生活飲用水中細(xì)菌總數(shù)檢測的方法比較與應(yīng)用

鄭亦舟

(上海浦東威立雅自來水有限公司，上海 200127)

近年來，隨著人們生活品質(zhì)的不斷提高，對高品質(zhì)飲用水的需求也愈加迫切，而飲用水中生物安全性指標(biāo)是保證飲用水品質(zhì)的重要一環(huán)。2018年1月4日，上海市政府發(fā)布的《上海市城市總體規(guī)劃(2017—2035年)》提出“提高入戶水質(zhì)，滿足直飲需求”。相應(yīng)供給端的檢測市場對于生活飲用水中微生物指標(biāo)檢測方法的研究也隨著需求提升不斷開展，各種產(chǎn)品化的檢測試劑盒也是層出不窮。其中，供水企業(yè)常用的水中細(xì)菌總數(shù)檢測方法有異養(yǎng)菌平板計(jì)數(shù)法(heterotrophic plate count，HPC)、酶底物法以及ATP生物熒光檢測法?！渡铒嬘盟l(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 5749—2006)中生活飲用水的菌落總數(shù)限值規(guī)定為<100 CFU/mL。通過樣品在營養(yǎng)瓊脂上有氧條件培養(yǎng)，對所得水樣中含菌落的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，以反映水中微生物的生長情況。由于培養(yǎng)溫度高、培養(yǎng)時(shí)間相對短，營養(yǎng)瓊脂HPC方法具有一定局限性，很多報(bào)道中會(huì)用R2A HPC檢測異養(yǎng)菌數(shù)量來代替營養(yǎng)瓊脂HPC檢測樣品中的微生物水平，通過一種低營養(yǎng)含量的培養(yǎng)基(R2A培養(yǎng)基)，配合較低的培養(yǎng)溫度和延長的培養(yǎng)時(shí)間，以獲得更加適用于生活飲用水中微生物實(shí)際水平的檢測結(jié)果[1-3]。

酶底物法(defined substrate technology，DST)在生活飲用水的檢測中多被研究應(yīng)用于總大腸菌群和嗜肺軍團(tuán)菌的檢測，其靈敏度更高、操作流程簡單，具有很好的應(yīng)用前景[4-5]。該方法通過選擇性培養(yǎng)基來對產(chǎn)生某種酶的細(xì)菌群組進(jìn)行檢測。但在細(xì)菌總數(shù)的檢測中應(yīng)用較少，理論上它可以通過選擇性培養(yǎng)基分解色原底物從而釋放色原體，使培養(yǎng)基呈現(xiàn)顏色變化，通過計(jì)數(shù)變色的孔徑數(shù)量來檢測水中的細(xì)菌總數(shù)。因此，酶底物法在生活飲用水細(xì)菌總數(shù)檢測中的應(yīng)用及其與培養(yǎng)法的對比是值得研究的課題。

三磷酸腺苷(ATP)生物發(fā)光法檢測：ATP是細(xì)菌、藻類、植物和動(dòng)物細(xì)胞等所有生命形式的主要能量載體，測量樣品中ATP的濃度可以獲得微生物濃度和其健康狀況的關(guān)鍵數(shù)據(jù)。20世紀(jì)70年代中期該技術(shù)逐漸形成并產(chǎn)生，ATP可以存在于活性微生物細(xì)胞內(nèi)(cATP，胞內(nèi)ATP)和游離在細(xì)胞以外(dATP、胞外ATP)，通過使用照度計(jì)來測量ATP和螢光素酶催化反應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度(RLU)來進(jìn)行樣品中ATP濃度的定量分析。目前，已有研究表明微生物濃度和ATP含量之間存在相互關(guān)系，可以通過ATP濃度的測定來反映細(xì)菌濃度的實(shí)際情況[6]。將ATP生物熒光法用于生活飲用水中細(xì)菌總數(shù)的檢測須通過膜過濾富集，同時(shí)適當(dāng)添加緩沖劑、熒光劑等[7]，其應(yīng)用場景和檢測過程的便捷性是檢測市場十分關(guān)注的問題。

本文從水質(zhì)檢測實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌總數(shù)檢測方法應(yīng)用的角度，通過4種生活飲用水細(xì)菌總數(shù)檢測方法分別對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品、水源水樣品及出廠水樣品進(jìn)行對比檢測，以探究各檢測方法所適用的檢測場景，以期對高品質(zhì)飲用水的保障手段進(jìn)行探討。

1 材料與方法

采集上海浦東某水廠出廠水樣品和水源水樣品，采購IDEXX菌落總數(shù)質(zhì)控樣品(產(chǎn)品編號(hào)：HPCQC，批號(hào)：200820)，采用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(PCA)、R2A培養(yǎng)基、ATP試劑盒以及IDEXX SimPlate復(fù)合酶底物來對樣品進(jìn)行檢測。

使用121 ℃下滅菌20 min的玻璃細(xì)菌瓶，預(yù)先加入少量摩爾濃度為0.001 mol/L的Na2S2O3中和出廠水中的余氯。秉持無菌操作的原則對采樣龍頭進(jìn)行消毒后，采集水源水樣和出廠水樣。質(zhì)控樣品按照標(biāo)準(zhǔn)樣品說明書制備。

1.1 培養(yǎng)基的成分

PCA：蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、氯化鈉5 g、瓊脂10～20 g、蒸餾水1 000 mL。pH值控制在7.4～7.6，在103.43 kPa(121 ℃，20 min)下滅菌后，分裝待用。

R2A培養(yǎng)基：酵母浸出粉0.5 g、蛋白胨0.5 g、酪蛋白水解物0.5 g、葡萄糖0.5 g、可溶性淀粉0.5 g、磷酸氫二鉀0.3 g、無水硫酸鎂0.024 g、丙酮酸鈉0.3 g、瓊脂15.0 g。pH值控制在7.4～7.6，在103.43 kPa(121 ℃，20 min)下滅菌后，分裝待用。

1.2 檢測方法的選擇

菌落總數(shù)的檢測：按照《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法微生物指標(biāo)》(GB/T 5750.12—2006)1.1節(jié)平皿計(jì)數(shù)法的檢驗(yàn)步驟，將水樣在營養(yǎng)瓊脂上有氧條件37 ℃培養(yǎng)48 h后，測量所得1 mL水樣所含菌落的總數(shù)。

異養(yǎng)菌計(jì)數(shù)法的檢測：分別用平板傾注法和平板涂布法將水樣在R2A培養(yǎng)基上有氧條件(25 ℃)培養(yǎng)7 d后，測量所得1 mL水樣所含異養(yǎng)菌菌落的總數(shù)。

酶底物法的檢測：將水樣加入SimPlate培養(yǎng)基，混勻后加入SimPlate定量盤使之裝滿所有的孔槽；倒置培養(yǎng)定量盤在(36±1) ℃培養(yǎng)48 h；于紫外燈下讀取熒光的孔格，對照MPN表讀取檢測結(jié)果。

ATP生物熒光法的檢測：將50 mL水樣經(jīng)過富集后的過濾器萃取液放入測試管，加入試劑盒配套的熒光素酶試劑，再加入稀釋液后旋轉(zhuǎn)搖勻并在10 s內(nèi)讀數(shù)；該結(jié)果減去空白值后記為樣品中ATP發(fā)光強(qiáng)度，從而用于ATP的定量分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 微生物培養(yǎng)法對不同來源樣品的檢測結(jié)果

基于菌落培養(yǎng)原理對生活飲用水中的生物穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)的3種方法分別是營養(yǎng)瓊脂HPC檢測方法、R2A HPC傾注檢測方法、R2A HPC涂布檢測方法。表1羅列了應(yīng)用這3種培養(yǎng)方法對同一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品、水源水樣品及出廠水樣品檢測的結(jié)果。其中，出廠水樣品為生活飲用水檢測實(shí)驗(yàn)室中常見的低濃度樣品，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品的細(xì)菌總數(shù)控制在102CFU/mL數(shù)量級(jí)代表中等濃度樣品，水源水樣品為生活飲用水檢測實(shí)驗(yàn)室中常見的高濃度樣品。首先，對于已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控樣品，3種方法的檢測結(jié)果都在其真值的2倍標(biāo)準(zhǔn)偏差可接受范圍內(nèi)，都能較好地反映水樣中異養(yǎng)菌含量。其次，3種檢測方法對中低高這3個(gè)濃度梯度樣品的檢測結(jié)果呈現(xiàn)一致性的大小排序，HPC涂布法檢測結(jié)果略高于HPC傾注法檢測結(jié)果，HPC傾注法檢測結(jié)果略高于平皿計(jì)數(shù)法，但基本在同一數(shù)量級(jí)上。造成該結(jié)果的原因可能是HPC傾注法與HPC涂布法取樣量的差異，傾注法的取樣量是涂布法的10倍，因此，檢測結(jié)果為乘以差異的倍數(shù)來計(jì)數(shù)最終的報(bào)告結(jié)果，其中無法排除取樣量的不同而造成的結(jié)果影響。另外，溫度在45 ℃左右的培養(yǎng)基在傾注的過程中會(huì)將某些好氧菌滅活或者會(huì)被覆蓋在培養(yǎng)基的中間區(qū)域，在培養(yǎng)過程中無法生長為菌落參與結(jié)果計(jì)數(shù)，造成結(jié)果偏低。

表1 培養(yǎng)法檢測各樣品結(jié)果Tab.1 Results of Each Sample Tested by Culture Method

平皿計(jì)數(shù)法與HPC計(jì)數(shù)法相比，培養(yǎng)基、培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)溫度均不同。HPC計(jì)數(shù)法通過低營養(yǎng)含量配合更長的培養(yǎng)時(shí)間和較低的溫度，使其生長的環(huán)境更接近生活飲用水，從而能夠?qū)︼嬘盟械囊恍┦芤种频哪吐染?、假單胞菌等有更好的檢出限和靈敏性[8]。因此，平皿計(jì)數(shù)法在較高溫度和較短時(shí)間條件下，培養(yǎng)產(chǎn)生的菌落數(shù)低于HPC計(jì)數(shù)法貧營養(yǎng)培養(yǎng)基在低溫和長時(shí)間下培養(yǎng)的菌落數(shù)。對于生活飲用水樣品而言，菌落數(shù)較少，HPC計(jì)數(shù)法具有更高的靈敏度，更能反映水樣中真實(shí)的生物穩(wěn)定性變化。

綜合3種培養(yǎng)方法的檢測結(jié)果，R2A HPC涂布法在25 ℃下，培養(yǎng)7 d，所得的1 mL樣品所含的菌落總數(shù)結(jié)果具有更高的靈敏性，能夠更真實(shí)地反映水樣中的微生物生長情況。

2.2 酶底物法對不同來源樣品的檢測結(jié)果

實(shí)際應(yīng)用酶底物法檢測生活飲用水中細(xì)菌總數(shù)的最大難點(diǎn)，在于其檢測原理與結(jié)果計(jì)數(shù)方法和培養(yǎng)法完全不同而導(dǎo)致最后結(jié)果的表示方式不同，酶底物法的計(jì)數(shù)結(jié)果以統(tǒng)計(jì)學(xué)概念中最大可能數(shù)(MPN/mL)來表示，而培養(yǎng)法的計(jì)數(shù)結(jié)果以菌落形成數(shù)(CFU/mL)來表示。基于檢測原理的限制，兩類方法的檢測結(jié)果不能完全等同比較。對不同來源樣品的檢測結(jié)果如表2所示，對于已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控樣品，酶底物法的檢測結(jié)果能夠落在其真值的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差可接受范圍內(nèi)，能夠定量地反映水樣中異養(yǎng)菌數(shù)量。對于水源水和出廠水樣品，雖然計(jì)數(shù)結(jié)果表示方式不同，但其檢測結(jié)果都能夠和培養(yǎng)法在同一數(shù)量級(jí)上，最大可能數(shù)的取值整體會(huì)高于菌落生成數(shù)的數(shù)量。在實(shí)際檢測市場中，由于生活飲用水國家標(biāo)準(zhǔn)的微生物指標(biāo)限值由CFU/mL來計(jì)數(shù)，在一定程度上限制了酶底物法在部分市場中的應(yīng)用。不過該方法有其顯著的優(yōu)勢和適用場景，將會(huì)在下文進(jìn)一步討論。

表2 酶底物法檢測各樣品結(jié)果Tab.2 Result of Each Sample Detected by Enzyme Substrate Method

2.3 ATP檢測法對不同來源樣品的檢測結(jié)果

應(yīng)用ATP生物熒光法對不同來源樣品的檢測結(jié)果如表3所示，該方法通過使用照度計(jì)來測量ATP和螢光素酶催化反應(yīng)產(chǎn)生的RLU，因此，所得的定量值為熒光發(fā)光的強(qiáng)度，間接定量計(jì)算出生活飲用水中每毫升樣品ATP的含量。而本文中第二代ATP檢測方法在檢測生活飲用水時(shí)的富集和過濾階段將<0.45 μm的游離ATP或溶解ATP去除在過濾器之外，因此，由過濾器萃取液中檢測所得的ATP含量是cATP，更能反映生活飲用水內(nèi)的微生物含量。此法的檢測結(jié)果表示與酶底物法有同樣的應(yīng)用難點(diǎn)問題，由于檢測原理的限制所得結(jié)果與培養(yǎng)法和酶底物法所得的檢測結(jié)果只能在趨勢性和相關(guān)性上找到一些聯(lián)系，從而進(jìn)行快速的判斷與分析。以文中生活飲用水樣品中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品的檢測結(jié)果來看，ATP生物熒光檢測法與營養(yǎng)瓊脂HPC檢測法之間的關(guān)系式為y=12.30x2-130.11x+247.58，相關(guān)性判定系數(shù)R2為0.821 8，具有一定的相關(guān)性。ATP生物熒光檢測法與培養(yǎng)法之間的結(jié)果相關(guān)性研究也是國內(nèi)外細(xì)菌總數(shù)檢測應(yīng)用研究的熱點(diǎn)[9]。國內(nèi)生活飲用水檢測的多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)和限值是以菌落總數(shù)平皿計(jì)數(shù)法的結(jié)果作為基準(zhǔn)來衡量生活飲用水的生物安全性，但是該方法存在明顯的滯后性，對于生活飲用水這樣無時(shí)無刻在被使用及流動(dòng)的物質(zhì)而言，ATP生物熒光法此類有著較短檢測時(shí)間和簡易操作過程的檢測方法也有一定的市場需求，有其得天獨(dú)厚的檢測優(yōu)勢。

表3 ATP生物熒光法檢測各樣品結(jié)果Tab.3 ATP Method Test Results of Each Sample

2.4 各檢測方法檢測過程比較與適用場景討論

各檢測方法檢測過程的比較結(jié)果如表4所示。在方法依據(jù)上營養(yǎng)瓊脂HPC檢測法是國內(nèi)主流的檢測生活飲用水中微生物指標(biāo)的方法，其他的3種檢測方法的使用范圍有限，數(shù)據(jù)量積累不多，但都有其比較明顯的優(yōu)勢。酶底物法與ATP生物熒光法在人員要求和環(huán)境要求上只需簡單的培訓(xùn)后在現(xiàn)場或戶外場地即可進(jìn)行試驗(yàn)操作，省去了人員培訓(xùn)的周期和場地的限制，大大增加了細(xì)菌總數(shù)檢測的機(jī)動(dòng)性和應(yīng)急性。除此之外，ATP生物熒光法的檢測時(shí)間可以控制在5 min之內(nèi)出具結(jié)果，檢測儀器較小、攜帶方便。但是其檢測成本耗材價(jià)格較高，單次檢測成本為培養(yǎng)法的數(shù)十倍，且無法將ATP的來源加以區(qū)分，也不能識(shí)別微生物的種類。有時(shí)樣品或ATP提取劑等來源的某些離子會(huì)對ATP的測定造成干擾和抑制發(fā)光作用，其靈敏度仍不能滿足某些樣品的直接檢測要求。因此，在檢測低濃度微生物時(shí)，檢測結(jié)果不夠準(zhǔn)確[9]，產(chǎn)生假陽性的可能性較大[10]，需結(jié)合其他技術(shù)輔助檢測進(jìn)一步驗(yàn)證。而對于濃度較高的樣品，例如水源水樣品，其檢測結(jié)果中ATP含量可能有一部分是源于其他微生物甚至是動(dòng)物或植物細(xì)胞，這時(shí)造成檢測結(jié)果偏高的值是不可忽略不計(jì)的，這也是ATP檢測結(jié)果會(huì)與實(shí)際樣品中存在的細(xì)菌真值出現(xiàn)較大誤差的重要原因之一。目前水質(zhì)應(yīng)急事件保障過程中，可行的方案是同步采集水樣，采用菌落總數(shù)平皿計(jì)數(shù)法和ATP生物熒光法檢測，先根據(jù)ATP生物熒光法檢測結(jié)果進(jìn)行一些時(shí)效性高的應(yīng)急處理措施。隨后水樣的微生物指標(biāo)達(dá)標(biāo)與否需參考菌落總數(shù)平皿計(jì)數(shù)法的結(jié)果與國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行符合性判定。而酶底物法可能應(yīng)用的場景是移動(dòng)實(shí)驗(yàn)室等無法很好地保證環(huán)境無菌的情況下對生活飲用水中微生物含量的檢測，能夠盡可能避免環(huán)境污染，保證檢測結(jié)果的有效性。

表4 各檢測方法檢測過程比較Tab.4 Comparison of the Detecting Process of Each Detection Method

3 結(jié)論

通過應(yīng)用不同檢測方法分別對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品和上海浦東某水廠樣品進(jìn)行微生物指標(biāo)的檢測，ATP生物熒光檢測方法檢測效率最高，平均單個(gè)樣品檢測時(shí)間為5 min，且操作簡單，適用于水質(zhì)應(yīng)急事件等時(shí)效性要求較高的突發(fā)事件的現(xiàn)場處理。在實(shí)際市場應(yīng)用時(shí)，根據(jù)不同水質(zhì)檢測需求可配套使用多種其他檢測方法。培養(yǎng)法中R2A HPC涂布檢測方法對生活飲用水中微生物指標(biāo)的檢測靈敏性更高，但檢測周期較長、人員和環(huán)境要求嚴(yán)格，在實(shí)際市場應(yīng)用時(shí)需根據(jù)檢測需求配套使用其他檢測方法。酶底物法可用于移動(dòng)實(shí)驗(yàn)室等無法很好地保證環(huán)境無菌情況下的細(xì)菌總數(shù)檢測。