馬寧 徐寧 尹冬 鄭萍 劉偉偉 王國(guó)鳳 惠媛 成興波

我國(guó)目前約有1.096億糖尿病(DM)患者，居全球首位[1]，其中約25%～40%可發(fā)展為糖尿病腎病(DKD)[2]，是慢性腎臟疾病(CKD)和終末期腎病的主要原因[3-4]，也成為我國(guó)住院CKD患者的主要病因[4]。DKD是由多種因素協(xié)同作用導(dǎo)致[5]，最終出現(xiàn)大量蛋白尿、腎功能不全甚至腎衰竭[6]，臨床只能對(duì)癥治療，無(wú)有效的根治方法[7]，預(yù)后差。因此早期發(fā)現(xiàn)及治療DKD尤為重要?，F(xiàn)有研究表明通過(guò)相關(guān)組織微小RNA(miRNA，miR)譜的差異表達(dá)可進(jìn)行2型糖尿病(T2DM)的早期診斷[8]，通過(guò)靶向炎癥、纖維化和氧化應(yīng)激等相關(guān)基因與靶mRNA的3’-非翻譯區(qū)(UTR)結(jié)合，降低蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而對(duì)基因表達(dá)起調(diào)控作用[9]，用于診斷或預(yù)測(cè)DKD。本研究通過(guò)探究血小板反應(yīng)蛋白(TSP)-1 mRNA和miR-194與2型糖尿病腎病的關(guān)系，探討其在評(píng)估2型糖尿病腎病中的作用。

對(duì)象與方法

1.對(duì)象：2019年1月～6月在連云港市第一人民醫(yī)院內(nèi)分泌科住院的T2DM患者167例(T2DM組)，其中男84例，女83例，年齡29～81歲，平均年齡(59.34±12.94)歲。T2DM的診斷符合1999年WHO糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)。DKD的診斷符合2017年中國(guó)糖尿病指南診斷標(biāo)準(zhǔn)。隨機(jī)選擇同期于我院門(mén)診健康體檢者163例為健康對(duì)照組，其中男81例，女82例，年齡27～84歲，平均年齡(54.76±18.77)歲。兩組受試者年齡、性別比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)1型糖尿病及糖尿病急性并發(fā)癥；(2)自身免疫性疾病或其他內(nèi)分泌系統(tǒng)代謝疾病如腎上腺皮質(zhì)功能異常、甲狀腺功能異常等；(3)原發(fā)性腎病或繼發(fā)性腎臟疾??；(4)存在可能影響尿液檢查結(jié)果或腎功能的疾病；(5)嚴(yán)重心血管疾病、肝腎功能不全、腫瘤；(6)妊娠、哺乳期或長(zhǎng)期服用避孕藥。按照2007年美國(guó)國(guó)家腎臟基金會(huì)(NKF)制定的《腎臟病生存質(zhì)量指導(dǎo)糖尿病和慢性腎臟病臨床實(shí)踐指南和推薦》提出的標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)尿微量白蛋白/肌酐比值(UACR)將T2DM患者分為正常白蛋白尿組(UACR<30 mg/g,56例)、微量白蛋白尿組(30 mg/g≤UACR<300 mg/g，55例)及大量白蛋白尿組(UACR≥300 mg/g，56例)。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有受試者或其親屬均簽署知情同意書(shū)。

2.方法

(1)一般資料和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果收集：收集所有受試者的一般資料，包括性別、年齡、BMI、血壓。所有受試者采血前均清淡飲食，隔夜空腹12 h，次晨抽取肘靜脈血5 ml檢測(cè)空腹血漿葡萄糖(FPG)、總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、空腹胰島素(Fins)、空腹C肽(FCP)、肌肝(Cr)、胱抑素C(Cys-C)、血尿酸(SUA)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、尿微量白蛋白水平，計(jì)算UACR。

(2)miR-194水平檢測(cè)：嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，第一步為使用MagMAXTMmirVanaTMRNA Isolation Kit試劑盒在Kingfisher Flex核酸提取工作站上提取核酸。第二步為使用含有探針的TaqManTMUniversal MasterMix Ⅱ進(jìn)行熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)反應(yīng)，針對(duì)人miR-194-5p序列的特異性引物(購(gòu)自Applied Biosystems)，使用cel-miR-39為外參對(duì)照[序列UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG(Mature miRNA Sequence]在Invitrogen下單合成。依據(jù)2-△△Ct公式計(jì)算T2DM組相對(duì)于健康對(duì)照組受試者血清中miR-194水平的相對(duì)變化倍數(shù)。

(3)TSP-1 mRNA的檢測(cè)：使用MagMAXTMmirVanaTMRNA Isolation Kit試劑盒在Kingfisher Flex核酸提取工作站上提取核酸。使用人GAPDH為外參對(duì)照。依據(jù)2-△△Ct公式計(jì)算T2DM組相對(duì)于健康對(duì)照組受試者血清中TSP-1 mRNA水平的相對(duì)變化倍數(shù)。

結(jié) 果

1.健康對(duì)照組和T2DM組受試者一般資料、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果、miR-194及TSP-1 mRNA表達(dá)水平比較：T2DM組患者收縮壓、舒張壓、FPG、HbA1c、TC、TG、LDL-C、SUA、miR-194及TSP-1 mRNA水平均高于健康對(duì)照組，BMI、HDL-C水平均低于健康對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 健康對(duì)照組和T2DM組受試者一般資料、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果、miR-194及TSP-1 mRNA表達(dá)水平比較

2.不同UACR組DKD患者miR-194及TSP-1 mRNA表達(dá)水平比較：TSP-1 mRNA及miR-194表達(dá)水平在正常白蛋白尿組、微量白蛋白尿組及大量白蛋白尿組患者中比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同UACR組DKD患者miR-194及TSP-1 mRNA表達(dá)水平比較

3.T2DM患者miR-194及TSP-1 mRNA表達(dá)水平與各因素的相關(guān)分析：Pearson或Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，T2DM患者TSP-1 mRNA與Cys-C(r=0.281,P=0.021)、UACR(r=0.317，P=0.009)呈正相關(guān)，miR-194與UACR(r=0.405,P=0.003)呈正相關(guān)。多元線性逐步回歸分析結(jié)果顯示，T2DM患者Cys-C(β=0.578,P=0.021)、UACR(β=0.001,P=0.009)是TSP-1 mRNA的獨(dú)立影響因素，UACR(β=0.005,P=0.028)是miR-194的獨(dú)立影響因素。

4.2型糖尿病腎病診斷價(jià)值的評(píng)估：ROC曲線分析結(jié)果顯示，TSP-1 mRNA及miR-194診斷2型糖尿病腎病的ROC曲線下面積(AUC)分別為0.756(95%CI0.620～0.893，P<0.01)和0.584(95%CI0.421～0.748，P<0.01)，二者均對(duì)2型糖尿病腎病具有一定的診斷評(píng)估價(jià)值。

討 論

1990年Good等[10]第一次成功在人體血小板中分離出TSP-1，這是一種內(nèi)源性抗血管生成因子[11-12]，與腎臟疾病關(guān)系密切[13-14],可能參與糖尿病的發(fā)生[15]。其在正常成人腎臟中分布很少，但當(dāng)機(jī)體處于高糖狀態(tài)、發(fā)生炎性反應(yīng)或早期間質(zhì)纖維化時(shí)，其表達(dá)水平明顯升高[16-17]，尤其在缺血-再灌注腎損傷、肥胖和糖尿病相關(guān)性腎病中[18-19]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明TSP-1基因和蛋白在糖尿病腎病大鼠腎組織中高表達(dá)，后期開(kāi)始下調(diào)，PEDF基因和蛋白表達(dá)下調(diào)，且呈遞減趨勢(shì)[20]。如果敲除TSP-1，則能降低糖尿病動(dòng)物模型的尿蛋白水平和腎功能損傷情況[21]。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)在T2DM微血管病變患者血清中，TSP-1表達(dá)水平較高[22]，推測(cè)其參與了DKD的病理生理過(guò)程[23]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)TSP-1 mRNA在T2DM患者血清中表達(dá)水平明顯升高，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)T2DM組患者收縮壓、舒張壓、FPG、HbA1c、TC、TG、LDL-C、SUA水平均高于健康對(duì)照組，與既往文獻(xiàn)結(jié)論一致[24]。在不同程度尿微量白蛋白DM患者中，TSP-1mRNA表達(dá)水平差異也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，TSP-1 mRNA與Cys-C、UACR呈正相關(guān)，提示TSP-1 mRNA參與DKD病理生理過(guò)程。多元線性逐步回歸分析結(jié)果顯示，Cys-C和UACR是TSP-1 mRNA的獨(dú)立影響因素。通過(guò)應(yīng)用TargetScan、miRanda及PicTar等miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件，預(yù)測(cè)miR-194的潛在靶基因可能是TSP-1(圖1)，推測(cè)miR-194與TSP-1 mRNA參與了DKD的發(fā)病過(guò)程。

圖1 應(yīng)用預(yù)測(cè)人miR-194-5p與TSP-1 mRNA的3’-UTR 區(qū)存在較強(qiáng)的互補(bǔ)結(jié)合性(http://www.microrna.org/microrna/)

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-194在T2DM組患者中表達(dá)明顯升高，在不同UACR組患者間miR-194表達(dá)水平差異也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)分析結(jié)果顯示，miR-194與UACR呈正相關(guān)，提示miR-194參與DKD病理生理過(guò)程。多元線性逐步回歸分析顯示，UACR是miR194的獨(dú)立影響因素。目前已知一些miRNA與DKD相關(guān)，如miR-146、miR-192、miR-216、miR-377、miR-1303[25]、miR-23b[26]、miR-30a[27]及miR-21[28]。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中，miR-21、miR-29C、miR-192、miR-214和miR-433或過(guò)表達(dá)的miR-29b等miRNA均可有效減少腎纖維化[29]。但miR-194相關(guān)文獻(xiàn)較少，本研究是有益補(bǔ)充。

臨床工作中常發(fā)現(xiàn)有部分DKD患者腎臟損害較嚴(yán)重，但其微量白蛋白尿可轉(zhuǎn)為正常白蛋白尿[30-31]，且通過(guò)合理降糖仍可有效降低腎小球?yàn)V過(guò)率(GFR)[32]，說(shuō)明這些都不能完全反映真實(shí)腎臟病變。另外近年研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)Cys-C、尿α-微球蛋白、IgG或IgM、Ⅳ型膠原蛋白等與DN早期診斷有關(guān)的指標(biāo)各有利弊[33]。本研究應(yīng)用ROC曲線發(fā)現(xiàn)miR-194及TSP-1 mRNA與健康對(duì)照組的AUC分別為0.584和0.756，同時(shí)與其他相關(guān)腎臟指標(biāo)相比，具有一定的評(píng)估價(jià)值。但關(guān)于TSP-1 mRNA和miR-194調(diào)控DKD發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制尚不明確，需進(jìn)一步研究明確。