趙海菲　王天婭　余坤江　晏偉　王顯亞　田恩堂

摘要：MYB轉錄因子是植物重要的調控因子，可與bHLH和WD40類轉錄因子形成二元MYB-bHLH或三元MBW復合體，對植物花青素合成與積累起著至關重要的作用。本文綜述了花青素合成途徑、MYB轉錄因子類型、MYB轉錄因子正向及負向調控、MYB轉錄因子調控機制等方面的研究進展，并對相關后續(xù)研究進行了探討與展望。本綜述可為花青素生物合成機制研究提供參考。

關鍵詞：MYB;轉錄因子;花青素;生物合成

中圖分類號：S188文獻標識碼：A

文章編號：1008-0457（2022）03-0049-08國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2022.03.007

花青素（Anthocyanin）是絕大多數植物自身合成的水溶性天然色素，能使其葉、花、莖、果實和種皮等呈現出豐富的色彩，具有重要的商業(yè)價值?；ㄇ嗨卦谥参锷L發(fā)育中行使多種重要的生理功能：作為媒介吸引昆蟲傳粉和散播種子[1];在營養(yǎng)組織中，病原體侵襲、強光、低溫和磷酸鹽缺乏等可引起花青素的聚集，可能與相關的防御機制有關[2];花青素可抵御紫外輻射，發(fā)揮UV屏障的功能，保護植物DNA不受破壞、維持細胞分化和其它生命過程正常進行 [3];作為有效的抗氧化劑，花青素能有效清除自由基和活性氧（ROS）[4-6];花青素也可在保護人體健康，預防心血管疾病、抗癌和抵抗其它一些慢性疾病中發(fā)揮重要作用[7-9];此外，富含花青素的食品、化妝品及醫(yī)療保健品等擁有廣闊的消費市場[10]。因此，全面了解花青素生物合成及調控對于開發(fā)富含花青素相關產品具有重要意義。

大多數植物的花、葉、莖等組織器官的顏色極大程度上受花青素生物合成途徑的遺傳與調控機制的影響。在植物中，花青素合成結構基因和調節(jié)基因共同調控完成花青素的生物合成途徑。該調控主要作用于結構基因的轉錄過程中，且由MYB、bHLH和WD40等多種轉錄因子的協同完成，其中以MYB轉錄因子研究的最多也最為重要。

1花青素合成途徑

植物花青素合成途徑隸屬于類黃酮途徑的一條重要分支，主要在細胞質和內質網上合成花青素再運輸到液泡中固定和儲存。結構基因編碼了一系列與花青素緊密相關的生物合成酶，通過各類轉錄因子的催化作用合成花青素[11-13]。植物中花青素生物合成途徑是黃酮類代謝途徑中的一個分支，它的前體是從苯丙氨酸開始。苯丙氨酸途徑包含三個主要基因，分別是PAL（苯丙氨酸氨解酶）、C4H（肉桂酸酯-4-羥化酶）和4CL（4-香豆酸酯：CoA連接酶）。植物花青素生物合成途徑可分為兩種類型的相關結構基因：早期生物合成基因（EBGs）和晚期生物合成基因（LBGs）[14]。EBG包括CHS（查爾酮合酶）、CHI（查爾酮異構酶）、F3H（黃酮3-羥化酶）、F3′H（類黃酮3′-羥化酶）和FLS（類黃酮合成酶），協同導致類黃酮和其他類黃酮化合物的生成;而LBG則包括DFR（二氫類黃酮4-還原酶）、ANS（原花青素合成酶）和UFGT（UDP-葡萄糖：類黃酮3-O-葡萄糖基轉移酶），最終導致花青素的生成[15-16]。以模式植物—擬南芥花青素生物合成代謝途徑為例[13]，第I階段，以苯丙氨酸為直接前體，經PAL、C4H和4CL的三步酶促反應作用下合成4-香豆酰CoA;第II階段是4-香豆酰CoA通過CHS、CHI、F3H和F3′H基因活性的調控產生二氫黃酮醇的過程;第III階段是二氫黃酮醇在DFR、ANS、LDOX、MT、GT和AT的催化作用下生成花青素的過程。上述結構基因的表達在轉錄水平上均受多種轉錄因子調控。

2MYB轉錄因子

植物中花青素生物合成代謝途徑主要受到由R2R3-MYB、bHLH和WD40蛋白組成的MBW轉錄復合物的控制[12，17]。其中，MYB轉錄因子是MBW復合物的主要決定性調節(jié)因子[18-19]。植物界的MYB類轉錄因子中數量最多的是R2R3-MYB[20]。擬南芥共發(fā)現300多個MYB轉錄因子，其中有137個屬于R2R3-MYB[20]。R2R3-MYB轉錄因子通過N端與靶序列的DNA結合域特異性結合實現在植物花青素生物合成的轉錄調控過程中對靶基因的精確調控。此外，MYB轉錄因子的C端存在與DNA結合的轉錄激活或抑制功能域[21]，例如薔薇科植物與花青素生物合成相關的MYB蛋白的C端包含一段特定的基序[22]。根據它們的C末端的氨基酸基序，Stracke等[23]將它們分為22個亞組。其中參與黃酮類化合物生物合成的MYB蛋白屬于1～7個亞組，可為相同亞組未知蛋白的功能預測提供參考?？梢酝ㄟ^系統進化分析確定在植物花青素合成過程中起激活或抑制作用的MYB類型[24]。

在擬南芥全部組織中，Stracke等[25]發(fā)現AtMYB11、AtMYB12和AtMYB111對參與花青素生物合成的EBGs基因進行調控。AtMYB75、AtMYB90、AtMYB113和AtMYB114轉錄因子基因對參與花青素生物合成的LBGs基因進行調控[26]。此外，擬南芥的R2R3-MYB家族基因還檢測到PAP1、PAP2、MYB113和MYB114[26-27]等轉錄因子，它們的時間和空間表達模式決定了花青素的模式和定位。Wang等[28-29]在蘋果中克隆了MdMYB12、MdMYB22和MdMYBPA1基因，并通過蘋果愈傷組織過表達和擬南芥突變體異位表達確認它們在花青素生物合成途徑中的作用，為選育高含量花青素的優(yōu)質蘋果提供了科學依據。Xu等[30]和Xu等[31]利用異位表達和敲除試驗從紫色胡蘿卜品種中分離并驗證了DcMYB6和DcMYB7（R2R3-MYB類轉錄因子），并證實它們是決定胡蘿卜中花青素合成的關鍵基因。

3MYB轉錄因子轉錄調控

3.1MYB正調控因子研究

在類黃酮生物合成代謝過程中生成了黃酮醇，花青素和原花青素等多種化合物。研究表明，這些類黃酮途徑受到MYB轉錄因子的微調和嚴格控制[12，32]。在玉米花青素生物合成過程中，R和C1兩類轉錄因子均能正調控其相關合成酶基因的表達[33]。深入研究表明，在水稻中轉入玉米R和C1同時進行過量表達后，水稻中CHS基因的轉錄效率相應得到迅速提升，由此可知其極有可能通過對CHS基因的表達量進行上調，來促進植物組織中花青素的生物合成[34]。另外，研究發(fā)現通過過表達的方式，擬南芥PAP1-D轉錄因子對花青素合成途徑中多個基因的表達量和表達強度進行上調，能達到明顯增加花青素的積累量的效果[27]。其他研究也發(fā)現，隸屬于MYB家族的PAP1基因過表達同樣能夠提高擬南芥組織中的花青素含量[35]。劉軼等[36]將過表達AtPAP1基因轉入野生型煙草，發(fā)現花青素調控基因AtPAP1基因通過異源過量表達的方式可達到顯著促進轉基因煙草植株花青素生物合成的目的，結果導致轉基因煙草的葉片、莖段和花器官等呈現出不同程度的紫紅色。大量研究也表明，AtPAP1（AtMYB75）及其同源物可通過激活結構基因的表達來正調節(jié)花青素的產生[37-38]。調控基因AtMYB75、AtMYB90、AtMYB113和AtMYB114均屬于擬南芥MYB家族的第6亞組，通過在轉錄過程中對結構基因的表達強度進行上調，以促進植物組織中的花青素含量的積累[39]。

對被子植物不同物種中MYB基因家族第6亞組的研究顯示，它們通常通過表達的方式以及改變激活強度的程度來調控花青素積累量[1，40]。Su等[41]研究發(fā)現MYB轉錄因子的高水平表達導致萵苣葉中花青素的高水平積累。在花椰菜、橘子和水稻中也報道了類似的結果[42-44]。在蘋果MYB轉錄因子的研究中，MdMYB9在其原花青素合成途徑中發(fā)揮正向調控功能，在楊樹中PtMYB134轉錄作用與MdMYB9正調控因子的功能類同，均能對花青生成途徑的還原酶（ANR）啟動子產生激活效應，從而對蘋果和楊樹中花青素含量變化進行正向調控[45]。R2R3-MYB轉錄因子中第4家族的 Rh-MYBs4-1基因和第6家族RhMYBs6-1基因，二者協同調控可增加月季中花青素的合成[46]。在黃酮類化合物的生物合成過程中，激活型轉錄因子如AtMYB46和AtMYB83具有正調控功能，在山楂中克隆的MYB46與這兩類轉錄因子同源關系較近，其具有高度保守的R2R3功能域，由此推測山楂MYB46可能具有相似的正調控功能特征[47]。在小麥花青素合成途徑中，CHS、DFR、LDOX和UF3GT基因的啟動子與正調控因子TaPL1結合共同促進花青素含量的積累[48]。紫粒小麥高原115中MYB轉錄因子TaMYB3-4Ata被克隆，并正式與花青素積累有關[49]。在高粱中，MYB基因、yellow seed 1基因缺失可導致其種子呈現黃色[50]。Matus等[51]發(fā)現在葡萄花青素合成途徑中，R2R3-MYB轉錄因子VvMYBA1、VvMYBA6和VvMYBA7基因，均可通過對關鍵酶基因3AT和UFGT產生激活效應，正向調控其花青素生物合成。

3.2MYB負調控因子研究

MYB轉錄因子除了花青素生物合成的激活因子外，還發(fā)現兩種轉錄抑制花青素生成的MYB[52]：R2R3-MYB和R3-MYB。

R2R3-MYB可減少植物花、莖、葉等組織器官中花青素生物合成與積累，該類轉錄因子先后在金魚草（AmMYB30）[53]、矮牽牛（PhMYB27）[52]、草莓（FaMYB1和FcMYB1）[54-55]、葡萄（VvMYBC2-L1/3和VvMYB4-like）[56-57]、楊樹（PtrMYB182和PtrMYB 57）[58-59]、桃（PpMYB17-20）[60]、蘋果（MdMYB16和MdMYB15L）[30，61]和中國水仙（NtMYB2）[62]等植物中被檢測到。分析發(fā)現這些轉錄抑制因子都屬于R2R3-MYB的亞組4，其在煙草中的異位表達造成花青素生物合成受到阻抑而導致花朵顏色的喪失[53-54，56-57]。同樣，在楊樹中PtrMYB57的過表達抑制了花青素含量的積累。相比之下，CRISPR/Cas9系統產生的Ptrmyb57突變體中花青素含量增加[59]。因此，遺傳、生化和細胞生物學證據表明，這些抑制因子是多維調節(jié)網絡的一部分，可負調節(jié)與環(huán)境刺激或發(fā)育過程相關的花青素生物合成[63]。

除了R2R3-MYB轉錄因子能抑制植物花青素合成積累外， R3-MYB轉錄因子也是在植物花青素生物合成過程中表現出負調控功能的轉錄抑制因子。在擬南芥花青素合成中在AtMYBL2和AtCPC負調控因子作用下，導致擬南芥體內花青素的積累量減少[13，64];MYBL2通過與R2R3-MYBs競爭來與mbw復合物的bHLH組分相互用來負調控mbw復合物[64]。隨后，矮牽牛中PhMYBx、龍膽中GtMYB1R1和GtMYB1R9、楊樹中PtrRML1以及番茄中SlMYBATV和SlTRYs也被確定為負調控因子[52，65-67]。最近有報道稱，一種新型的R3-MYB轉錄抑制因子IlMYBL1參與了Iochroma中花朵顏色的喪失[68]。與之相比，Song等[69]認為紫甘藍變種是由于啟動子的替換或基因的缺失導致BoMYBL2-1表達的缺失引起的。大量證據揭示，R3-MYB與R2R3-MYB兩類抑制因子對花青素的生物合成的負調節(jié)作用呈平行關系。

3.3MYB轉錄因子的調控途徑機制

3.3.1MYB激活因子和抑制因子按層次結構運行花青素調節(jié)網絡是分層組織的[52]。正負MYB調節(jié)子之間表達水平的相互控制形成一個復雜的調節(jié)環(huán)，轉錄調節(jié)環(huán)由AtMYBL2、AtTT8和PAP1組成，三者調節(jié)擬南芥中的花青素生物合成，PAP1激活AtTT8的正調節(jié)劑，AtTT8是AtMYBL2的激活因子，而AtMYBL2則負調節(jié)AtTT8的表達[64]，以調控花青素的生物合成。之前的研究，提出了MYB激活因子和抑制因子之間的三個作用水平：激活因子誘導抑制因子;抑制因子抑制抑制因子;抑制因子阻遏激活因子[54]。Albert等[52]在矮牽牛葉片中發(fā)現過表達花青素激活因子DPL和PHZ后，誘導了PhMYB27和PhMYBx抑制因子。同樣，在過表達PtrMYB134激活因子的毛狀根中發(fā)現了PtrMYB182抑制因子的誘導[58]。值得注意的是，MYB抑制因子的作用會受到自動抑制或MYB抑制因子其他成員的抑制。PhMYBx和PhMYB27本身被鑒定為矮牽牛中PhMYB27的靶基因，表明它們都被MBW復合物激活和抑制[52]。在VvMYBC2-L3轉基因葡萄的毛狀根中也觀察到VvMYBC2-L1的下調[56]。這種作用水平是有待闡明的間接調節(jié)或直接抑制。因此，MYB抑制因子似乎被MBW復合物轉錄激活，并同時在反饋機制自身的阻遏下被激活[70]。關于抑制子在激活子上的轉錄層次，Matsui等[64]發(fā)現擬南芥AtMYBL2除對花青素生物合成基因進行負調控之外還抑制AtTT8的表達。抑制作用還可以通過MYB激活因子的下調來發(fā)揮作用[71]。MYB抑制因子可能間接起到抑制編碼bHLH和MYB激活子的基因表達的作用，從而破壞MBW轉錄激活復合物。

3.3.2花青素調節(jié)的綜合模型

近年來，花青素生物合成的調控機制等方面的研究在模式植物和園藝作物中取得突破性進展。以是否促進植物花青素含量積累為區(qū)分依據，可將花青素合成途徑的轉錄調控作用分為正調控和負調控兩類。MYB和bHLH兩種轉錄因子相互結合組成的MYB-bHLH的復合體或MYB、bHLH和WD40三種轉錄因子形成的MBW復合體，通過與花青素合成相關的結構基因特定部位相結合，同時改變結構基因的活性，達到促進花青素合成的為正調控過程，起到抑制或減少花青素積累的是負調控過程。Albert等[52]建立了一個模型來描述MBW復合物的激活因子和阻遏因子對花青素生物合成的作用。在非誘導條件下，R2R3-MYB激活因子不表達，MYB抑制因子高度表達，bHLH1和WDR則組成型表達。MYB抑制因子可以直接抑制花青素生物合成基因，或通過結合游離的bHLHs來破壞MBW復合物的形成，從而達到抑制花青素的生物合成的目的（圖1-a）。

在誘導條件下，通過激活R2R3-MYB激活因子的表達花青素的生物合成開始。R2R3-MYB激活因子與bHLH1（PhJAF13/AtEGL3同源物）和WDR相互作用，形成MBW激活復合物，可激活bHLH2的表達（PhAN1/AtTT8同源物）。然后，bHLH2能夠與R2R3-MYB激活因子和WDR形成核心MBW激活復合物，激活花青素生物合成基因（例如DFR）的表達，進而促進花青素含量的積累。核心MBW激活復合物還激活bHLH2的表達以提供增強作用，而R2R3-MYB抑制因子和R3-MYB抑制因子的表達則提供反饋抑制作用（圖1-b）。

4總結與展望

激活和抑制兩類因子協同表達使其花青素生物合成在植物生長發(fā)育和抵抗生理脅迫過程中發(fā)揮重要調控作用。在小麥作物中DFR、UF3GT、LDOX和CHS基因的啟動子與TaPL1因子相結合，從而對花青素合成進行正向調控;而TaMyb1D因子在花青素合成過程中發(fā)揮負調控作用，同時增強了植物的抗旱能力以及抵御氧化等環(huán)境脅迫[48]。在楊樹的瞬時轉錄激活試驗中，PtMYB134作為類黃酮合成通路酶基因啟動子的激活因子，而PtMYB165和PtMYB194則通過抑制PtMYB134的表達以達到降低花青素含量的目的，楊樹中的PtMYB134、PtMYB165和PtMYB194三者過表達均能大幅度減少花青素和原花青素等化合物的生成量[58]。而研究表明桃子中的PpMYB10.1與PpMYBPA1都對PpMYB18蛋白的轉錄過程起到激活作用，使抑制因子PpMYB18與MYB激活因子形成相互競爭，并與bHLH轉錄因子bHLH3和bHLH33相結合，激活花青素合成調控途徑的反饋調節(jié)環(huán)，從而使花青素和原花青素的合成量達到平衡狀態(tài)[72]。在番茄中，R3-MYB抑制因子SlMYBATV被核心MBW激活復合物靶向，同時其自身也被自動調節(jié)以提供反饋抑制作用[70]。因此，結合了MBW活化復合物和多個負調節(jié)劑的拮抗機制可以促進對花青素生物合成的微調，并保護植物免受過量花青素的積累。

綜上所述，導致花青素生物合成的任何基因的功能喪失和突變都有可能減弱植物中花青素含量的積累。例如，研究發(fā)現ANS基因突變阻止了無色類黃酮花青素向下游有色產物的轉化[41]。此外，功能缺失的等位基因可能來自不同類型的突變，例如引起移碼的插入缺失（InDel）[73]。因此，在自然界中可能會經常發(fā)生減弱花青素含量積累的突變。相反，花青素積累的突變相對較少。此外，如果功能獲得突變影響途徑中的限速步驟，則單個基因中的功能獲得突變將會影響特定生物合成途徑最終產物的積累（例如花青素生物合成途徑）。而 R2R3-MYB轉錄因子可以調節(jié)花青素生物合成的整個途徑，其功能獲得突變比編碼生物合成酶的基因突變更可能普遍地促進最終產物的高水平積累。

（責任編輯：段麗麗）

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Review of MYB Transcription Factors Regulating Anthocyanin Biosynthesis

Zhao Haifei，Wang Tianya，Yu Kunjiang，Yan Wei，Wang Xianya，Tian Entang

（Agronomic college of Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China）

Abstract：MYB transcription factor is one important regulatory factor，which could combine with bHLH and WD40 to form duality complex and ternary complexes.The complexes could improve the synthesis and accumulation of anthocyanin.The present study reviewed the pathways of anthocyanin synthesis，the types of MYB transcription factors，the progress of the positive and negative of MYB synthesis and its mechanisms.In addition，we discussed the current research progress and looked forward to its future researches.The review could provide reference information for studying the mechanisms of anthocyanin synthesis.

Keywords：MYB;transcription factors;anthocyanin;biosynthesis