曹國芬，朱 莉，張?zhí)K梅，唐玄兵

（1. 西安醫(yī)學(xué)院護理學(xué)院，陜西西安 710021；2. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)學(xué)院，陜西西安 710061）

抑郁癥是一組以情緒低落、快感缺失為特征的疾病，已成為全球首要的致殘因素[1]。抑郁癥發(fā)病女性高于男性，老年期女性發(fā)病率最高[2]。圍絕經(jīng)期始于卵巢功能衰退，止于絕經(jīng)后1 年。研究表明，圍絕經(jīng)期女性相對成年期女性，抑郁癥發(fā)病率提高2～3倍[3]，即圍絕經(jīng)期女性對抑郁癥明顯易感。近年來研究表明，圍絕經(jīng)期的分子生物學(xué)改變介導(dǎo)著老年疾病的發(fā)生、發(fā)展[4]，提示圍絕經(jīng)期可能啟動老年期抑郁癥的發(fā)病。然而，圍絕經(jīng)期抑郁癥發(fā)病的相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)改變目前研究較少。

多巴胺是腦內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，由中腦腹側(cè)被蓋區(qū)、黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元釋放[5]，通過神經(jīng)突觸投射作用于不同腦區(qū)[6]，與多巴胺受體結(jié)合，參與調(diào)控抑郁癥發(fā)病[7]。多巴胺受體區(qū)分為D1 樣受體（多巴胺D1、D5 受體）、D2 樣受體（多巴胺D2、D3、D4 受體）[8]，其中，D3 受體對DA 的親和力最高[9]。D3 受體通過偶聯(lián)Gαi/o，抑制腺苷酸環(huán)化酶活性，減少cAMP的產(chǎn)生，進一步通過抑制PKA 等信號通路，參與調(diào)控抑郁癥發(fā)病[9-10]。有關(guān)人群的研究表明，D3 受體激動劑類藥物具有明顯抗抑郁作用[10]；而D3 受體下降往往伴隨著抑郁癥發(fā)病[11]。有關(guān)動物實驗同樣證明，D3 受體拮抗劑會誘導(dǎo)小鼠表現(xiàn)出明顯的抑郁樣行為[12]。而D3 受體在圍絕經(jīng)期如何改變，在圍絕經(jīng)期抑郁癥中如何作用，目前少有報道。

耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院所提供的人腦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫[13]，基于人腦轉(zhuǎn)錄組（human brain transcriptome, HBT）項目建立，提供了從胚胎、胎兒到出生后整個生命周期中腦內(nèi)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。由該數(shù)據(jù)庫信息得出，D3 受體轉(zhuǎn)錄水平在腦內(nèi)呈明顯區(qū)域性分布，表現(xiàn)為在紋狀體中最高，其余腦區(qū)包括腦皮層、丘腦背內(nèi)側(cè)核、杏仁核、海馬等，D3 受體轉(zhuǎn)錄水平均較低。同時，在圍絕經(jīng)期時，紋狀體內(nèi)D3 受體轉(zhuǎn)錄水平急劇下降。這提示，紋狀體中D3 受體下降可能在圍絕經(jīng)期抑郁癥發(fā)病中具有重要作用。

本課題組前期研究表明，無應(yīng)激下，圍絕經(jīng)期小鼠并未表現(xiàn)出抑郁樣行為；慢性束縛應(yīng)激（chronic immobilization stress, CIS）時，圍絕經(jīng)期小鼠表現(xiàn)出明顯抑郁樣行為；相同的CIS 在青年期小鼠中并無明顯作用[14]。基于此，本研究首先采用實時定量PCR 檢測小鼠紋狀體中D3 受體。伏隔核（nucleus accumbens,NAc）是紋狀體的重要組成部分，主要參與調(diào)節(jié)動機、獎賞效應(yīng)[15]，因此本研究主要檢測小鼠伏隔核內(nèi)多巴胺D3 受體轉(zhuǎn)錄水平的變化。進一步，采用多巴胺D3 受體基因敲除（D3 receptor knockout,D3RKO）小鼠，探究多巴胺D3 受體在圍絕經(jīng)期抑郁癥發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗小鼠

本實驗C57BL/6 小鼠（北京維通利華）飼養(yǎng)及分組見于前期研究[14]。D3RKO 小鼠和具有相同遺傳背景的野生型(wild type, WT)小鼠由芝加哥大學(xué)徐明教授贈送[16]。采用D3 受體基因敲除雜合子小鼠雜交的方式繁育實驗所需的兩基因型純合子小鼠，PCR（polymerase chain reaction）技術(shù)鑒定小鼠基因型。用于PCR 的基因分型的四個引物序列分別是5′-AGCAAGGCGAGATGACAGGA-3′，5′-CAAGATGGATTGCACGCAGG-3′，5′-GCTCACCACTAGGTAGTTG-3′和5′-ACCTCTGAGCCAGATAAGC-3′。

分別采用2 月齡（2 m）小鼠為青年對照組（D3RKO 青年組10 只，WT 青年組10 只，體質(zhì)量18～25 g），12 月齡（12 m）小鼠為圍絕經(jīng)期組（D3RKO圍絕經(jīng)期組8 只，WT 圍絕經(jīng)期組8 只，體質(zhì)量25～32 g）。3～4 只一籠，溫度（23±1）℃，每天光照12 h（7:00～19:00 為燈光照射時間），通風(fēng)良好，小鼠自由攝食飲水。在實驗開始前，所有小鼠在實驗室飼養(yǎng)一周，以適應(yīng)實驗室環(huán)境。

1.2 強迫游泳實驗

對D3RKO 小鼠及WT 小鼠，該實驗過程在9:00至12:00 之間進行。強迫游泳實驗設(shè)備為兩個有機玻璃圓柱桶（高25 cm，直徑15 cm）。在進行強迫游泳測試之前，將所有小鼠置于測試室中30 min。實驗時在桶內(nèi)注入15 cm 深度的水，水溫（24±1）℃，將兩只小鼠分別置于桶中游泳6 min。每次更換小鼠時更換水1 次。通過視頻跟蹤系統(tǒng)（SMART 3.0）自動跟蹤記錄每只小鼠的行為。小鼠在6 min 內(nèi)不動時間為統(tǒng)計指標(biāo)。不動時間延長，表示小鼠相對表現(xiàn)出抑郁樣行為。

1.3 懸尾實驗

對D3RKO 小鼠及WT 小鼠，該實驗過程在9:00至12:00 之間進行。尾懸實驗裝置由兩個塑料懸尾掛箱組成（高55 cm，寬15 cm，深11.5 cm），懸尾掛箱為三壁矩形，鋁制懸掛鉤位于盒子的頂部。在進行懸尾實驗測試之前，將所有小鼠置于測試室中30 min。實驗時將膠帶粘貼在老鼠尾巴的末端，將每只小鼠分別懸掛在掛箱內(nèi)6 min。實驗結(jié)束時，小心地從尾巴上取下膠帶。用750 mL/L 乙醇徹底擦拭懸尾掛箱。通過視頻跟蹤系統(tǒng)（SMART 3.0）自動跟蹤記錄每只小鼠的行為。小鼠在6 min 內(nèi)不動時間為統(tǒng)計指標(biāo)。不動時間延長，表示小鼠相對表現(xiàn)出抑郁樣行為。

1.4 實時定量PCR 檢測基因表達

行為學(xué)檢測后剝離小鼠大腦，在冰盒內(nèi)分離伏隔核，在液氮中冷凍。使用RNAfast1000 RNA 提取試劑盒（先鋒科技，中國）提取總RNA，采用ELx800 Microplate Reader（BioTek, USA）進行RNA 定量，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，日本）合成cDNA。使用SYBR Premix ExTaqII（TaKaRa，日本）在Bio-Rad iQ5 系統(tǒng)（Bio-Rad，USA）上進行實時定量PCR，條件 為95 ℃30 s; 95 ℃10 s，57 ℃30s 和72 ℃30 s，重復(fù)40 個循環(huán)。GAPDH 作為內(nèi)參，相對表達水平用2-△△Ct法測定。引物序列如表1 所示。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 16.0 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。實驗結(jié)果以均值±標(biāo)準差（±s）形式表示。組間差異首先采用雙因素方差分析方法，檢驗圍絕經(jīng)期效應(yīng)、基因型效應(yīng)及其交互效應(yīng)，再進行LSD 多重比較或t檢驗比較兩兩差異。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 伏隔核多巴胺D3 受體下降與圍絕經(jīng)期小鼠抑郁樣行為有關(guān)

在前期研究基礎(chǔ)上[14]，本研究進一步檢測了小鼠伏隔核內(nèi)D3 受體mRNA 水平的變化。結(jié)果表明（圖1），伏隔核D3 受體的改變呈現(xiàn)明顯的圍絕經(jīng)期效應(yīng)[F(1,32)=95.130，P＜0.05]，CIS 效 應(yīng)[F(1,32)=28.556，P＜0.05]，以及圍絕經(jīng)期與應(yīng)激之間交互效應(yīng)[F(1,32)=11.167，P＜0.05]。進一步多重比較發(fā)現(xiàn)，在兩個對照組間，圍絕經(jīng)期小鼠伏隔核內(nèi)D3 受體轉(zhuǎn)錄水平明顯下降（圍絕經(jīng)期對照組與青年期對照組相比，P＜0.05）。CIS 誘導(dǎo)青年期小鼠腦內(nèi)D3 受體下降（青年期CIS 組與青年期對照組相比，P＜0.05）。CIS 進一步加重圍絕經(jīng)期小鼠伏隔核內(nèi)D3 受體下降（圍絕經(jīng)期CIS 組與圍絕經(jīng)期對照組相比，圍絕經(jīng)期CIS 組與青年期CIS 組相比，P＜0.05）。這些結(jié)果提示，圍絕經(jīng)期伴隨的伏隔核內(nèi)D3 受體的下降，可能不足以誘發(fā)圍絕經(jīng)期抑郁樣行為；而圍絕經(jīng)期與應(yīng)激綜合作用下，伏隔核內(nèi)D3 受體的更大幅度下降，可能誘導(dǎo)著圍絕經(jīng)期抑郁樣行為。

2.2 多巴胺D3 受體缺失可能誘導(dǎo)圍絕經(jīng)期小鼠抑郁樣行為

為了檢測多巴胺D3 受體在圍絕經(jīng)期抑郁發(fā)病中的作用，本研究進一步以多巴胺D3 受體敲除小鼠進行研究。強迫游泳實驗結(jié)果（圖2A）表明：小鼠不動時間表現(xiàn)出明顯的圍絕經(jīng)期效應(yīng)[F(1,32)=5.518，P＜0.05]，兩基因型之間無明顯效應(yīng)[F(1,32)=0.146，P=0.705]，而圍絕經(jīng)期與基因型之間存在明顯交互效應(yīng)[F(1,32)=4.212，P＜0.05]。進一步多重比較發(fā)現(xiàn)，在圍絕經(jīng)期小鼠中，D3RKO 小鼠相對WT 小鼠，不動時間明顯延長（P＜0.05，圖2A）；在D3RKO 小鼠中，圍絕經(jīng)期相對青年組小鼠不動時間明顯延長（P＜0.05，圖2A）；圍絕經(jīng)期不會明顯改變WT 小鼠不動時間。

圍絕經(jīng)期小鼠伏隔核內(nèi)D3 受體明顯下降；CIS 誘導(dǎo)青年期小鼠腦內(nèi)D3 受體下降；CIS 誘導(dǎo)圍絕經(jīng)期小鼠伏隔核內(nèi)D3 受體的進一步下降。與同年齡對照組比較，*P＜0.05；與相同處理組比較，#P＜0.05。雙因素方差分析，LSD 多重比較。

類似的，懸尾實驗結(jié)果（圖2B）表明：小鼠不動時間表現(xiàn)出明顯的圍絕經(jīng)期效應(yīng)[F(1,32)=5.016，P＜0.05]，兩基因型之間無明顯效應(yīng)[F(1,32)=0.585，P=0.45]，而圍絕經(jīng)期與基因型之間存在明顯交互效應(yīng)[F(1,32)=4.220，P＜0.05]。進一步多重比較發(fā)現(xiàn)，在D3RKO小鼠中，圍絕經(jīng)期相對青年組小鼠不動時間明顯延長（P＜0.05，圖2B）；在圍絕經(jīng)期小鼠中，D3RKO 小鼠相對WT 小鼠懸尾不動時間有延長趨勢（P=0.068）。這些結(jié)果提示多巴胺D3 受體缺失可能誘導(dǎo)圍絕經(jīng)期小鼠表現(xiàn)出抑郁樣行為。

圖2 多巴胺D3 受體缺失對圍絕經(jīng)期小鼠抑郁樣行為的影響Fig. 2 The effect of dopamine D3 receptor (DRD3) deficiency on depressive-like behavior in perimenopausal mice

2.3 圍絕經(jīng)期誘導(dǎo)的兩基因型小鼠體質(zhì)量的變化

隨著年齡增加，小鼠體質(zhì)量會逐漸增加。本研究以小鼠體質(zhì)量變化為基線，排除圍絕經(jīng)期時兩種基因型的差異。結(jié)果表明：小鼠體質(zhì)量表現(xiàn)出明顯的圍絕經(jīng) 期 效 應(yīng)[F(1,32)=201.78，P＜0.05]，兩 基 因 型 之 間[F(1,32)=0.698，P=0.410]、圍絕經(jīng)期與基因型交互之間[F(1,32)=0.078，P=0.782]均無明顯效應(yīng)，提示圍絕經(jīng)期誘導(dǎo)小鼠體質(zhì)量增加，而體質(zhì)量的變化在兩基因型之間無明顯差異。進一步兩兩比較結(jié)果顯示（表2），在WT 小鼠、D3RKO 小鼠中，圍絕經(jīng)期相對青年組小鼠體質(zhì)量明顯增加。

表2 圍絕經(jīng)期誘導(dǎo)的兩種基因型小鼠體質(zhì)量的變化Tab. 2 Perimenopause-induced change in the weight of two genotype mice

3 討 論

抑郁癥發(fā)病女性高于男性，圍絕經(jīng)期是女性抑郁癥易感階段[3]，其機制不明確。多巴胺D3 受體參與調(diào)控精神障礙性疾病的發(fā)生，D3 受體激動具有明顯抗抑郁效果[10-11]；而D3 受體抑制則誘導(dǎo)個體表現(xiàn)出明顯的抑郁癥狀[11]，提示D3 受體在抑郁癥發(fā)病中的重要作用。而耶魯大學(xué)數(shù)據(jù)庫信息顯示，腦內(nèi)D3 受體主要集中在紋狀體內(nèi)，紋狀體內(nèi)D3 受體轉(zhuǎn)錄水平在圍絕經(jīng)期時急劇下降[13]，提示紋狀體中D3 受體下降在圍絕經(jīng)期抑郁癥發(fā)病中可能具有重要作用。本研究進一步采用小鼠的行為及分子實驗，研究D3 受體在圍絕經(jīng)期抑郁癥中的作用。

基于本課題組前期行為學(xué)研究結(jié)果[14]，圍絕經(jīng)期小鼠無明顯抑郁樣行為；慢性束縛應(yīng)激在圍絕經(jīng)期小鼠中誘導(dǎo)明顯抑郁樣行為，但是在青年小鼠中不誘導(dǎo)抑郁樣行為。這些結(jié)果提示，圍絕經(jīng)期小鼠表現(xiàn)出抑郁易感性。腦內(nèi)D3 受體轉(zhuǎn)錄水平在紋狀體內(nèi)最高，NAc 是紋狀體的重要組成部分，因此本研究檢測了伏隔核內(nèi)多巴胺D3 受體mRNA 水平的變化。結(jié)果顯示，小鼠伏隔核D3 受體在圍絕經(jīng)期明顯下降，與人群結(jié)果相似[13]。值得一提的是，D3 受體在自然進入圍絕經(jīng)期組會下降，在青年期的應(yīng)激組也會下降，但這兩組小鼠并無明顯抑郁樣行為，說明伏隔核D3 受體的改變與行為學(xué)存在一定差異，推測可能有以下兩種原因：一是伏隔核D3 受體等分子變化相對于行為學(xué)變化更為敏感，更易受到應(yīng)激、圍絕經(jīng)期年齡老化等因素的影響[17-18]；二是伏隔核D3 受體的改變與行為學(xué)改變之間，可能存在一定的量-效關(guān)系，即伏隔核D3 受體下降至一定水平時方可誘導(dǎo)行為學(xué)改變。本實驗圍絕經(jīng)期慢性束縛應(yīng)激組的D3 受體改變有利于該解釋，因為慢性束縛應(yīng)激誘導(dǎo)了圍絕經(jīng)期小鼠抑郁樣行為，且該組伴隨著D3 受體的進一步下降。為了深入驗證D3 受體與行為學(xué)改變之間的關(guān)系，本研究進一步采用D3 敲除小鼠研究其在圍絕經(jīng)期抑郁中的作用。敲除小鼠結(jié)果表明，青年小鼠中兩種基因型在強迫游泳、懸尾實驗中不動時間無明顯差異；在圍絕經(jīng)期組小鼠中，D3 受體敲除小鼠不動時間則明顯延長，提示D3 受體缺失可能誘導(dǎo)圍絕經(jīng)期抑郁易感性。綜合本研究提示，伏隔核D3 受體的大幅度下降或完全缺失，可能會導(dǎo)致圍絕經(jīng)期抑郁癥發(fā)病。

研究表明，在圍絕經(jīng)期卵巢功能逐漸衰退，黃體酮水平下降，導(dǎo)致神經(jīng)甾體別孕烷醇酮降低[19]，從而引起腦內(nèi)GABA 能神經(jīng)元、多巴胺能神經(jīng)元等多種遞質(zhì)、受體的變化，誘導(dǎo)下丘腦-垂體-腎上腺軸功能紊亂[20-21]，從而導(dǎo)致圍絕經(jīng)期對抑郁更易感[18]。近年來，多巴胺D3 受體在精神障礙疾病中的作用逐漸被揭示[11]。多巴胺D3 受體功能下降伴隨著抑郁癥發(fā)病[10]，而使用多巴胺D3 受體激動劑則明顯表現(xiàn)出抗抑郁效果[11]，提示D3 受體可能參與著圍絕經(jīng)期抑郁癥發(fā)病。D3 受體如何介導(dǎo)圍絕經(jīng)期抑郁癥發(fā)病不是很明確，但研究表明，D3 受體多與多巴胺D1 受體共表達于神經(jīng)元，D3 受體可下調(diào)突觸后膜D1 受體的過度激活，從而維持多巴胺受體功能的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，共同參與調(diào)節(jié)行為學(xué)改變[16]，D3 受體的下降或缺失可能會導(dǎo)致多巴胺內(nèi)穩(wěn)態(tài)的紊亂，從而導(dǎo)致圍絕經(jīng)期抑郁易感性；此外，近期研究表明，腦內(nèi)相當(dāng)一部分D3 受體表達于星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞，D3 受體的缺失會導(dǎo)致膠質(zhì)細胞的活化，從而增加小鼠抑郁樣行為[22]，具體機制有待進一步研究。

綜上，本研究結(jié)果表明，伏隔核多巴胺D3 受體在圍絕經(jīng)期明顯下降，D3 受體的大幅度下降或缺失可能參與著圍絕經(jīng)期抑郁癥的發(fā)病。