高 潔，武曉磊，孔 爽，王 瑩

(1.陜西國際商貿(mào)學(xué)院 醫(yī)藥學(xué)院，陜西 咸陽 712000;2.陜西省中藥綠色制造技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 咸陽 712000)

百合，為百合科植物卷丹LiliumlancifoliumThunb.的干燥肉質(zhì)鱗葉[1]。百合作為國家首批批準(zhǔn)通過的藥食兩用植物，不僅作為保健食品，而且還具有很高的藥用價(jià)值[2,3]。百合中含有皂苷，多糖，生物堿，蛋白質(zhì)，多種維生素、微量元素等成分，具有養(yǎng)陰、滋陰、潤肺，清心安神的功效[4]。

百合多糖是一種混合多糖，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在對百合的研究過程中發(fā)現(xiàn)百合多糖是百合中的主要功能成分之一，具有潤肺止咳，抗氧化，提高免疫力，抗腫瘤等作用[5,6]。目前國內(nèi)提取百合多糖常用的方法有：微波輔助提取法、水提法、超聲波提取法、酶法，溶劑法等[7～9]。水提法具有較多優(yōu)點(diǎn)，因此仍作為百合多糖的主要提取方法，但水提法提取百合多糖的響應(yīng)面優(yōu)化報(bào)道較為少見，筆者對水提法提取百合多糖進(jìn)行響應(yīng)面工藝優(yōu)化進(jìn)，旨在提高百合多糖的提取率，為百合的藥食應(yīng)用開發(fā)提供一定的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮百合(購于商洛百合種植戶，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)雷國蓮教授鑒定為百合)；D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品鑒定所)；試驗(yàn)所用化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

分析天平；可見分光光度計(jì)；低速離心機(jī)；高速粉碎機(jī)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；循環(huán)式多用真空泵；數(shù)顯恒溫水浴鍋。

1.3 提取工藝路線

干燥百合→粉碎→回流→離心→濃縮→除蛋白→含量測定

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，加水溶解后定容至100 mL，稀釋至不同濃度于容量瓶中標(biāo)，再分別精確吸取1.0 mL到試管內(nèi)，加入5 %苯酚溶液1.0 mL，濃硫酸5.0 mL，室溫條件下靜置40 min，同時(shí)取1.0 mL蒸餾水、1.0 mL苯酚溶液、5 mL濃硫酸溶液，搖勻混合作為空白組，將不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液及空白液在波長490 nm處，測其吸光度A，并且繪制標(biāo)準(zhǔn)取消，并得出線性回歸方程：Y=3.6944X+0.1879，R2=0.9991

1.4.2 百合多糖的提取 供試品制備：取5 g百合粉末置于50 mL圓底燒瓶中，加入水,回流提取4 h，冷卻，離心分離，濃縮到原體積的1/3，加入95%乙醇醇沉后，復(fù)溶，加入sevag(氯仿∶正丁醇=1∶4)試劑反復(fù)多次去除蛋白，將所得百合多糖溶解后于490 nm處測其吸光度，計(jì)算百合多糖含量。

多糖提取率:提取率(%)=(樣品多糖含量×稀釋倍數(shù))/樣品干重×100%

1.4.3 單因素試驗(yàn) 單因素試驗(yàn)以百合多糖提取率作為主要考核指標(biāo)，采用1.4.2的提取方法，選擇液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1mL/g)，提取時(shí)間(1h、2h、3h、4h、5h)，提取溫度(50℃、55℃、60℃、65℃、70℃)三個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察最佳提取水平范圍。

1.4.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 通過對于單因素試驗(yàn)結(jié)果的考察，以提取溫度(X1)、液料比(X2)、提取時(shí)間(X3)作為響應(yīng)面試驗(yàn)的自變量，百合多糖提取率為因變量，通過響應(yīng)面軟件進(jìn)行試驗(yàn)組別的設(shè)計(jì)，見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素

2.1.1 提取溫度對百合多糖提取率的影響 如圖1所示：回流溫度與百合多糖的提取率所呈現(xiàn)出先正比后反比的趨勢走向，反應(yīng)的初始階段百合多糖的提取率伴隨著溫度的增大而增大，當(dāng)提取溫度達(dá)到60 ℃時(shí)，百合多糖的提取率最大。溫度較低時(shí)無法使多糖更好的提取出來，但溫度過高多糖糖苷鍵易發(fā)生斷裂，從而使提取率下降。

圖1 提取溫度對百合多糖提取率的影響

2.1.2 液料比對百合多糖的影響 如圖2所示：當(dāng)液料比小于20∶1 mL/g時(shí)，百合多糖的提取率與液料比成正比，在20∶1 mL/g處達(dá)到最佳提取率，再升高液料比時(shí)，提取率明顯下降。液料比較小原料提取不充分，但是隨著液料比的提升會(huì)導(dǎo)致藥液體積增大，提取速率逐漸變慢，提取的效果會(huì)較差。

圖2 液料比對百合中百合多糖提取率的影響

2.1.3 提取時(shí)間對百合多糖提取率的影響 圖3可知當(dāng)提取時(shí)間為3 h時(shí)，提取率達(dá)到最大值。當(dāng)提取時(shí)間較小時(shí)，百合提取液還未達(dá)到適合溫度，并且液料相互作用不充分，因此多糖提取率較低。但隨著時(shí)間的眼饞，藥液內(nèi)部溫度過高使百合多糖結(jié)構(gòu)變性，活性降低，提取效果變差。

圖3 提取時(shí)間對百合中百合多糖提取率的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件

選定提取溫度(X1)、液料比(X2)、提取時(shí)間(X3)3個(gè)因素為影響因素，根據(jù)單因素試驗(yàn)確定的水平桿位，結(jié)合百合多糖的提取率，進(jìn)行響應(yīng)面提取工藝優(yōu)化，結(jié)果如表2，表3所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

表3 回歸統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

多元回歸方程為：

Y=26.40+0.075X1+0.20X2+0.14X3+5.000E-003X1X2+0.030X1X3-0.45X2X3-0.35X12-0.31X22-0.31X32

由表3可知，模型極顯著(p<0.001)，失擬項(xiàng)不顯著(p=0.0887>0.05)，說明這個(gè)模型的擬合情況較好，并且誤差小，所以此模型可用。

通過表3的方差分析表又可以看出，X2(液料比)、X3(提取時(shí)間)、X12、X22、X32都是極顯著的(P<0.01)，而X1(提取溫度)為顯著，所以各因素交互作用是不顯著，并且對響應(yīng)值百合多糖的提取率影響的顯著性分析后順序?yàn)椋阂毫媳?X2)>提取時(shí)間(X3)>提取溫度(X1)。

2.2.1 響應(yīng)面結(jié)果分析 由圖4可看出，根據(jù)液料比的曲線陡峭幅度較大，提取溫度的曲線變化幅度是較小，所以液料比對多糖提取率的影響還是較提取溫度顯著，但是它的交互作用曲面還是較為陡峭，因此二者具有一定的交互作用。

a b

圖5為固定液料比后提取溫度和提取時(shí)間兩者相互影響的趨勢圖，從圖中可以看出提取時(shí)間的曲線較提取溫度的曲線陡峭，所以得到提取時(shí)間的影響較提取溫度的影響顯著，二者的交互作用的顯著性較低。

a b

a b

由圖6可看出，固定多糖的提取溫度，多糖的提取率會(huì)伴隨著提取時(shí)間和液料比的增加而先上升后下降，從曲面圖可看出液料比曲線較提取時(shí)間陡峭，因此液料比對百合多糖提取率的影響較提取時(shí)間顯著。

2.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 利用響應(yīng)面設(shè)計(jì)軟件得出的最佳工藝條件：提取溫度為60.24 ℃，液料比為23.71∶1 mL/g，提取時(shí)間為3.21 h，百合多糖在該工藝條件下提取率可達(dá)26.444 %。

考慮降低能耗及實(shí)驗(yàn)的便捷性，將優(yōu)化條件調(diào)整為：提取溫度60 ℃，液料比20∶1 mL/g，提取時(shí)間為3 h，并且再進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，最后得到百合多糖的平均提取率為26.131 %，這個(gè)值和預(yù)測值的比較相對誤差較小，所以說明這個(gè)模型的實(shí)用性較好。

3 結(jié)論

百合多糖具有廣泛藥理活性，如免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、降血糖、抑菌等生物活性，具有較高研究價(jià)值。百合多糖的含量高低的影響因素較多，如品種、種植方法，產(chǎn)地、采收期及提取方法，檢測方法等。研究選用水提取法為百合多糖的提取方法，水提法具有耗能源低、所需設(shè)備簡單、造價(jià)低、體積小、實(shí)驗(yàn)室操作方便等特點(diǎn)，試驗(yàn)通過響應(yīng)面來優(yōu)化水提百合多糖的工藝條件最佳工藝條件得出：提取溫度為60 ℃，液料比為20∶1 mL/g，提取時(shí)間為3 h時(shí)，最后百合多糖的提取率的最大值為26.131 %。通過對百合多糖的提取更加深入的了解百合多糖在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)臨床中的應(yīng)用，不斷加深對作用機(jī)制的了解，為以后植物多糖的研究發(fā)展提供基礎(chǔ)。