養(yǎng)殖池水

圖3 基于門分類水平的珍珠龍膽石斑魚和紅鰭笛鯛腸道細(xì)菌群落組成和相對(duì)豐度

從圖4可以看出，珍珠龍膽石斑魚腸道中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為梭菌綱、α-變形菌綱、γ-變形菌綱、擬桿菌綱和桿菌綱，相對(duì)豐度分別為24%、12%、9%、8%和6%。紅鰭笛鯛腸道排名前3的細(xì)菌為δ-變形菌綱、γ-變形菌綱和α-變形菌綱，相對(duì)豐度分別為54%、12%和7%。由綱分類水平可知，珍珠龍膽石斑魚和紅鰭笛鯛腸道中α-變形菌綱和γ-變形菌綱的相對(duì)豐度類似。

圖4 基于綱分類水平的珍珠龍膽石斑魚和紅鰭笛鯛腸道細(xì)菌群落的組成和相對(duì)豐度

從圖5可知，在科分類水平上，珍珠龍膽石斑魚優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為真桿菌科、毛螺菌科、疣微菌科、鞘脂單胞菌科、乳酸桿菌科和Bacteroidales_S24_7_group，相對(duì)豐度分別為9%、8%、6%、4%、4%和4%。紅鰭笛鯛腸道中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為脫硫弧菌科、弧菌科和紅桿菌科，相對(duì)豐度分別為54%、10%和5%。珍珠龍膽石斑魚和紅鰭笛鯛中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌在科分類水平上完全不一致。

圖5 基于科分類水平的珍珠龍膽石斑魚和紅鰭笛鯛腸道細(xì)菌群落組成和相對(duì)豐度

3 討論

3.1 珍珠龍膽石斑魚和紅鰭笛鯛腸道及其養(yǎng)殖水體菌群多樣性分析

前人研究結(jié)果表明，水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物腸道菌群多樣性要低于其養(yǎng)殖環(huán)境，如半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)和克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)腸道菌群多樣性均比養(yǎng)殖水體或底泥中低[9-12]。但本研究出現(xiàn)不同的結(jié)果，從α多樣性指數(shù)可以看出，珍珠龍膽石斑魚和紅鰭笛鯛腸道菌群豐度要高于其養(yǎng)殖水體中的細(xì)菌，且前者腸道菌群多樣性同樣高于養(yǎng)殖水體。這可能是因?yàn)榍叭搜芯康酿B(yǎng)殖環(huán)境都是在網(wǎng)箱或池塘等自然生境中[9-12]，本研究是工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖，水體要經(jīng)過(guò)紫外殺菌處理后才流回養(yǎng)殖池，相比自然環(huán)境，工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖環(huán)境中的細(xì)菌更少。另外，珍珠龍膽石斑魚腸道中Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)都比紅鰭笛鯛高，同時(shí)Simpson指數(shù)比紅鰭笛鯛低，表明珍珠龍膽石斑魚腸道細(xì)菌豐度和細(xì)菌多樣性均比紅鰭笛鯛高，這種差異可能與宿主的遺傳因素有關(guān)。

3.2 珍珠龍膽石斑魚和紅鰭笛鯛腸道及其養(yǎng)殖水體菌群相關(guān)性分析

張琛等[13]發(fā)現(xiàn)海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的花鱸(Lateolabraxjaponicus)和日本黃姑魚(Nibeajaponica)之間腸道細(xì)菌的相似性高于花鱸或日本黃姑魚腸道細(xì)菌與其養(yǎng)殖網(wǎng)箱內(nèi)海水細(xì)菌的相似性。同樣地，近岸網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚(Larimichthyscrocea)和黑鯛(Sparusmacrocephalus)之間腸道細(xì)菌的相似性高于其與海水細(xì)菌的相似性[14]。本研究中珍珠龍膽石斑魚和紅鰭笛鯛腸道菌群中分別有19.39%和25.68%的OTUs與其養(yǎng)殖水體一致，珍珠龍膽石斑魚腸道中有75.41%的OTUs與紅鰭笛鯛一致。同時(shí)通過(guò)β多樣性分析也顯示，珍珠龍膽石斑魚和紅鰭笛鯛腸道菌群的相似性要高于二者與其各自養(yǎng)殖水體中細(xì)菌的相似性。因此，本研究表明在同一個(gè)養(yǎng)殖環(huán)境下兩種魚腸道微生物之間的相似性要比其與養(yǎng)殖水體中的細(xì)菌相似性高，工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖水體對(duì)魚類腸道菌群的影響有限。有研究表明水體中的菌群會(huì)直接影響?zhàn)B殖魚類消化道中的微生物組成[15,16]，但隨著新技術(shù)的發(fā)展，近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明養(yǎng)殖水體中的細(xì)菌和魚類腸道菌群相關(guān)性不大：池塘養(yǎng)殖半滑舌鰨的消化道菌群和池水中的細(xì)菌明顯不同，幾乎沒(méi)有相關(guān)性[9]；健康大菱鲆幼魚腸道與養(yǎng)殖水體共有的OTU數(shù)目為0[17]。

3.3 珍珠龍膽石斑魚和紅鰭笛鯛腸道優(yōu)勢(shì)菌群分析

魚菜共生模式下養(yǎng)殖的不同食性鯉科魚類腸道微生物優(yōu)勢(shì)菌群的組成十分相似[18]。湖泊養(yǎng)殖食性相同的草魚(Ctenopharyngodonidellus)和團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)消化道微生物群落組成不存在顯著差異[19]。養(yǎng)殖池塘中不同種類魚類腸道細(xì)菌結(jié)構(gòu)存在較大差異，認(rèn)為食性對(duì)魚類腸道細(xì)菌群落的影響可能大于棲息水層[20]。同一室內(nèi)飼養(yǎng)的銀鯽(Carassiusauratusgibelio)和異育銀鯽(Carassiusauratusgibeliovar.CASⅢ)腸道菌群結(jié)構(gòu)相似，但斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)與二者有較大差異，認(rèn)為該差異受魚類基因型的影響更大[21]。本研究進(jìn)一步從優(yōu)勢(shì)菌群來(lái)比較珍珠龍膽石斑魚和紅鰭笛鯛腸道菌群的差異。由結(jié)果可知，雖然珍珠龍膽石斑魚和紅鰭笛鯛腸道優(yōu)勢(shì)菌群在門和綱的分類水平上有部分一致，但在更小的分類階元科水平上完全不同，這可能與魚飼料差異有關(guān)。珍珠龍膽石斑魚飼料中的粗蛋白質(zhì)含量比紅鰭笛鯛飼料中的粗蛋白質(zhì)含量高8%，粗脂肪含量高2%(表1)，其腸道優(yōu)勢(shì)菌群中的厚壁菌門和擬桿菌門有利于腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)換和吸收[22]。紅鰭笛鯛腸道中變形菌門為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群，變形菌門含量過(guò)高不利于腸道微生態(tài)平衡[23]。

Zhang等[14]發(fā)現(xiàn)網(wǎng)箱養(yǎng)殖且投喂相同飼料的大黃魚和黑鯛腸道優(yōu)勢(shì)菌群無(wú)論是從門分類水平上還是屬分類水平上皆不同。有學(xué)者認(rèn)為腸道微生物更依賴于宿主的遺傳背景和免疫反應(yīng)[24]，如不同生境草魚消化道主要微生物群落組成基本相同，不具有生境特異性[19]。目前還未見(jiàn)有關(guān)紅鰭笛鯛腸道菌群的報(bào)道，但對(duì)珍珠龍膽石斑魚腸道菌群有不少研究。朱旭楓等[25]對(duì)珍珠龍膽石斑魚腸道菌群的研究結(jié)果表明，基礎(chǔ)飼料組變形菌門含量達(dá)到99.13%以上。叢林梅等[7]發(fā)現(xiàn)投喂商品飼料的珍珠龍膽石斑魚幼魚腸道菌群以變形菌門(61.43%)、擬桿菌門(11.30%)和厚壁菌門(13.61%)為主。麥浩彬等[22]發(fā)現(xiàn)投喂不同水平飼料蛋白質(zhì)的珍珠龍膽石斑魚幼魚腸道優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門(27.72%-45.46%)、放線菌門(20.50%-45.20%)、厚壁菌門(11.58%-29.55%)和擬桿菌門(3.21%-13.56%)。本研究中珍珠龍膽石斑魚腸道優(yōu)勢(shì)菌群為厚壁菌門(32%)、變形菌門(28%)、擬桿菌門(13%)。以上研究結(jié)果表明，珍珠龍膽石斑魚腸道優(yōu)勢(shì)細(xì)菌主要有變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門，但不同研究中各門的相對(duì)豐度差異較大。綜上，影響魚類腸道微生物組成和豐度的因子繁多，包括物種、個(gè)體不同發(fā)育階段、飼料、水環(huán)境因子、水體微生物群落以及養(yǎng)殖模式等[26]，有待更深入研究。

4 結(jié)論

工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖的珍珠龍膽石斑魚和紅鰭笛鯛腸道菌群豐度要高于其各自養(yǎng)殖水體中的細(xì)菌，珍珠龍膽石斑魚腸道菌群豐度和菌群多樣性高于紅鰭笛鯛。珍珠龍膽石斑魚和紅鰭笛鯛腸道微生物之間的相似性要高于其與各自養(yǎng)殖水體中的相似性。工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖的兩種魚類腸道中雖然大部分細(xì)菌種類一致，但關(guān)鍵的優(yōu)勢(shì)菌群均不同，養(yǎng)殖水體細(xì)菌對(duì)魚類腸道菌群的影響有限。