骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體對(duì)盆腔炎模型大鼠氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響

羅娜 孫蔚林 寧靜 李衛(wèi)平

(解放軍總醫(yī)院海南分院婦產(chǎn)科，海南 三亞 572013)

盆腔炎(Plvic inflammatory disease，PID)[1]是指累及女性盆腔內(nèi)生殖器官及其周圍結(jié)締組織、盆腔腹膜的炎癥性疾病。PID反復(fù)發(fā)作或遷延不愈，會(huì)導(dǎo)致患者出現(xiàn)疼痛不適、異位妊娠、不孕以及影響性生活等，對(duì)婦女的身心健康和生活造成嚴(yán)重影響。目前針對(duì)PID的內(nèi)科治療手段主要是運(yùn)用抗生素消除/緩解炎癥，以及物理療法來活血化瘀，緩解疼痛不適，促進(jìn)炎癥消退。但是仍存在長期效果欠佳，復(fù)發(fā)率高的缺點(diǎn)[2-3]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[4](Bone marrow mesenchymal stem cell，BMSCs) 是一類具有自我更新能力的非造血干細(xì)胞。以往的研究表明[5-6]，BMSCs有可能分化為間充質(zhì)或非間充質(zhì)細(xì)胞系，且具有向損傷部位遷移的能力，通過調(diào)節(jié)先天性和獲得性免疫細(xì)胞的增殖和功能，促進(jìn)傷口愈合和組織再生，抗炎和抑制免疫反應(yīng)。Exosomes是一類由細(xì)胞主動(dòng)分泌的，直徑在30 nm～150 nm的囊泡樣小體[7]。在正常和病理?xiàng)l件下，Exosomes通過穿梭蛋白質(zhì)、mRNA和microRNAs介導(dǎo)細(xì)胞間的通訊有助于遺傳和生化信息在細(xì)胞間的傳遞。在腫瘤發(fā)生、炎癥免疫反應(yīng)等多個(gè)生理病理過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。有研究顯示[8-9]，BMSCs能夠分泌豐富的Exosomes，在BMSCs與靶細(xì)胞之間交換蛋白質(zhì)和遺傳信息，發(fā)揮重要的介導(dǎo)作用。本研究通過構(gòu)建大鼠PID模型，并觀察BMSCs源性Exosomes對(duì)PID模型大鼠氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響，為臨床上治療PID提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 清潔級(jí)雌性SD健康大鼠60只，質(zhì)量180～220 g，購于解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；左氧氟沙星片(可樂必妥)購于第一三共制藥(北京)有限公司；DMEM F12培養(yǎng)基、胎牛血清購于Gibco公司；ExoQuiekTC外泌體提取試劑盒購自美國SBI公司；TNF-α、CRP、IL-1β、IL-6 和IL-10 ELISA 試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司；大鼠SOD、MDA和T-AOC檢測(cè)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所； Centrifuge5424離心機(jī)購自Eppendorf公司；1-15K高速冷凍臺(tái)式離心機(jī)購自Sigma公司；CyFlow? Counter流式細(xì)胞儀購自德國Partec公司；MCO-15AC型CO2孵育箱購自日本SANYO公司；LH 750全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀購自美國貝克曼庫爾特；DYY-6C型電泳儀購自北京市六一儀器廠；IX-70型倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；MultiImageTM凝膠成相系統(tǒng)購自Alpha Innotech公司；NanoDrop 1000超微量分光光度計(jì)購自美國Nanodrop公司。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs分離、培養(yǎng)和鑒定 ①BMSCs分離和培養(yǎng)：采用貼壁法培養(yǎng)BMSCs、3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉實(shí)驗(yàn)SD大鼠，頸部脫臼處死大鼠， 75%乙醇浸泡10 min進(jìn)行消毒。無菌條件下截取實(shí)驗(yàn)SD大鼠的股骨和脛骨的骨骺末端，PBS溶液反復(fù)沖洗骨骺末端的骨髓腔，收集沖洗后PBS溶液。移液器反復(fù)吹打，篩網(wǎng)過濾，制作成單細(xì)胞懸液，以1500 r/min條件下離心10 min，棄去上清液。將細(xì)胞的密度調(diào)整為(1～3)×106/mL，接種至含LG-DMEM完全培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。在37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后棄去培養(yǎng)液，去除掉非貼壁細(xì)胞。然后加入等量LG-DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)純化細(xì)胞，每3天更換一次LG-DMEM培養(yǎng)液。待細(xì)胞長至80%左右融合時(shí)，0.25%胰蛋白酶，以1:3的比例傳代。取第3代生長良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。②BMSCs的鑒定：0.25%胰蛋白酶消化BMSCs，制作成細(xì)胞密度為1×106/ml的單細(xì)胞懸液。分別加入熒光直標(biāo)的CD44和CD90單克隆抗體?；旌途鶆蚝螅诎禇l件下孵育30 min，用PBS溶液洗滌3次，并為每組樣品設(shè)立單獨(dú)的陰性對(duì)照。采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)表面標(biāo)志物；成脂和成骨誘導(dǎo)分化檢測(cè)其分化能力。

1.2.2 BMSCs源性Exosomes的提取和鑒定 BMSCs培養(yǎng)待細(xì)胞融合度達(dá)到90%后，更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，收集培養(yǎng)基上清液。4℃的條件下以300 g×10 min，2000 g×20 min離心去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片形成的沉淀。離心后取上清液置于新的EP管，每500 μL上清液加入ExoQuiekTC試劑50 μL；顛倒EP管約20次混合，置于4℃冰箱靜置約12 h。然后在4℃、3000 g條件下離心30 min，去除上清液，保留沉淀。使用移液槍取400 μL 1×PBS并反復(fù)均勻吹打離心沉淀物，該重懸液中富含Exosomes顆粒，將重懸液轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL EP中。透射電子顯微鏡觀察提取的Exosomes形態(tài)。Western blot 檢測(cè)Exosomes標(biāo)志物表達(dá)。

1.2.3 PID大鼠動(dòng)物模型建立及分組 所有實(shí)驗(yàn)大鼠在術(shù)前12 h開始禁止進(jìn)食，自由飲水，手術(shù)區(qū)域剃毛備皮。稱重大鼠后，3%戊巴比妥鈉50 mg/kg 腹腔內(nèi)注射麻醉。待麻醉起效后，橡皮筋固定大鼠于操作臺(tái)上。下腹部備皮常規(guī)消毒，取腹正中切口1.5～2 cm，開腹后暴露子宮。采用l mL注射器針頭進(jìn)針入子宮腔內(nèi)反復(fù)來回抽拉以造成子宮內(nèi)膜組織機(jī)械損傷。向輸卵管卵巢方向緩慢注射0.1 mL濃度為3×1012/L的混合細(xì)菌懸液(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌三者比例為2:1:1混勻)。隨手逐層縫合關(guān)腹，碘伏消毒術(shù)區(qū)。假手術(shù)組手術(shù)操作步驟僅為開腹和關(guān)腹，未對(duì)子宮腔進(jìn)行機(jī)械損傷以及注射混合細(xì)菌懸液。將40只PID模型大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為：模型組(單純構(gòu)建PID模型大鼠未給與任何特殊處理)；治療組(構(gòu)建PID模型大鼠術(shù)后第3天開始腹腔注射100 μg/mL的Exosomes稀釋液1 mL，連續(xù)注射3天)；左氧氟沙星組(構(gòu)建PID模型大鼠第3天開始60 mg/kg/天左氧氟沙星灌胃給藥，連續(xù)3天)；對(duì)照組(構(gòu)建PID模型大鼠后腹腔注射相應(yīng)劑量生理鹽水)。另外設(shè)置空白組(正常飼養(yǎng)大鼠，不給予任何處理)和假手術(shù)組。每組10只。

1.2.4 子宮組織蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE )染色 取實(shí)驗(yàn)大鼠子宮組織用10%多聚甲醛溶液固定24 h，然后經(jīng)梯度脫水、常規(guī)石蠟包埋、切片(厚5 μm)，HE染色后制作成病理切片。顯微鏡下觀察子宮組織病理學(xué)改變情況。

1.2.5 外周血白細(xì)胞測(cè)定 3%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉實(shí)驗(yàn)大鼠，開腹用10 mL注射器抽取下腔靜脈血約2 mL，采用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀測(cè)定靜脈血中白細(xì)胞數(shù)量、種類、比例等。

1.2.6 血清樣本采集 3%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉實(shí)驗(yàn)大鼠，開腹用10 mL注射器抽取下腔靜脈血約8 mL置入微量離心管。室溫下靜置1 h，然后2000 rpm離心20 min，取上清置于新1.5 mL微量離心管。

1.2.7 血清炎癥因子檢測(cè) 采用ELISA 試劑盒分別檢測(cè)大鼠血清中炎癥介質(zhì)TNF-α、CRP、IL-1β、IL-6 和IL-8的濃度水平。所有檢測(cè)均嚴(yán)格按照檢測(cè)試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作。

1.2.8 氧化應(yīng)激狀態(tài)評(píng)估 ①丙二醛(Malondialdehyde，MDA)檢測(cè)：采用南京建成生物工程研究所的MDA檢測(cè)試劑盒，實(shí)驗(yàn)按照試劑盒使用說明步驟進(jìn)行操作。②超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)活性檢測(cè)：采用南京建成生物工程研究所的SOD檢測(cè)試劑盒，實(shí)驗(yàn)按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作。③總抗氧化能力(Total antioxidant capacity，T-AOC)檢測(cè)：采用北京索萊寶科技有限公司的T-AOC檢測(cè)試劑盒，實(shí)驗(yàn)按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs的鑒定 光學(xué)顯微鏡下觀察，通過貼壁法獲取并的培養(yǎng)BMSCs細(xì)胞形態(tài)呈多邊形或不規(guī)則的梭形粘附生長，兩端具有長突起，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，見圖1A；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示， BMSCs的重要標(biāo)志物CD44和CD90的表達(dá)陽性率均大于90%，見圖1B。

圖1 大鼠BMSCs鑒定Figure 1 Identification of BMSCs in rats

2.2 BMSCs源性Exosomes的鑒定 透射電鏡下觀察，提取到的Exosomes形態(tài)呈圓形或橢圓形，直徑在40～100 nm，具有較為完整包膜的小囊泡，見圖2A。Western blot檢測(cè)顯示其表達(dá)Exosomes特異性蛋白CD63和CD9，見圖2B。

圖2 BMSCs源性Exosomes的鑒定Figure 2 Identification of exosomes derived from BMSCs

2.3 大鼠子宮HE染色 空白組和假手術(shù)組大鼠子宮結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞排列規(guī)則，未見紅細(xì)胞和炎細(xì)胞浸潤。模型組和對(duì)照組大鼠子宮結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞排列不規(guī)則，腺體出現(xiàn)擴(kuò)張或結(jié)構(gòu)不清晰，可見紅細(xì)胞和炎細(xì)胞浸潤。治療組和左氧氟沙星組大鼠子宮結(jié)構(gòu)基本正常，細(xì)胞排列較規(guī)則，少許紅細(xì)胞和炎細(xì)胞浸潤，見圖3。

圖3 子宮組織HE染色(200×)Figure 3 HE staining of uterine tissue

2.4 大鼠外周血白細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果 模型組大鼠外周血白細(xì)胞數(shù)、中心粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞較空白組均明顯升高(P<0.05)。治療組大鼠外周血白細(xì)胞數(shù)、中心粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞均較模型組出現(xiàn)降低，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。治療組大鼠除中心粒細(xì)胞數(shù)要高于左氧氟沙星組(P<0.05)，其余外周血白細(xì)胞檢測(cè)指標(biāo)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠外周血白細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果Table 1 Detection results of peripheral blood leukocytes in rats of each group

2.5 大鼠血清炎癥因子檢測(cè)結(jié)果 模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6和 IL-8的濃度水平值均較空白組明顯升高(P<0.05)。治療組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6和 IL-10的濃度水平值均較模型組出現(xiàn)降低，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療組大鼠除血清IL-1β濃度水平值高于左氧氟沙星組(P<0.05)，其余炎癥因子血清濃度水平值相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血清炎癥因子檢測(cè)結(jié)果比較Table 2 Comparison of serum inflammatory factors in each group

2.6 大鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)評(píng)估結(jié)果 模型組大鼠SOD和T-AOC數(shù)值均較空白組明顯降低，而MDA數(shù)值則明顯升高(P<0.05)。治療組大鼠SOD和T-AOC數(shù)值均較模型組出現(xiàn)升高，而MDA數(shù)值則出現(xiàn)降低，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，同左氧氟沙星組相比，治療組大鼠SOD、T-AOC和 MDA數(shù)值比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見表3。

表3 各組大鼠氧化應(yīng)激檢測(cè)結(jié)果比較Table 3 Comparison of the test results of oxidative stress in rats of each group

3 討論

BMSCs是具有多向分化潛能和自我更新能力的多能干細(xì)胞。在合適的條件下，BMSCs可以被誘導(dǎo)分化為多種組織細(xì)胞。與其他干細(xì)胞不同，BMSCs在基因上更穩(wěn)定，在體外環(huán)境下存活時(shí)間更長，且BMSCs還具有免疫調(diào)節(jié)作用。因而BMSCs成為多種疾病干細(xì)胞治療的理想選擇，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景[10]。BMSCs發(fā)揮治療效應(yīng)的機(jī)制非常復(fù)雜，目前已知的是，其除了能夠移植到受損器官上并進(jìn)行分化來發(fā)揮其治療作用，還可能通過以下方式來發(fā)揮其生物學(xué)作用[11-12]：①分泌可溶性因子(細(xì)胞因子、生長因子、激素)的旁分泌活性。②細(xì)胞與細(xì)胞相互作用，在細(xì)胞之間形成納米管隧道。③分泌含有蛋白質(zhì)和RNA的囊泡。Exosomes是大多數(shù)原核和真核細(xì)胞(包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等)釋放的納米級(jí)微泡(直徑30～100 nm)，將其功能效應(yīng)物(如mRNAs、miRNAs和蛋白質(zhì)) 轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞以調(diào)節(jié)生理和病理過程。Exosomes是傳遞膜封閉信號(hào)分子和基因產(chǎn)物的關(guān)鍵載體，直接參與細(xì)胞間的信號(hào)傳遞，是機(jī)體旁分泌的重要組成部分[13]。BMSCs來源的Exosomes具有抗凋亡、免疫調(diào)節(jié)、抗炎和促血管生成的特性。Jun等[14]研究發(fā)現(xiàn)，BMSC源性Exosomes能增強(qiáng)自噬相關(guān)蛋白LC3IIB和Beclin-1的表達(dá)，促進(jìn)自噬體的形成，進(jìn)而抑制脊髓損傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)其功能行為恢復(fù)。Jiang等[15]通過體外研究發(fā)現(xiàn)，BMSC源性Exosomes通過抑制TGF-TGF/Smad信號(hào)通路，能夠有效促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合。因此，Exosomes可能是BMSCs發(fā)揮其生物學(xué)效能的重要工具和途徑。

PID的發(fā)病機(jī)制主要是由于免疫因素影響下病原體入侵感染，導(dǎo)致機(jī)體炎性介質(zhì)和自由基的異常分泌活化，進(jìn)而產(chǎn)生一系列病理生理改變。根據(jù)美國疾病控制和預(yù)防中心的指導(dǎo)方針[16]，臨床使用抗生素是PID治療的首選。然而，大多數(shù)患者經(jīng)過長期治療后往往發(fā)生細(xì)菌耐藥性。因此，開發(fā)具有良好療效、低副作用的天然藥物對(duì)預(yù)防PID具有重要意義。氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是PID的最主要的病理生理機(jī)制[17]。PID的發(fā)病過程中，機(jī)體活性氧(ROS)的過度產(chǎn)生導(dǎo)致氧化與抗氧化失衡而引起氧化應(yīng)激狀態(tài)，最終導(dǎo)致組織細(xì)胞損傷。氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)相輔相成，炎癥是白細(xì)胞對(duì)挑戰(zhàn)組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)的因素(包括氧化應(yīng)激引起的因素)的反應(yīng)，過度的炎癥反應(yīng)會(huì)損傷組織細(xì)胞，導(dǎo)致大量氧自由基產(chǎn)生及NO的合成釋放下降[18]。ROS也被證實(shí)是多個(gè)炎癥信號(hào)通路的啟動(dòng)者和調(diào)節(jié)者，通過激活Nrf2、NF-κB、ASK1、AP-1、補(bǔ)體等炎癥信號(hào)通路，進(jìn)而增強(qiáng)炎癥應(yīng)答[19-20]。因此，有效對(duì)抗氧化應(yīng)激，改善炎癥反應(yīng)已成為PID治療領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。

BMSCs來源的Exosomes在對(duì)抗氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)方面具有良好的生物學(xué)特性。Campbell等[21]研究發(fā)現(xiàn)在氧化應(yīng)激損傷后，BMSCs源性的Exosomes能顯著降低了心臟干細(xì)胞(Cardiac stem cells，CSCs)的凋亡率和ROS的產(chǎn)生。Zheng等[22]通過研究類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠后發(fā)現(xiàn)，BMSCs源性的Exosomes通過傳遞上調(diào)miR-192-5p的表達(dá)來抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)。因此，本次實(shí)驗(yàn)采用BMSCs來源的Exosomes來對(duì)PID模型大鼠進(jìn)行干預(yù)研究。我們采用全骨髓貼壁篩選培養(yǎng)法分離和純化大鼠骨髓組織中的 BMSCs，通過顯微鏡觀察和干細(xì)胞表型分析獲得的細(xì)胞是BMSCs。然后通過ExoQuick-TC法從大鼠BMSCs培養(yǎng)基上清中分離Exosomes。通過透射電鏡觀察其形態(tài)以及Western blot檢測(cè)其表達(dá)的外泌體特異性分子標(biāo)記，證實(shí)了為BMSCs源性Exosomes。隨后我們經(jīng)腹腔注射BMSCs源性Exosomes進(jìn)行干預(yù)。HE染色結(jié)果顯示，治療組大鼠子宮組織充血和炎癥細(xì)胞浸潤等病理變化與左氧氟沙星組大鼠相近，而較未經(jīng)任何干預(yù)的模型組有明顯改善。這一研究結(jié)果提示BMSCs源性Exosomes對(duì)于PID模型大鼠具有較好的治療作用，能夠改善子宮充血水腫和炎癥反應(yīng)。

TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的檢測(cè)可作為臨床上判斷炎癥反應(yīng)嚴(yán)重程度的生物學(xué)指標(biāo)[23-24]。本研究中，PID模型大鼠存在明顯全身性炎癥反應(yīng)，而子宮是PID過程中最容易受累的靶器官，因而也會(huì)導(dǎo)致子宮發(fā)生比較明顯的炎癥反應(yīng)。而治療組大鼠外周血炎癥細(xì)胞數(shù)量較未經(jīng)任何干預(yù)的模型組出現(xiàn)降低，且血清中相關(guān)炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和 IL-8的表達(dá)也發(fā)生明顯降低。由于左氧氟沙星為廣譜抗生素，是目前治療PID的常用藥，具有良好的抗感染炎癥效能。同左氧氟沙星組相比，治療組大鼠除中心粒細(xì)胞數(shù)和血清IL-1β濃度水平值要高于左氧氟沙星組，其余外周血白細(xì)胞和血清炎癥因子比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這表明BMSCs源性Exosomes能有效減輕PID模型大鼠的全身性炎癥反應(yīng)。氧化應(yīng)激方面，SOD是清除氧自由基和抑制組織損傷的重要抗氧化酶，MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，T-AOC代表抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶等構(gòu)成總抗氧化水平，這三者反映機(jī)體清除氧自由基的能力和氧自由基對(duì)細(xì)胞的損傷程度，是反映機(jī)體對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷能力的生物學(xué)指標(biāo)[25-26]。本研究中，PID大鼠SOD和T-AOC數(shù)值均較空白組明顯降低，而MDA數(shù)值則明顯升高，表明PID模型大鼠存在明顯的氧化應(yīng)激。而經(jīng)治療組大鼠SOD和T-AOC數(shù)值均較模型組升高， MDA數(shù)值則降低。提示BMSCs源性Exosomes能夠增強(qiáng)PID大鼠體內(nèi)的抗氧化能力，抑制ROS的過度產(chǎn)生，進(jìn)而降低機(jī)體的氧化應(yīng)激水平。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，BMSCs源性Exosomes對(duì)PID模型大鼠具有較好的治療作用，其效能可能在于Exosomes能通過細(xì)胞間傳遞效應(yīng)物質(zhì)來抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)。然而，目前關(guān)于BMSCs源性Exosomes療效的證據(jù)是多種多樣的，其具體作用機(jī)制尚待明確，隨著對(duì)Exosomes功能和作用機(jī)制的不斷研究深入，將為臨床治療PID提供新的策略。