崔亞俊,翟志文,王 超,劉永鑫,陳園園,袁懷波,嚴(yán)建兵,白 洋

(1.合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601; 2.中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所 植物基因組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗室,北京 100101; 3.中國科學(xué)院大學(xué) 生物互作卓越創(chuàng)新中心,北京 100049; 4.中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所 中國科學(xué)院-英國約翰英納斯中心植物和微生物科學(xué)聯(lián)合研究中心,北京 100101; 5.中國科學(xué)院大學(xué) 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)院,北京 100049; 6.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗室,湖北 武漢 430070)

植物根系作為植物-微生物-土壤互作的主要部位,棲息著種類繁多的微生物群落,稱之為根系微生物組[1],其中,細(xì)菌的定殖豐度最高,其他還包括真菌、卵菌、藻類、原生動物、線蟲和病毒[2-4]。根系微生物中的有益微生物可以通過直接促進(jìn)植物生長,或者幫助植物吸收水分、養(yǎng)分以適應(yīng)逆境脅迫,如熒光假單胞菌[5]、菌根真菌[6]。因此,植物根系微生物組在植物生長發(fā)育、抗逆等過程中發(fā)揮重要作用[7],被稱為植物第2個基因組[1]。近年來植物根系與微生物互作的研究逐漸增多,已是國際前沿?zé)狳c(diǎn)[8]。

研究表明,植物微生物群落的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)構(gòu)由生物群落和環(huán)境因素相互作用所決定[9]。根系微生物群落結(jié)構(gòu)由環(huán)境(如土壤、季節(jié)、地理位置、晝夜變化)、宿主(如基因型、生長階段)、微生物-微生物和植物-微生物相互作用等因素共同決定[9-10]。在擬南芥、水稻等研究中均發(fā)現(xiàn),根系微生物的組成由土壤類型決定,而宿主基因型在一定程度上決定根系微生物的比例[11-12]。在特定土壤類型及環(huán)境下,植物根系微生物組主要由植物根系分泌物和免疫代謝調(diào)控[13-14]。

玉米是世界三大糧食作物之一,不僅可以作為糧食、飼料生產(chǎn)以滿足人類的基本生活需求,同時還是用來生產(chǎn)燃料乙醇的重要生物能源材料[15]。玉米在幾千年的人工馴化過程中,產(chǎn)生了大量的遺傳變異[16],而解析不同玉米自交系的遺傳多樣性是種質(zhì)資源保護(hù)和育種的基礎(chǔ)[17]。文獻(xiàn)[18-19]通過對143個玉米自交系材料進(jìn)行根系細(xì)菌群落組成研究發(fā)現(xiàn),玉米根系細(xì)菌存在顯著遺傳力,數(shù)值在0.15～0.25之間,說明玉米基因型對其根系細(xì)菌豐度具有顯著影響。

因此,本研究選取具有不同遺傳背景的玉米自交系材料昌7-2和B73,在山東和海南試驗田種植,通過對其根系樣品16S rDNA特定片段的擴(kuò)增及高通量測序,測定其根系微生物組成。通過根系微生物組群落組成、多樣性及隨機(jī)森林分析,揭示玉米基因型和栽培環(huán)境對玉米根系微生物組的影響,并找出可以顯著響應(yīng)玉米基因型的特征細(xì)菌類群,為玉米的遺傳改良、解析遺傳多樣性提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與地點(diǎn)

試驗選用不同遺傳背景的優(yōu)良自交系昌7-2、B73,分別于2017年11—12月在海南省三亞市華中農(nóng)業(yè)大學(xué)南繁基地(109°10′E,18°21′N)和2018年5—6月在山東省東營市黃河口鎮(zhèn)(118°50′E，37°41′N)進(jìn)行種植。南繁基地試驗點(diǎn)2017年11、12月平均氣溫分別為26.2、23.2 ℃,黃河口鎮(zhèn)試驗點(diǎn)2018年5、6月平均氣溫分別為20.3、25.2 ℃。

1.2 試驗設(shè)計

南繁基地試驗點(diǎn)于2017年11月1日播種,采用起壟播種,每個基因型玉米播種1行,行長2.5 m,株距25 cm、行距80 cm。播種前氮、磷、鉀施用量均為100 kg/hm2,以復(fù)合肥方式施入。播種后30 d氮、磷、鉀追施量分別為100、15、15 kg/hm2(m(復(fù)合肥)∶m(尿素)=1∶3)。

黃河口鎮(zhèn)試驗點(diǎn)播種日期為2018年5月1日,每個基因型玉米播種1行,行長2.5 m,株距25 cm、行距80 cm。氮、磷肥分別使用尿素75 kg/hm2和磷酸二銨20 kg/hm2。肥料均在播種前撒施,然后旋耕、覆膜、播種。在播種后27 d追施60 kg/hm2磷肥。

2個試驗點(diǎn)均種植保護(hù)行。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 樣品采集

2個試驗點(diǎn)的植株均長至八葉期時取樣,海南和山東試驗點(diǎn)取樣時間分別為2017年12月6日和2018年6月12日。每次取樣時,對于每個基因型,海南試驗點(diǎn)分別選取3株、山東試驗點(diǎn)選取6株有代表性的玉米植株,將根部用自來水沖洗,再用純凈水沖洗干凈,用滅菌濾紙吸干水分,分別裝在對應(yīng)的15 mL無菌離心管內(nèi)。樣品全部凍存于冰箱。統(tǒng)一郵寄回北京實(shí)驗室,-80 ℃保存。

1.3.2 擴(kuò)增子文庫構(gòu)建及測序

在生物安全柜中將玉米根系樣品剪碎,用樣品研磨器(Precellys Evolution, Bertin Technologies, France)將樣品研磨。利用土壤DNA提取試劑盒(FastDNA SPIN Kit, MP Biomedicals)提取根系樣品總DNA。精確測定DNA質(zhì)量濃度(PicoGreen dsDNA Assay Kit, Life Technologies,USA),隨后稀釋到3.5 ng/μL。利用引物799F和1192R對細(xì)菌16S rDNA的V5～V7可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增,每個樣本一式3份,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)反應(yīng)體系為30 μL,含6 μL模板、0.75 U PrimeSTAR HS DNA聚合酶、1×PrimeSTAR緩沖液(TaKaRa, Japan),0.2 mmol/L dNTPs、10 pmol/L的帶有barcode和連接序列的正向和反向引物及適量的無菌水。經(jīng)過30 s 、98 ℃的初始變性步驟后,目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增25個循環(huán),程序為98 ℃、10 s,55 ℃、15 s,72 ℃、60 s,最后在72 ℃延伸5 min。若陰性對照中沒有出現(xiàn)擴(kuò)增條帶(沒有添加模板),則將一式3份PCR產(chǎn)物混合,磁珠純化(AMPure XP Kit,Beckman Coulter),使用Nanodrop(Nanodrop 2000c,Thermo Scientific)測定其質(zhì)量濃度,并稀釋至10 ng/μL,并作為第2輪PCR的模板。使用Illumina兼容性引物,對所有樣本進(jìn)行8個循環(huán)的重復(fù)擴(kuò)增,PCR體系及程序與第1輪PCR相同。將每個樣品的技術(shù)重復(fù)進(jìn)行混合,使用膠回收試劑盒(QIAquick Gel Extraction Kit,Qiagen, USA),用1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行切膠回收提取16S rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物。測定DNA質(zhì)量濃度(PicoGreen dsDNA Assay Kit, Life technologies, USA),每個樣品吸取200 ng并混合,然后磁珠純化2次(Agencourt AMPure XP Kit,Beckman Coulter GmbH, USA),隨后交于測序公司通過Hiseq-PE250測序平臺進(jìn)行高通量測序。

1.3.3 生物信息學(xué)分析

16S rRNA基因序列使用QIIME 1.9.1、USEARCH 10.0和內(nèi)部腳本處理。雙端序列使用FastQC過濾,并由usearch10 fastq-mergepair連接。Barcodes由usearch10-fastx-truncate提取。依據(jù)100%匹配閾值,由usearch10-unoise3挑選擴(kuò)增子序列變異體(amplicon sequence variants,ASV)。以SILVA-132-SSURef-Nr99-tax-SILVA為參考數(shù)據(jù)庫,用usearch10-uchime2-ref去除嵌合體,用USEARCH(usearch10-otutab)和自定義腳本去除非細(xì)菌序列。基于高置信度16S代表序列,由USEARCH生成ASV表。以RDP數(shù)據(jù)庫為參考數(shù)據(jù)庫,用usearch10-sintax對代表性序列進(jìn)行分類,并用usearch10-sintax-u進(jìn)行整理。

根據(jù)ASV表,使用usearch10-Alpha-div計算α多樣性,并進(jìn)行方差分析及Tukey HSD多重比較。在標(biāo)準(zhǔn)化ASV表的基礎(chǔ)上,用beta-diversity.py計算β多樣性。依據(jù)Bray-curtis距離計算得到的β多樣性,利用R語言中vegan包進(jìn)行限制性主坐標(biāo)軸分析。為了獲得可以顯著區(qū)分2種基因型玉米根系微生物組的特征細(xì)菌種類,本文使用R語言程序包的默認(rèn)參數(shù)對屬級細(xì)菌的相對豐度與玉米基因型進(jìn)行回歸計算(R package ‘random Forest’,ntree=500,使用默認(rèn)mtry=√p,其中p為屬的分類單元數(shù))。在R包“random Forest”中使用rfcv()函數(shù),以實(shí)現(xiàn)5次交叉驗證,從而確定重要特征細(xì)菌種類的數(shù)量和種類,并將其相對豐度經(jīng)Z-score標(biāo)準(zhǔn)化處理,以熱圖形式呈現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因型和種植地對β多樣性的影響

本文利用799F和1193R引物,以V5～V7區(qū)為擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域,通過16S rRNA基因擴(kuò)增和Illumina測序獲得每個根系樣品(包括根表和根內(nèi))的細(xì)菌微生物組,總共從18個樣本中測得1 902 310個高質(zhì)量序列(平均52 842個,每個樣本的序列數(shù)在32 791～86 781間波動)。本文使用Unoise去掉低豐度ASV(<8個總計數(shù)),通過對高質(zhì)量序列進(jìn)行分析,得到3 764個ASV。

通過對不同地點(diǎn)、不同基因型間根系微生物組的限制性主坐標(biāo)分析發(fā)現(xiàn),山東和海南試驗點(diǎn)間玉米根系微生物組β多樣性存在顯著差異,同時每個試驗點(diǎn)昌7-2和B73間也均存在顯著差異，結(jié)果如圖1所示,圖1中不同顏色表示不同采樣地點(diǎn)的不同基因型玉米根系微生物組的限制性主坐標(biāo)分析(CPCoA),表明玉米根系微生物組β多樣性同時受到種植地點(diǎn)和基因型的影響。進(jìn)一步分析基因型和環(huán)境變異對根系微生物組β多樣性的影響程度發(fā)現(xiàn)，兩者都可以解釋所有變異的35%,在限制性第1軸(83.47%)可以看出,海南和山東的樣品明顯分開,而在限制性第2軸(解釋變異的16.53%上可以看出昌7-2和B73的樣品在基因型之間明顯分開。結(jié)果表明,相比于基因型,根系微生物組β多樣性會在更大程度上受種植環(huán)境影響。

CPCoA1(83.47%)圖1 玉米基因型昌7-2與B73間根系微生物組β多樣性比較

2.2 基因型和種植地對組α多樣性的影響

香農(nóng)指數(shù)是將物種豐富度和物種豐度均勻度結(jié)合計算，反映生態(tài)系統(tǒng)物種多樣性的一個經(jīng)典指標(biāo)[20]。通過對不同地點(diǎn)、不同基因型間根系微生物組香農(nóng)指數(shù)的計算分析發(fā)現(xiàn),同一試驗點(diǎn)中,昌7-2和B73間物種多樣性無顯著差異,說明根系微生物組α多樣性對基因型的響應(yīng)較β多樣性不敏感。昌7-2基因型香農(nóng)指數(shù)在山東和海南種植點(diǎn)間存在顯著差異,而B73在2個試驗點(diǎn)間差異則未達(dá)到顯著水平。種植地點(diǎn)對玉米根系α多樣性的影響顯著大于基因型對其影響,結(jié)果如圖2所示,圖2中,箱線圖中橫線代表樣品對應(yīng)數(shù)值的中位數(shù);上、下邊分別表示上四分位數(shù)和下四分位數(shù);上、下豎線分別代表1.5倍的上、下四分位數(shù);箱型圖上標(biāo)有相同小寫字母表示組間差異未達(dá)到顯著水平(P<0.05)。

圖2 玉米基因型昌7-2與B73間根系微生物組香農(nóng)指數(shù)比較

2.3 不同基因型和種植地根系微生物豐度比較

通過對玉米根系各種細(xì)菌相對豐度的計算發(fā)現(xiàn),在2個種植地和2種基因型玉米的根系中,優(yōu)勢菌群均為Proteobacteria和Actinobacteria,2種細(xì)菌豐度平均占細(xì)菌總豐度的90%左右。2種玉米基因型根系中,Firmicutes在海南試驗點(diǎn)玉米根系中的相對豐度顯著大于山東試驗點(diǎn),說明海南試驗點(diǎn)生態(tài)環(huán)境可能更有利于Firmicutes在玉米根系生長；昌7-2基因型玉米根系在山東和海南試驗點(diǎn)間各門水平細(xì)菌相對豐度差異顯著大于B73。另一方面,山東試驗點(diǎn)中,昌7-2和B73基因型玉米根系中各門水平細(xì)菌相對豐度差異較小,而海南試驗點(diǎn)則較大,具體表現(xiàn)為昌7-2基因型玉米根系富集更多Proteobacteria,而較少富集Actinobacteria,結(jié)果如圖3a所示。

山東試驗點(diǎn)中,玉米根系細(xì)菌優(yōu)勢菌屬為Streptomyces、Lysobacter、Nocardioides、Sphingomonas、Ensifer和Bacillus,而在海南試驗點(diǎn)中,玉米根系細(xì)菌優(yōu)勢菌屬為Bacillus、Humibacter、Burkholderia和Streptomyces,反映了不同種植地點(diǎn)對玉米根系細(xì)菌種類的顯著影響。山東試驗點(diǎn)中,B73基因型玉米根系Streptomyces和Lysobacter相對豐度顯著高于昌7-2,而在海南試驗點(diǎn)中則是Humibacte和Streptomyces,結(jié)果如圖3b所示。

圖3 玉米基因型昌7-2與B73間定殖根系細(xì)菌相對豐度比較

2.4 基因型間存在顯著定殖差異的細(xì)菌類群

為了進(jìn)一步研究基因型間根系微生物組差異,排除栽培環(huán)境因素的影響,本文將山東和海南種植的2種基因型玉米共18個根系微生物樣本合并分析。根據(jù)每個屬在樣品中的相對豐度中位數(shù),選取相對豐度在0.5%以上的屬為常見的共有屬,這些屬的相對豐度占全部細(xì)菌定殖豐度的79.21%。對這29個屬利用隨機(jī)森林分類器構(gòu)建模型,以基因型為因變量,以屬水平的細(xì)菌類群相對豐度為自變量。分析計算得出該分類器的錯誤率為22.22%,表明分類器的精確性較高。通過進(jìn)行5次交叉驗證表明,當(dāng)利用29個屬進(jìn)行基因型間差異細(xì)菌類群的判別時,隨機(jī)森林分類器的正確率最高。

根據(jù)平均降低精確性,本文選取29種菌中平均降低精確性大于0的細(xì)菌屬作為判別2種基因型的特征屬,共有18種,分別屬于Rhizobiales(5種)、Actinomycetales(4種)、Xanthomonadales(3種)、Xanthomonadales(2種)以及Bacillales、Pseudomonadales、Sphingobacteriales、Sphingomonadales各1種,結(jié)果如圖4a所示。

圖4 昌7-2和B73玉米根系間具有顯著差異的特征菌

圖4a以基因型為因變量,以屬水平的細(xì)菌類群相對豐度為自變量,應(yīng)用隨機(jī)森林分析判別方法確定了29個可以區(qū)分基因型的細(xì)菌種類,不同細(xì)菌種類對模型精度的重要性按降序排列;插圖表示將輸入的細(xì)菌種類數(shù),按不同的重要性,與基因型進(jìn)行回歸得出的交叉驗證錯誤率。具體屬名及在不同基因型的玉米根系相對豐度熱圖如圖4b所示,所有數(shù)據(jù)經(jīng)Z-score標(biāo)準(zhǔn)化處理。所列舉屬水平細(xì)菌在玉米根系的豐度可能受到宿主遺傳多樣性的影響。

3 討 論

3.1 栽培環(huán)境對微生物組的影響

植物根系作為植物-微生物-土壤互作的主要部位,既負(fù)責(zé)植株在土壤中的錨定、吸收水分和養(yǎng)分、物質(zhì)儲存,同時也生長有種類繁多的微生物,是植物與土壤微生物互作的主要部位[21]。本研究選取種植于不同種植地的不同基因型玉米,通過高通量測序,測定其根系細(xì)菌微生物組結(jié)構(gòu),通過限制性主坐標(biāo)分析發(fā)現(xiàn),不同種植地和不同基因型玉米根系細(xì)菌微生物組均存在顯著差異,說明植物根系微生物組同時受到土壤環(huán)境和宿主基因型的影響。同時,相比于基因型,種植地可以解釋更多的根系微生物組變異,說明玉米根系微生物組對栽培環(huán)境變化的響應(yīng)程度大于基因型,這與以往的研究結(jié)果相一致[11-12]。目前認(rèn)為植物根系從土壤中招募細(xì)菌的機(jī)制為兩步選擇假說。首先,根系分泌物和細(xì)胞壁促進(jìn)了一部分土壤微生物的生長,從而導(dǎo)致根際細(xì)菌群落組成的變化和細(xì)菌數(shù)量的顯著增多;然后,宿主與微生物的相互作用進(jìn)一步調(diào)節(jié)根系內(nèi)細(xì)菌群落的生長和比例[11,22]。因此,根系微生物的組成可能主要由土壤類型決定,而宿主基因型在一定程度上影響特定根系微生物的生長和定殖量,在擬南芥、水稻等研究中也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)論[11-12]。

3.2 微生物組對栽培環(huán)境的響應(yīng)

雖然生態(tài)環(huán)境是影響植物根系微生物組的主要因素,但在特定的土壤類型及環(huán)境下,植物基因型便成為影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的主要因素[23]。玉米在幾千年的人工馴化過程中產(chǎn)生了大量的遺傳變異[16],某些參與植物根系分泌物或免疫代謝的基因變異,會導(dǎo)致根系招募特定微生物的能力發(fā)生改變[11-14,24]。在本研究結(jié)果中,玉米根系細(xì)菌微生物組在不同基因型間存在顯著差異,說明來自不同遺傳背景的玉米植株在招募根系微生物方面也存在遺傳多樣性,與文獻(xiàn)[19]的研究結(jié)果一致。本文通過分析香農(nóng)指數(shù)和各門水平細(xì)菌相對豐度在山東和海南試驗點(diǎn)間的差異,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),昌7-2均顯著大于B73,說明昌7-2更易受到環(huán)境影響,而B73根系微生物組遺傳力可能更高。以往研究表明,植物免疫代謝、根系分泌物以及磷饑餓響應(yīng)代謝參與植物根系微生物組的組裝,文獻(xiàn)[25]發(fā)現(xiàn)擬南芥磷饑餓響應(yīng)(phosphate starvation respones,PSR)相關(guān)基因參與根際微生物群落的正?！敖M建”,其中關(guān)鍵因子PHR1同時調(diào)控PSR和免疫響應(yīng)。缺鐵脅迫下,擬南芥根部特異性轉(zhuǎn)錄因子MYB72可促進(jìn)以香豆素東莨菪亭為主的根系分泌物,進(jìn)而影響根系有害微生物的生長[26]。昌7-2和B73根系微生物組存在顯著差異且受栽培環(huán)境改變的影響程度不同,可能與其在以上幾個生理代謝途徑的差異有關(guān)。

3.3 宿主對細(xì)菌類群豐度的影響

玉米根系微生物組主要由Proteobacteria等組成[18-19]。有研究表明,根際細(xì)菌在植物根系的定殖變化與其自身特定生理代謝活性有關(guān),如氨基酸、有機(jī)酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和糖苷水解酶等[27]。本文利用根系細(xì)菌的相對豐度,采用隨機(jī)森林模型,找到若干與玉米基因型顯著相關(guān)的特征細(xì)菌種類。結(jié)果表明,基因型辨識度較高的屬為Rhizobium、Sphingobacterium等。另外,Streptomyces在圖3b中也顯示出基因型間顯著差異,說明這些根系細(xì)菌相對豐度受宿主基因型影響的程度較高。許多放線菌可以產(chǎn)生抗生素,從而幫助植物抑制病原菌生長[28-29]。同時,Rhizobium和Sphingobacterium對宿主的促生作用也多有報道,如固氮、分解根系有毒物質(zhì)等[30-31]。以上結(jié)果表明,受植物宿主基因型顯著調(diào)控的根系細(xì)菌,可能在宿主響應(yīng)環(huán)境脅迫過程中具有明顯促生作用,從而顯著受到宿主的主動調(diào)控,這可能是植物與微生物長期協(xié)同進(jìn)化的結(jié)果[27-32]。

4 結(jié) 論

本研究選取種植于不同地點(diǎn)、具有不同遺傳背景的玉米自交系材料昌7-2和B73,并對其根系微生物組進(jìn)行高通量測序。研究結(jié)果表明,玉米根系微生物組對栽培環(huán)境變化的響應(yīng)程度大于基因型,而不同基因型玉米根系微生物組對栽培環(huán)境變化的響應(yīng)程度也不同,同時利用隨機(jī)森林分析發(fā)現(xiàn)若干豐度顯著受宿主基因型影響的細(xì)菌類群。