林育婷
(英科新創(chuàng)(廈門)科技股份有限公司,福建廈門361000)
胱抑素C(Cystain C,Cys C)又名半胱氨酸蛋白酶抑制劑(Cysteine Proteinase Inhibitor,CPI),是一種非糖基化的堿性蛋白質(zhì),相對分子質(zhì)量較小,在體內(nèi)唯一的代謝途徑是通過腎小球濾過排泄。自1985年以來,胱抑素C已被視為檢測腎功能的良好標志物,可作為腎小球濾過功能的監(jiān)測指標,是一種理想的內(nèi)源性標志物,在一系列生理病理過程中也發(fā)揮著作用,有重要的臨床意義[1]。
胱抑素C的測定方法很多,目前使用較廣泛的是在全自動生化分析儀上使用的透射免疫比濁法[2]。透射免疫比濁法的檢驗原理是反應(yīng)生成不溶性的抗原-抗體復(fù)合物,并產(chǎn)生一定的濁度,所以濁度值直接反映樣品中抗原的含量。透射免疫比濁法雖然具有操作簡單、測定速度快、無污染、自動化的優(yōu)勢,但在檢測高濃度標本時,會因抗原過量產(chǎn)生鉤狀效應(yīng)使反應(yīng)信號減弱,從而導(dǎo)致檢測結(jié)果偏低[3]。不同品牌的檢測儀器,因信號量程、測定程序、數(shù)據(jù)分析模式等的不同,發(fā)生抗原過量鉤狀效應(yīng)的結(jié)果可能不同。本文對研制的胱抑素C試劑在兩種全自動生化分析儀上的鉤狀效應(yīng)結(jié)果進行比較,分析其對臨床結(jié)果造成偏差的風(fēng)險,并設(shè)法減小這種風(fēng)險。
抗原,北京百川飛虹生物科技有限公司;抗體,購自DAKO公司;胱抑素C測定試劑,英科新創(chuàng)(廈門)科技股份有限公司;胱抑素C基礎(chǔ)緩沖液,英科新創(chuàng)(廈門)科技股份有限公司。
Hitachi 7180全自動生化分析儀,吸光度測定量程-3.2~3.2,日本日立公司;Beckman Coulter AU680全自動生化分析儀,吸光度測定量程-2.5~2.5,美國貝克曼庫爾特公司。
1.3.1 測定程序
Hitachi 7180全自動生化分析儀測定程序:測定波長546 nm,測光點18~34,測定模式為兩點終點法,定標方式為6點定標(Logit-log(4P)擬合)。
Beckman Coulter AU680全自動生化分析儀測定程序:測定波長540 nm,測光點14~27,測定模式為終點法,定標方式為6點定標(Spline擬合)。
1.3.2 不同濃度梯度的胱抑素C抗原溶液的制備
將胱抑素C抗原用胱抑素C基礎(chǔ)緩沖液復(fù)溶,配制成理論濃度為0 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、4.0 mg/L、6.0 mg/L、8.0 mg/L、10.0 mg/L、12.0 mg/L、14.0 mg/L、16.0 mg/L、18.0 mg/L、20.0 mg/L、25.0 mg/L、30.0 mg/L、35.0 mg/L、40.0 mg/L、45.0 mg/L及50.0 mg/L的19個濃度梯度。
1.3.3 繪制劑量-效應(yīng)曲線
將上述19個濃度的胱抑素C抗原溶液分別在Hitachi 7180和Beckman Coulter AU680全自動生化分析儀上進行檢測,每個樣品重復(fù)檢測3次,以3次檢測結(jié)果的反應(yīng)吸光度均值為縱坐標,胱抑素C抗原溶液的理論濃度為橫坐標,用Excel表格做出相應(yīng)的散點圖和趨勢線,繪制成劑量-效應(yīng)曲線。根據(jù)曲線,對胱抑素C在兩種儀器上的鉤狀效應(yīng)進行比較分析。
1.3.4 鉤狀效應(yīng)差異的改善方法
分別采用不同濃度的抗體用量(75 mg/L、100 mg/L、125 mg/L和150 mg/L)配制胱抑素C試劑,按上述方法進行試驗,根據(jù)結(jié)果判斷是否能解決不同檢測儀器間鉤狀效應(yīng)差異的問題。
從圖1、圖2可以看出,不同抗體用量配制的胱抑素C試劑,在Hitachi 7180和Beckman Coulter AU680全自動生化分析儀上測定0~50 mg/L的不同濃度梯度的抗原溶液,均存在明顯的鉤狀效應(yīng)。樣品的反應(yīng)吸光度起初隨著抗原濃度的升高而升高,在到達平衡點濃度之后反應(yīng)吸光度隨著抗原濃度的升高反而減小。如圖1所示,當試劑的抗體用量分別為75 mg/L、100 mg/L、125 mg/L和 150 mg/L時, 在7180分析儀上測定胱抑素C抗原,其抗原-抗體結(jié)合達到平衡點時的抗原濃度(即HOOK濃度)分別約為 12 mg/L、14 mg/L、18 mg/L和 18 mg/L,超過以上濃度后劑量-效應(yīng)曲線呈下降趨勢。如圖2所示,當試劑的抗體用量分別為75 mg/L、100 mg/L、125 mg/L和150 mg/L時,在AU680分析儀上測定胱抑素C抗原,其抗原-抗體結(jié)合達到平衡點時的HOOK濃度分別約為10 mg/L、12 mg/L、12 mg/L和10 mg/L,超過以上濃度后劑量-效應(yīng)曲線呈下降趨勢。
圖1 不同抗體用量配制的胱抑素C試劑在日立7180上的劑量-效應(yīng)曲線
圖2 不同抗體用量配制的胱抑素C試劑在AU680上的劑量-效應(yīng)曲線
不同抗體用量配制的胱抑素C在Hitachi 7180和Beckman Coulter AU680全自動生化分析儀上雖然有類似的鉤狀效應(yīng)趨勢,但出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)的HOOK濃度有所區(qū)別:在7180分析儀上,隨著試劑抗體濃度的增加,出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)的HOOK濃度也有較明顯增加;在AU680分析儀上,隨著試劑抗體濃度的增加,出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)的HOOK濃度增加不明顯,且相同抗體用量配制的胱抑素C在AU680分析儀上的HOOK濃度均比在7180分析儀上低。此種情況的發(fā)生,可能為AU680儀器的測定量程較?。ㄗ畲鬁y定量程為2.5),當試劑抗體濃度大于125 mg/L時,反應(yīng)吸光度已接近儀器的最大量程,所以隨著抗體濃度的增加,儀器測定量程的限制可能影響了測定結(jié)果的準確性(見表1)。此外,儀器的加樣時間點、測光點、數(shù)據(jù)擬合方式不同,也可能是造成此種現(xiàn)象的原因[4]。
表1 不同抗體用量配制的胱抑素C試劑出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)的HOOK濃度和反應(yīng)吸光度
有研究表明,試劑中抗體濃度越高,所能準確測量到的抗原濃度也越高,試劑安全報告范圍也越寬,鉤狀效應(yīng)出現(xiàn)的概率會大大減小[5]。但試劑在臨床應(yīng)用上,需要適配多種型號的儀器,儀器的測量差異也應(yīng)是試劑研發(fā)過程中需要綜合考慮的。本產(chǎn)品胱抑素C試劑的線性范圍要求為0~8 mg/L,健康成人血清胱抑素C的參考范圍為0.59~1.03 mg/L,臨床患者血清胱抑素C濃度在12 mg/L以上的也較少,因此綜合考慮試劑的質(zhì)量要求、儀器的測量差異以及臨床檢測的需求,選擇本試劑的抗體濃度為100 mg/L。選擇此抗體濃度,在7180分析儀中的HOOK濃度約為14 mg/L,在AU680分析儀上的HOOK濃度約為12 mg/L,二者均超過試劑線性范圍要求的上限,對于在線性范圍之內(nèi)的樣本,均能保證檢測結(jié)果的準確性,也能覆蓋臨床常見的樣本濃度。
鉤狀效應(yīng)是免疫比濁試劑不可避免的問題,本試劑在研發(fā)過程中,在優(yōu)化配方的同時,也綜合考慮了儀器的測量差異,根據(jù)研究結(jié)果確定了抗體的最佳用量。同時,通過此研究,對所研制的試劑有了更準確的HOOK效應(yīng)數(shù)據(jù),以此指導(dǎo)臨床檢測過程中對抗原超限標本進行稀釋處理,避免在檢測過程中由于檢測儀器的不同而造成超高值標本檢測結(jié)果的不準確。