微生物群基因編輯技術(shù)演進(jìn)分析

張羽慧，徐根興,2,3，華子春,3*

(1.南京大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江蘇南京 210023；2.南京吉芮康生物科技有限公司，江蘇南京 210019；3.江蘇省產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院/常州南京大學(xué)高新技術(shù)研究院，江蘇南京 213164)

微生物種類繁多，是包括細(xì)菌、病毒、真菌以及 一些小型的原生生物、顯微藻類等在內(nèi)的一大類生物群體，它們個(gè)體微小，與人類疾病關(guān)系密切。這些微生物形成的微生物群在營(yíng)養(yǎng)吸收、宿主代謝、病原體防御、藥物加工等多個(gè)過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[1]。規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）是部分細(xì)菌和古細(xì)菌在長(zhǎng)期自然進(jìn)化過(guò)程中發(fā)展而來(lái)的一種對(duì)抗外源遺傳物質(zhì)入侵的適應(yīng)性免疫防御系統(tǒng)的一部分[2]。作為一種新興的基因組編輯和調(diào)控工具,研究人員不斷探索更多的微生物或微生物群的基因編輯應(yīng)用潛力[3-4]。隨著CRISPR基因編輯技術(shù)研究不斷升溫，該領(lǐng)域技術(shù)格局不斷變化的同時(shí)其技術(shù)演化研究明顯跟進(jìn)不足[5]。為了更好地理解微生物群基因編輯技術(shù)演進(jìn)路線和趨勢(shì)，本研究檢索了PubMed和Embase數(shù)據(jù)庫(kù)，逐層篩選并納入44篇研究，分析探索該領(lǐng)域的技術(shù)變化過(guò)程，為基因編輯技術(shù)產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新提供參考。

1 資料與方法

1.1 文獻(xiàn)檢索

計(jì)算機(jī)檢索PubMed和Embase數(shù)據(jù)庫(kù)。納入英文研究文獻(xiàn)，檢索時(shí)間均為建庫(kù)至2021年5月30日。檢索關(guān)鍵詞包括 microbiota、microbial community、microbiome、CRISPR、gene editing、genome editing等。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①主題詞中含有CRISPR基因編輯和微生物群或與其相關(guān)的關(guān)鍵詞的文獻(xiàn)；②產(chǎn)生技術(shù)進(jìn)展的文獻(xiàn)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①重復(fù)發(fā)表文獻(xiàn)；②與主題不相關(guān)的文獻(xiàn)；③使用相同基因編輯技術(shù)，但不含技術(shù)進(jìn)展研究的文獻(xiàn)；④文獻(xiàn)綜述、會(huì)議摘要等文獻(xiàn)。

1.3 研究方法

使用Excel 2010對(duì)納入相關(guān)研究的資料進(jìn)行匯總；Python 3.8進(jìn)行關(guān)鍵詞分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 文獻(xiàn)篩選流程及結(jié)果

初步檢索共獲得相關(guān)文獻(xiàn)902篇（PubMed獲得271篇，Embase獲得631篇），圖1顯示了具體篩選流程及排除原因，最終納入研究的有44篇。

圖1 文獻(xiàn)篩選流程及結(jié)果

2.2 納入文獻(xiàn)基本特征

表1展示了納入分析的44篇文獻(xiàn)的基本特征，將微生物群基因編輯技術(shù)研究范疇主要分為輔助工具、靶向和編輯。（1）輔助工具包括可以輔助CRISPR技術(shù)各個(gè)環(huán)節(jié)完成而開(kāi)發(fā)的各種工具，其中22篇文獻(xiàn)涉及輔助工具的開(kāi)發(fā)。（2）無(wú)論是外源CRISPR系統(tǒng)還是內(nèi)源CRISPR系統(tǒng)，都需要人為地遞送相應(yīng)的CRISPR組件到目標(biāo)位置，因此表2中“遞送”指需要人為遞送相應(yīng)的CRISPR組件到目標(biāo)位置的技術(shù)研究，在納入分析的文獻(xiàn)中有13篇文獻(xiàn)涉及遞送技術(shù)研究。（3）有11篇文獻(xiàn)圍繞編輯過(guò)程的靶向特異性、工具箱擴(kuò)展等技術(shù)進(jìn)行研究。

表1 研究納入文獻(xiàn)基本特征

2.3 累積發(fā)表量與時(shí)間趨勢(shì)圖

對(duì)納入研究的文獻(xiàn)發(fā)表時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（圖2），可以看出，2013—2018年，相關(guān)研究逐步增多；從2019年起進(jìn)入研究高峰，基因編輯技術(shù)進(jìn)入突破期。從研究范疇分析，有20篇文獻(xiàn)著重于輔助工具的研究（45%）、11篇側(cè)重于編輯研究（25%）、13篇?jiǎng)t重點(diǎn)關(guān)注遞送技術(shù)研究（30%）。通過(guò)對(duì)文獻(xiàn)的閱讀分析，基因編輯技術(shù)快速增長(zhǎng)的原因主要來(lái)自兩方面：一方面，下一代測(cè)序技術(shù)和大數(shù)據(jù)、人工智能的發(fā)展，直接或間接促進(jìn)了微生物中關(guān)于CRISPR-Cas各種輔助工具的開(kāi)發(fā)[5]；另一方面，不同Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)在擴(kuò)寬學(xué)者們對(duì)基因編輯工具箱的選擇范圍的同時(shí)，使研究可以更加深入和具有針對(duì)性，CRISPR技術(shù)作為一種生物技術(shù)也被用于探索CRISPR基因編輯技術(shù)的各個(gè)環(huán)節(jié)中。

圖2 文獻(xiàn)累積發(fā)表量與研究范疇

2.4 關(guān)鍵詞分析

對(duì)納入研究的文獻(xiàn)進(jìn)行關(guān)鍵詞分析。優(yōu)先匯總作者提供關(guān)鍵詞的研究21篇，利用Python的NLTK模塊對(duì)23篇作者未提供關(guān)鍵詞的文章名稱、摘要進(jìn)行名詞篩選并進(jìn)行詞頻統(tǒng)計(jì)，匯總后人工刪除非主題詞，并制作如圖3所示的詞云圖。從圖3中可以發(fā)現(xiàn)，目前出現(xiàn)頻率最高的2個(gè)詞是microbiota（微生物群）和Crispr/cas9。從CRISPR系統(tǒng)研究分析，Ⅱ型系統(tǒng)還是研究的重點(diǎn)，尤其是Cas9系統(tǒng)，與Cas系統(tǒng)相關(guān)的出現(xiàn)頻率較高的詞還有Crispri、Cas1、Cas12a及Spycas9等，基于I型系統(tǒng)的研究較少。值得注意的是，功效性詞，包括diversity（多樣化）、activity（活性）、variety（多樣性）等高頻出現(xiàn)，說(shuō)明目前的微生物群基因編輯技術(shù)研究的效果呈現(xiàn)出更多元化與細(xì)致化的特點(diǎn)。

圖3 關(guān)鍵詞詞云分析圖

2.5 技術(shù)功能效果演進(jìn)

2.5.1 主要功能效果分析

為了進(jìn)一步理解微生物群基因編輯技術(shù)的演進(jìn)方向，對(duì)文獻(xiàn)中技術(shù)效果類詞進(jìn)行匯總，見(jiàn)圖4。基于基因編輯的組件和特點(diǎn)分析，將其主要分為3大類：Adaptability（適應(yīng)性）、Specificity（特異性）、Diversity（多樣性）。并圍繞這三個(gè)功效方向細(xì)化基因編輯技術(shù)具體的技術(shù)演進(jìn)路線。

圖4 功能效果分析

（1）Adaptability（適應(yīng)性）。目前，學(xué)者們大都致力于利用不同方法手段來(lái)提高基因編輯技術(shù)在各種微生物上的編輯效率[6-7]。這不僅體現(xiàn)在編輯成功率的提高，還體現(xiàn)在安全性提高、復(fù)雜程度降低等，所以將可以產(chǎn)生功能效果的詞歸為適應(yīng)性范疇，如simplicity（簡(jiǎn)單性）、validity（有效性）、stability（穩(wěn)定性）等。

（2）Specificity（特異性）。CRISPR/Cas系統(tǒng)作為第三代基因編輯技術(shù)，與ZFNs和TALENS技術(shù)相比屬于輕量級(jí)的基因編輯系統(tǒng)，擁有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、成本低廉的特點(diǎn)。但是由于CRISPR/Cas技術(shù)主要是基于DNA完成的技術(shù)，這意味著需要精確的操作才能降低其可能由于脫靶產(chǎn)生的基因組毒性、基因組不穩(wěn)定性、基因功能的破壞、表觀遺傳改變等副作用，因此如何提高基因編輯技術(shù)精準(zhǔn)靶向的能力和特異性成為了研究的重中之中。此外，由于CRISPR技術(shù)之間相關(guān)性較強(qiáng)，特異性不僅體現(xiàn)在編輯過(guò)程中的靶向特異性，還體現(xiàn)在遞送系統(tǒng)中的遞送特異性，所以將specificity作為第二個(gè)功效方向。

（3）Diversity（多樣性）。圖4顯示多樣性是出現(xiàn)頻率最高的功效性詞。從CRISPR的相關(guān)序列技術(shù)發(fā)現(xiàn)以來(lái)，由于其在基因研究、疾病防治和遺傳改良等方面展示出了巨大的潛力，學(xué)者們致力于在各種微生物中探索更多新工具箱。

綜上，將目前選入的基因編輯技術(shù)效果總結(jié)為Adaptability（適應(yīng)性）、Specificity（特異性）和Diversity（多樣性），包括了方法層面和工具層面的多樣性、基因編輯預(yù)期達(dá)到的各種功能效果的適應(yīng)性及基因編輯技術(shù)本身特點(diǎn)和各種應(yīng)用中最為關(guān)鍵的特異性。

2.5.2 技術(shù)演進(jìn)分析

如圖5所示，根據(jù)2.5.1分類的三個(gè)研究效果方向?qū)λ芯课墨I(xiàn)的具體演進(jìn)趨勢(shì)進(jìn)一步細(xì)化，其中適應(yīng)性的細(xì)化包括復(fù)雜度降低、安全性提高、準(zhǔn)確度提高及靈敏度提高等；多樣性則主要體現(xiàn)在工具箱的擴(kuò)展和材料擴(kuò)展；特異性僅表現(xiàn)為特異性提高。

圖5 技術(shù)演進(jìn)路線

（1）輔助工具。輔助工具的開(kāi)發(fā)圍繞著微生物群基因編輯技術(shù)的各個(gè)環(huán)節(jié)展開(kāi)，流向主要集中在多樣性和適應(yīng)性。其中，適應(yīng)性方向體現(xiàn)在準(zhǔn)確度提高、靈敏度提高、復(fù)雜度降低和成本降低；多樣性方向主要體現(xiàn)在工具箱的擴(kuò)展，包括各種輔助工具的開(kāi)發(fā)，大多是基于測(cè)序技術(shù)與數(shù)據(jù)算法的結(jié)合探索出的各種輔助軟件，如RNA（gRNA）設(shè)計(jì)與效率預(yù)測(cè)[8]、PAM位點(diǎn)設(shè)計(jì)、CRISPR鑒定、組裝、表征工具[9]等。同時(shí)，各種輔助工具的開(kāi)發(fā)也對(duì)編輯和遞送的研究起到了協(xié)同作用，輔助工具的功能也更加細(xì)致和智能。

（2）遞送。遞送技術(shù)在多樣性、適應(yīng)性、特異性方向均有細(xì)化，高效安全并多樣化地遞送特定的CRISPR組件也是研究的重點(diǎn)。其中，圍繞多樣性的工具箱擴(kuò)展研究較多，主要包括如何針對(duì)特定微生物組開(kāi)發(fā)更多的遞送策略和系統(tǒng)[10-11]。此外，在開(kāi)發(fā)更多工具箱的同時(shí)，大多研究都帶有適應(yīng)性的提高，包括但不限于遞送復(fù)雜度降低、多路復(fù)用率高、穩(wěn)定性提高等。與輔助工具不同的是，遞送技術(shù)目前還是主要基于一種或幾種微生物探討其在特定微生物群或者相似菌種中的使用，并未有具體的遞送系統(tǒng)可以適用于微生物組研究，因此如何開(kāi)發(fā)適用于特定微生物群的遞送系統(tǒng)或者策略是一個(gè)需要攻克的方向之一。

（3）編輯。編輯的主要研究方向均勻流向特異性、多樣性和適應(yīng)性。在編輯特異性的方向并沒(méi)有細(xì)致分化，并且除了在編輯方向的靶向特異性研究，在輔助系統(tǒng)、遞送方向均有特異性的探索。編輯的多樣性則集中在工具箱擴(kuò)展，學(xué)者們不僅探索出更多Cas蛋白，更有多樣化的編輯策略，使編輯工具箱數(shù)量迅速增加，越來(lái)越多微生物的基因編輯成為可能。在編輯的適應(yīng)性探索上，多篇研究探討了安全性的提高，為了克服CRISPR技術(shù)由單一Cas或多個(gè)Cas蛋白的復(fù)合體介導(dǎo)靶基因產(chǎn)生的DNA雙鏈斷裂問(wèn)題（Double Strand Break，DSB）[12]并降低其后續(xù)的修復(fù)難度，學(xué)者們開(kāi)發(fā)了不同的編輯策略，從而提高基因編輯的安全性[3,13]。

3 結(jié)論

微生物群基因編輯領(lǐng)域的技術(shù)演進(jìn)呈現(xiàn)細(xì)致化、多元化的特點(diǎn)，隨著下一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，自2018年起各種輔助工具的開(kāi)發(fā)帶動(dòng)了編輯和遞送的技術(shù)研究，使微生物群基因編輯技術(shù)進(jìn)入快速發(fā)展期。隨著研究的深入，具有不同特征不同類型的CRISPR系統(tǒng)相繼出現(xiàn)，研究應(yīng)用范圍也越加多元，如基因組編輯、基因激活和抑制、質(zhì)粒固化和入侵防御等。值得注意的是，目前編輯的對(duì)象仍集中在單一或者幾種菌株上，如何更高效地實(shí)現(xiàn)特定微生物群的基因編輯還需要科學(xué)家們的進(jìn)一步探索。綜合分析本研究納入的文獻(xiàn)，鮮有文章涉及修復(fù)技術(shù)的研究，也會(huì)是未來(lái)研究的重點(diǎn)方向之一。

微生物群基因編輯技術(shù)增長(zhǎng)最快的方向?yàn)楦鞣N輔助工具的研究，大數(shù)據(jù)產(chǎn)業(yè)和人工智能技術(shù)的發(fā)展功不可沒(méi)。以Skennerton開(kāi)發(fā)的Crass為例，其依托于深度學(xué)習(xí)算法，不需要先驗(yàn)知識(shí)就可以自動(dòng)預(yù)測(cè)并重建CRISPR基因組，為微生物群基因編輯技術(shù)帶來(lái)新的決策思路?；蚓庉嬜鳛橐粋€(gè)交叉性很強(qiáng)的技術(shù)目前已在各個(gè)環(huán)節(jié)直接或者間接得到了大數(shù)據(jù)產(chǎn)業(yè)和人工智能技術(shù)的助力，因此圍繞著人工智能、大數(shù)據(jù)與基因編輯技術(shù)的交匯研究將會(huì)給微生物群基因編輯技術(shù)演進(jìn)帶來(lái)新的發(fā)展節(jié)點(diǎn)。