可降解生物塑料的降解微生物篩選、鑒定及降解性能

馮 娟，楊佳玥，楊文婷，楊子琳，李媛媛

（臺(tái)州科技職業(yè)學(xué)院 農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院，浙江 臺(tái)州 318020）

以聚乙烯、聚丙烯為主的傳統(tǒng)塑料由于易制造、成本低、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、溫度耐受范圍廣、防水性好等性能，廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。但其在自然環(huán)境中難以分解，給生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重的破壞，“白色污染”已成為全球性的環(huán)境問題。生物可降解塑料特有的生物降解特性對于生態(tài)環(huán)境保護(hù)、減少“白色污染”等方面具有十分重大的現(xiàn)實(shí)意義。其中聚乳酸 (Poly lactic acid，PLA)、聚丁二酸丁二酯 (Poly butylene succinate，PBS)、聚己內(nèi)酯(Poly ε-caprolactone，PCL)化學(xué)合成類生物可降解塑料在自然條件下，可以徹底降解成CO2和H2O，目前需求量已經(jīng)出現(xiàn)井噴現(xiàn)象。

環(huán)境因素如pH、溫度、濕度、營養(yǎng)等因素的不同對微生物種群和不同微生物的活性具有不同的影響，不同環(huán)境的微生物對可降解生物塑料的降解具有不同的作用。雖然上述材料在自然環(huán)境下可徹底降解，但在自然環(huán)境中降解速率比較緩慢，因此降解周期與效率急需深入的研究。一旦有簡單、安全且高效的降解技術(shù)產(chǎn)生，勢必更進(jìn)一步推廣可降解塑料的應(yīng)用，減少白色污染對環(huán)境的破壞。如何篩選有用的降解微生物和提高其降解速率成為了當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。

本研究以嚙食60 d聚乳酸的黃粉蟲幼蟲為實(shí)驗(yàn)材料，以PLA為唯一碳源固體培養(yǎng)基篩選具有降解可降解塑料能力的微生物，并對其進(jìn)行菌株形態(tài)學(xué)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)、分子生物學(xué)分析及降解性能測定，為進(jìn)一步篩選和優(yōu)化高效生物塑料降解菌的篩選及研究提供了良好的理論參考價(jià)值及豐富了降解生物塑料的菌質(zhì)資源。

1 材料與儀器

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來源

臺(tái)州椒江花鳥市場購買的黃粉蟲幼蟲；100目PLA粉末、350目PLA粉末、100目PCL粉末、100目PBS粉末皆購于東莞市精科高分子材料有限公司。

1.1.2 主要材料和試劑

葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、檸檬酸鹽、氫氧化鈉等試劑購置于國藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司；PDA瓊脂培養(yǎng)基、高氏培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、購于海博生物公司；

1.1.3 培養(yǎng)基及滅菌條件

（1）PLA固體培養(yǎng)基：無機(jī)鹽1 mL，純化水1000 mL，瓊脂20g，pH調(diào)至7，滅菌后，待溫度降至45℃左右，加入已滅菌的PLA粉末20g，搖勻，倒平板。PCL固體培養(yǎng)基、PBS固體培養(yǎng)基皆按照此方法進(jìn)行配置；（2）PLA發(fā)酵培養(yǎng)基：無機(jī)鹽1 ml，純化水1000 ml，pH調(diào)至7，將、PCL、PBS用75%酒精浸泡20 min后，無菌水洗滌3次，置于超凈臺(tái)中，吹干12 h加入上述液體中。上述培養(yǎng)基皆放入121 ℃滅菌15 min。

2 實(shí)驗(yàn)步驟

2.1 黃粉蟲飼養(yǎng)

黃粉蟲饑餓處理 3 d，選取形態(tài)大小均勻 200 條，于 25±2℃的環(huán)境下飼養(yǎng)，平均分兩組，每組各 100只。一組喂養(yǎng)麥麩(對照組)，另外組只喂養(yǎng)350目聚乳酸粉末，其他條件一致，喂養(yǎng)時(shí)間持續(xù)60 d。

2.2 微生物培養(yǎng)方法

取 PLA 塑料粉末飼養(yǎng)60 d后的黃粉蟲幼蟲，在超凈工作臺(tái)上將蟲體浸泡在75%酒精5 min，無菌蒸餾水沖洗3次，用無菌解剖器具抽取出腸道，放入無菌研缽中，加0.5%無菌NaCl溶液，用研磨棒快速研磨至無顆粒制成黃粉蟲腸道微生物提取液，取100μL涂布于篩選培養(yǎng)基上，進(jìn)行單菌落培養(yǎng)基篩選，3代后為純種。

2.3 不同營養(yǎng)條件下降解菌生長情況

將篩選菌分別接種在PLA固體培養(yǎng)基、PCL固體培養(yǎng)基、PBS固體培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、干酪素培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂肉湯、牛肉膏蛋白胨、高氏一號、完全培養(yǎng)基、三乙酸甘油酯固體培養(yǎng)基10種體培養(yǎng)基，置于30℃培養(yǎng)箱進(jìn)行觀察記錄。

2.4 分子鑒定

將YJY-1培養(yǎng)在PDA平板，采用真菌提取試劑盒提取DNA，用鑒定通用引物(ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG 和 ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC) 擴(kuò)增分離菌ITS序列，送至上海生物工程有限公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果序列通過NCBI上進(jìn)行BLAST比對，下載相似度較高的參考序列后使用MEGA7軟件內(nèi)置的Clustalx程序進(jìn)行序列的多重比對，使用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，所選模型為Kimura 2-parameter model，Bootstrap重復(fù)次數(shù)設(shè)置為1000次。

2.5 降解菌對不同生物降解塑料的降解率

將PLA 350目粉末、100目PLA 粉末、100目PCL粉末、100目PBS粉末及PLA塑料薄膜用75%乙醇浸泡20 min，無菌水洗滌3次，吹干后，按照每2.0 g每100 ml，接入除無機(jī)鹽外無其他添加物的發(fā)酵液內(nèi)進(jìn)行搖瓶實(shí)驗(yàn)。另外，PLA塑料薄膜的發(fā)酵培養(yǎng)過程中，分別添加2%蛋白胨、2%葡萄糖、各1%的蛋白胨和葡萄糖、2% SDS、2%干酪素、2%明膠的物質(zhì)。將培養(yǎng)48 h的種子液以2%的接種量接入發(fā)酵液中，30℃，轉(zhuǎn)速為160 r/min，設(shè)置不添加菌液的發(fā)酵條件為空白對照，3個(gè)平行，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)12 d后，收集PLA膜、超聲波清洗、65 ℃烘干10 h后準(zhǔn)確稱重，計(jì)為M1，計(jì)算每瓶發(fā)酵液降解率。

可降解塑料降解率=(2.0-M1)/2.0×100%

3 結(jié)果與分析

3.1 菌落形態(tài)觀察結(jié)果與分析

經(jīng)過分離純化之后，篩選到的一株能在PLA為唯一營養(yǎng)的平板上生長的菌編號為YJY-1。將YJY-1菌分別接種在如圖1所列的不同培養(yǎng)基中，菌落生長形態(tài)如圖1所示，菌落生長情況如表1所示。

表1 YJY-1菌在不同培養(yǎng)基形成的菌落形態(tài)

圖1 降解菌YJY-1在不同的固體培養(yǎng)基上的菌落特征

A：PLA無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基；B：PCL無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基；C：PBS無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上；D：PDA固體培養(yǎng)基；E：干酪素固體培養(yǎng)基；F：營養(yǎng)瓊脂肉湯；G：牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基；H：高氏一號固體培養(yǎng)基；I：完全固體培養(yǎng)基；J：三乙酸甘油酯固體培養(yǎng)基；

降解菌YJY-1在上述各種培養(yǎng)基培養(yǎng)情況中，完全培養(yǎng)基（圖1 G）生長最旺盛，菌落生長速度最快，其次為PDA，主要這些培養(yǎng)基所包含的營養(yǎng)物質(zhì)比較豐富；在PLA、PCL、PBS為唯一的碳源的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，其碳源難降解，營養(yǎng)較缺乏導(dǎo)致其生長速率較慢。但在這三種培養(yǎng)基上能夠生長，說明降解菌YJY-1能夠降解一定的PLA、PCL、PBS塑料，并利用其降解產(chǎn)物合成自身生長；結(jié)合其在干酪素與三乙酸甘油酯培養(yǎng)基上生長情況，得出該菌通過蛋白酶促降解機(jī)理對這些塑料進(jìn)行降解，并將其轉(zhuǎn)化成能被自己所消耗的營養(yǎng)物質(zhì)，以滿足其生長所需。

3.2 分子鑒定結(jié)果

圖2 菌株 PSI-1 基于ITS基因序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

Figure 3 Phylogenetic tree of strain PSI-1 based on ITS gene sequence

將菌株YJY-1的ITS序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對，下載相似度較高的參考序列后使用MEGA7軟件內(nèi)置的ClustalW程序進(jìn)行序列的多重比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹：使用Neighbor-Joining法，所選模型為Kimura 2-parameter model，Bootstrap重復(fù)次數(shù)設(shè)置為1000次。系統(tǒng)發(fā)育樹基于ITS序列，以菌株NR_121555.1 Toxicocladosporium posoqueriae CPC 19305為外群，將菌株YJY-1與Cladosporium屬部分物種一起來重建它們的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，從而鑒定分類地位。從系統(tǒng)發(fā)育樹上可以看出，菌株YJY-1與菌 株 MN950992.1 Cladosporium tenuissimum RL6聚在一個(gè)進(jìn)化發(fā)育分支上，且自展支持率為95，兩者序列相似性達(dá)到了99%以上，并與Cladosporium屬其他物種處于不同的分支，從分類上屬于一個(gè)屬但屬于不同的種。結(jié)合其形狀特征，菌株YJY-1為Cladosporium屬的Cladosporium tenuissimum。

3.3 降解性能鑒定結(jié)果與分析

3.3.1 降解菌對PLA塑料薄膜的降解

降解菌YJY-1在只有塑料薄膜（正常發(fā)酵）的條件下，培養(yǎng)16 d，其降解率為9.7%，在不同的營養(yǎng)條件下對PLA塑料薄膜的降解率和干菌量皆不同，如圖3所示。其中在2%的葡萄糖添加下，其降解率最高，達(dá)12.7%，干菌量達(dá)到4.092 g/L，葡萄糖作為易利用碳源，能夠促進(jìn)菌量，導(dǎo)致其降解率提高；其次為2%的蛋白胨添加，降解率為10.4%，其干菌量為1.7g/L；2%的干酪素的添加，降解率9.3%，干菌量為1.38 g/L。1%葡萄糖與1%蛋白胨添加下，降解率為9.9%，菌量為1.25g/L；蛋白胨與干酪素都作為高蛋白營養(yǎng)添加物，對該菌的降解率及菌量的影響水平差不多；在2%SDS條件下，PLA降解率降低為4.64%，菌量也降低到0.29 g/L，表明SDS的添加對菌量及降解率都有抑制作用；在2%明膠的營養(yǎng)條件下，降解率為5.7%，菌量為0.61 g/L，相比正常發(fā)酵，其菌量略高，但其降解率下降一半左右，表明明膠對此菌的降解率有抑制作用。

圖3 降解菌YJY-1在不同營養(yǎng)條件下對PLA塑料薄膜的降解率

3.3.2 降解菌對不同可降解塑料降解

將PLA 350目粉末、100目PLA 粉末、100目PCL粉末、100目PBS粉末，PLA塑料薄膜各粉末按照每2.0 g/100ml，2%的接種量，經(jīng)過16d的發(fā)酵培養(yǎng)，如圖4，其中100目PBS粉末降解率最高，可達(dá)39.8%；其次為100目PLA粉末降解率30.7%；350目PLA粉末降解率為23.3%；100目的PCL粉末降解率21.3%。如圖4所示，PLA相關(guān)的粉末降解率遠(yuǎn)大于聚乳酸塑料薄膜，聚乳酸粉末制成塑料薄膜過程經(jīng)過拉伸、吹塑、添加增韌劑等工藝，減少與微生物的接觸面，加大了微生物對PLA塑料薄膜的降解難度；另外，不同的可降解材料結(jié)構(gòu)與物質(zhì)組成不同，其降解率也不同，PBS可降解塑料最容易被微生物降解。

圖4 降解菌YJY-1對不同可降解塑料的降解性率

4 結(jié)論

極細(xì)枝孢霉(Cladosporium tenuissimum)屬半知菌亞門絲孢綱叢梗孢目暗色孢科枝孢屬（Cladosporium）真菌，是植物致病菌，在植物病害有較多報(bào)道，偶爾引起人體感染。Cladosporium tenuissimum能夠合成茶黃素，湖北農(nóng)業(yè)大學(xué)于2008年、2009年申請了關(guān)于極細(xì)枝孢霉生物合成茶黃素(Theaflavins，TFs)粗提物的方法，.SYED NASEER[11]等人從從印度克什米爾地區(qū)喜馬拉雅山脈西部分離到一種內(nèi)生真菌細(xì)莖枝孢霉，并對其次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分析，首次報(bào)道了鄰羥基苯基丙酮、(3s，5s，11s)-三羥基十二酸和四氫吡啶酮的天然來源。

目前尚未有極細(xì)枝孢霉對可降解塑料具有降解作用的報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)的YJY-1具有易培養(yǎng)、生長速度快、降解效率高等優(yōu)點(diǎn)，具有良好的開發(fā)應(yīng)用潛力。本研究豐富了可降解塑料微生物的菌種資源，為進(jìn)一步開展可降解塑料生物降解機(jī)制研究奠定了重要基礎(chǔ)。功能微生物及其分泌的功能酶的高效利用對加速生物可降解塑料的降解具有重要意義，有待尋找更多具有降解塑料材料的微生物及酶，優(yōu)化降解條件以提高對生物可降解材料的降解效率和速度，推動(dòng)全球可降解塑料制品的應(yīng)用。