趙倩 華黎 楊銳

膽管細(xì)胞癌(CCA)起源于膽管上皮細(xì)胞，是一種高度惡性腫瘤，占肝臟原發(fā)惡性腫瘤的10%～15%，且CCA發(fā)病率逐年上升[1]。我國CCA發(fā)病率較高，占全世界發(fā)病率一半以上[2]。CCA發(fā)病隱匿，進(jìn)展迅速，手術(shù)切除率低且術(shù)后復(fù)發(fā)率高，5年生存率僅5.0%～15.0%[3]。盡管近年來CCA的治療取得了進(jìn)展，但目前尚無有效的靶向治療藥物，預(yù)后仍然較差。因此，探討CCA的發(fā)病機(jī)制，尋找潛在的藥物治療靶點，改善CCA患者預(yù)后尤為重要。微小RNA(miRNA,miR)是一類長度約為19～25 nt的內(nèi)源性非編碼RNA，其主要通過與靶mRNA的3’-非翻譯區(qū)(UTR)結(jié)合而抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄后翻譯或促進(jìn)靶基因降解，參與細(xì)胞生長、增殖、分化和凋亡等重要生物學(xué)過程，其中部分miRNA參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移等過程[4]。目前研究表明miR-144參與了多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Yin等[5]報道m(xù)iR-144在乳腺癌中表達(dá)降低，其可通過調(diào)節(jié)靶基因CEP55的表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移[5]。王開瓊等[6]的研究結(jié)果表明，miR-144在胰腺癌細(xì)胞SW1990中呈低表達(dá)，高表達(dá)miR-144可通過PI3K通路抑制胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。目前miR-144在CCA中的研究較少。本研究主要探討miR-144對CCA細(xì)胞系HCCC-9810細(xì)胞和CCLP1細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲的影響，并分析其對PI3K信號通路的影響，旨在為揭示CCA的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

材料與方法

1.材料：CCK8試劑盒(Dojindo)、Matrigel(BD公司)、膠回收試劑盒(Takara)、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitroge)、慢病毒介導(dǎo)(pCDH)-CMV-EF1-copGFP(SBI公司)、BCA蛋白定量檢測試劑盒(上海生工)、Fast Start Universal SYBR Green Master(Rox)(Roche公司)、EcoRI和BamHI限制性內(nèi)切酶(Thermo Scientific公司)、胎牛血清(FBS)(Invitrogen)、DMEM高糖培養(yǎng)液(Hyclone公司)。CCA細(xì)胞系HCCC-9810和CCLP1細(xì)胞及人胚胎腎細(xì)胞(HEK293T)購自中國細(xì)胞典藏委員會細(xì)胞庫。

2.方法

(1)細(xì)胞的培養(yǎng)和質(zhì)粒的構(gòu)建：HEK293T細(xì)胞以含10%的FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。從HEK293T細(xì)胞基因組中采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增編碼miR-144前體(pre-miR-144)的基因序列，克隆入pCDH-CMV-EF1-copGFP載體的BamHⅠ/EcoRⅠ位點。pre-miR-144的PCR反應(yīng)引物為5’﹣3’，上游引物為AAAGAATTCGAGCAGAGAGCTTCTTGGGC，下游引物為AAAGGATCCTCCAGCCCTGACCTGTCCT，PCR反應(yīng)條件：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s；55 ℃ 60 s；72 ℃ 1 min，共32個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸5 min。經(jīng)雙酶切后，行電泳、膠回收，將目的片段pre-miR-144和pCDH-CMV-EF1-copGFP片段進(jìn)行連接，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，并對質(zhì)粒進(jìn)行篩選和鑒定。

(2)慢病毒的包裝、CCA穩(wěn)轉(zhuǎn)株的建立及驗證：利用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑將主質(zhì)粒(pCDH-CMV-EF1-copGFP或PCDH-miR-144)與輔助質(zhì)粒(Rec、TAT、Gag、Vsvg)共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。收集濃縮包裝好的病毒和空病毒載體，分裝后于-80 ℃保存?zhèn)溆?。培養(yǎng)CCA細(xì)胞系HCCC-9810細(xì)胞和CCLP1細(xì)胞，細(xì)胞融合度達(dá)到50%時，分別加入適量病毒(miR-144 HCCC-9810組和miR-144 CCLP1組)及空病毒載體(Vector HCCC-9810組和Vector CCLP1組)，感染后的細(xì)胞擴(kuò)增72 h后觀察綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)，通過流式細(xì)胞儀檢測病毒對細(xì)胞的感染率。感染的細(xì)胞擴(kuò)增后，通過流式分選儀分選穩(wěn)轉(zhuǎn)株。采用莖環(huán)引物法檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞中miRNA的表達(dá)水平。

(3)CCK-8法檢測細(xì)胞的增殖情況：收集對數(shù)生長期的HCCC-9810細(xì)胞和CCLP1細(xì)胞，分別用培養(yǎng)液稀釋后調(diào)整其濃度，96孔板每孔加入同等數(shù)量的細(xì)胞，培養(yǎng)至相應(yīng)時間點，每孔加CCK8 10 μl，于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)0.5～4.0 h，450 nm波長處測量吸光度OD值，以測得的miR-144組OD值減Vector組OD值即為該細(xì)胞的相對數(shù)。

(4)劃痕實驗：6孔板每孔接種約5×105個細(xì)胞，每組設(shè)3個復(fù)孔，細(xì)胞培養(yǎng)過夜后，以槍頭垂直于標(biāo)記線劃痕，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗脫脫落的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)液，顯微鏡下拍照測量，然后放置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，連續(xù)觀察細(xì)胞的遷移情況，選擇不同的時間點(0 h、36 h)拍照，采用Image J軟件計算劃痕愈合的面積表示細(xì)胞遷移面積。

(5)Transwell侵襲實驗：基質(zhì)膠和無血清培養(yǎng)液按1∶5稀釋，每孔加入50 μl稀釋后的基質(zhì)膠，均勻鋪滿內(nèi)室底部，培養(yǎng)箱中放置1～2 h，每孔加入等量細(xì)胞懸液，下室加入500 μl含10% FBS的完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，達(dá)到培養(yǎng)時間后，用棉簽擦去上室基質(zhì)膠和細(xì)胞，室溫下4%多聚甲醛固定15 min，清洗后加入0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS漂洗3次，倒置顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取多個視野進(jìn)行統(tǒng)計并拍照。

(6)蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot)檢測：提取細(xì)胞總蛋白，使用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，SDS-PAGE法電泳與轉(zhuǎn)膜，孵育相應(yīng)的一抗、二抗，洗膜后使用辣根過氧化物酶HRP-ECL發(fā)光法曝光進(jìn)行分析與掃描，檢測MMP-2、p-AKT、AKT蛋白表達(dá)水平。

結(jié) 果

1.慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建情況：慢病毒載體構(gòu)建成功后感染HCCC-9810和CCLP1細(xì)胞，在光學(xué)顯微鏡下觀察顯示轉(zhuǎn)染成功(圖1、2)，轉(zhuǎn)染率>90%。miR-144 HCCC-9810組和miR-144 CCLP1組miR-144的表達(dá)水平分別高于Vector HCCC-9810組和Vector CCLP1組(0.162±0.006比2.754±0.103，0.367±0.025比5.322±0.193，P均<0.01)。

圖1 慢病毒感染的HCCC-9810細(xì)胞(A：感染空病毒載體的光鏡圖；B:感染慢病毒miR-144載體的光鏡圖；C：感染空病毒載體的熒光圖；D：感染慢病毒miR-144載體的熒光圖；×200)

圖2 慢病毒感染的CCLP1細(xì)胞(A：感染空病毒載體的光鏡圖；B:感染慢病毒miR-144載體的光鏡圖；C：感染空病毒載體的熒光圖；D：感染慢病毒miR-144載體的熒光圖；×200)

2.miR-144對CCA細(xì)胞增殖影響：miR-144 HCCC-9810組培養(yǎng)48 h及72 h后細(xì)胞相對數(shù)均低于同期Vector HCCC-9810組(0.537±0.081比0.750±0.100， 0.857±0.140比1.333±0.153，P均<0.05)。見圖3A。miR-144 CCLP1組培養(yǎng)48 h及72 h后細(xì)胞相對數(shù)均低于同期Vector CCLP1組(0.63±0.118比0.85±0.062，1.23±0.167比1.85±0.229，P均<0.05)。見圖3B。

圖3 miR-144對CCA細(xì)胞增殖的影響(A：HCCC-9810細(xì)胞；B：CCLP1細(xì)胞；aP<0.05)

3.miR-144對CCA細(xì)胞遷移能力的影響：36 h后可觀察到Vector HCCC-9810組、miR-144 HCCC-9810組及Vector CCLP1組、miR-144 CCLP1組分別較同組0 h時劃痕愈合面積減少，說明實驗成功。36 h后miR-144 HCCC-9810組和miR-144 CCLP1組細(xì)胞的遷移面積分別較Vector HCCC-9810組和Vector CCLP1組減少(67.76±9.36比27.14±8.17，91.27±9.63比44.72±6.38，P均<0.01)。見圖4、5。

圖4 HCCC細(xì)胞劃痕實驗光鏡結(jié)果(A、C：Vector HCCC-9810組;B、D:miR-144 HCCC-9810組;A、B:培養(yǎng)0 h；C、D：培養(yǎng)36 h；×200)

圖5 CCLP1細(xì)胞劃痕實驗光鏡結(jié)果(A、C：Vector CCLP1組;B、D:miR-144 CCLP1組;A、B:培養(yǎng)0 h；C、D：培養(yǎng)36 h；×200)

4.miR-144對CCA細(xì)胞侵襲能力的影響：36 h后對4組細(xì)胞光鏡下拍照，結(jié)果顯示miR-144 HCCC-9810組和miR-144 CCLP1組細(xì)胞比例明顯低于Vector HCCC-9810組和Vector CCLP1組[(136±6)%比(73±3)%，(172±7)%比(81±4)%，P均<0.05]。見圖6。

圖6 4組細(xì)胞侵襲實驗光鏡結(jié)果(A:Vector HCCC-9810組；B:Vector CCLP1組；C:miR-144 HCCC-9810組；D:miR-144 CCLP1組；結(jié)晶紫染色，×200)

5.miR-144對CCA細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)指標(biāo)的影響：Western Blot檢測結(jié)果顯示，miR-144 HCCC-9810組和miR-144 CCLP1組細(xì)胞中MMP-2表達(dá)水平均明顯低于Vector HCCC-9810組和Vector CCLP1組(1.87±0.16比0.93±0.09，1.68±0.14比0.81±0.06，P均<0.05)，p-AKT表達(dá)水平均明顯低于Vector HCCC-9810組和Vector CCLP1組(1.98±0.19比0.98±0.08，1.03±0.10比0.23±0.03，P均<0.05)，AKT表達(dá)水平與Vector HCCC-9810組和Vector CCLP1組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(1.32±0.12比1.34±0.14,1.48±0.15比1.59±0.14，P均>0.05)。見圖7。

圖7 Western Blot 驗證miR-144對CCA細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)指標(biāo)的影響

討 論

腫瘤的轉(zhuǎn)移包括轉(zhuǎn)移和種植兩個步驟。轉(zhuǎn)移包括局部的侵襲、侵入血管進(jìn)入體循環(huán)、循環(huán)系統(tǒng)中存活和外侵。種植的過程包括腫瘤細(xì)胞對外環(huán)境的適應(yīng)，最終形成肉眼可見的腫瘤。近年來研究發(fā)現(xiàn)miRNAs幾乎參與所有與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的關(guān)鍵基因的調(diào)節(jié)，結(jié)直腸癌患者血清中miRNAs的表達(dá)水平與其復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、預(yù)后等臨床特征密切相關(guān)[7]。miRNAs可促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移也可抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。近年來miRNAs與CCA發(fā)生、發(fā)展之間關(guān)系的報道逐漸增多，一些miRNAs在CCA的發(fā)生發(fā)展過程中起著癌基因或者抑癌基因的作用[8]。miR-144的前體以miR-144/miR-451簇的形式存在，以miR-144單體發(fā)揮作用。相關(guān)研究結(jié)果表明，miR-144與喉癌、甲狀腺癌、胰腺癌、惡性間皮瘤的發(fā)病相關(guān)。Gaedcke等[9]對57例直腸癌患者的腫瘤組織與癌旁正常黏膜組織的miRNAs做芯片檢測，發(fā)現(xiàn)miR-144在直腸癌腫瘤組織中顯著下調(diào)。Kalimutho等[10]通過在結(jié)直腸癌患者的腫瘤及其排泄物中篩查出648個miRNAs，發(fā)現(xiàn)miR-144在結(jié)直腸癌患者腫瘤組織和排泄物中均顯著增加，且在其排泄物中穩(wěn)定存在，為結(jié)直腸癌的診斷、預(yù)后預(yù)測、復(fù)發(fā)監(jiān)測提供了一種新的思路。Sureban等[11]在結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116中轉(zhuǎn)染NP-siDCAMKL-1干擾片段，發(fā)現(xiàn)HCT-116的生長受到抑制，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這種抑制機(jī)制包括miR-144依賴的Notch-1表達(dá)的下調(diào)。

磷酸肌醇-3-激酶(PI3Ks)是一類連接胞內(nèi)外生長信號的激酶家族，是PI3K/Akt/mTOR信號通路成員，PI3K信號通路具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長增殖、促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展及參與血管形成等多種功能，是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一[12]。PI3K是一種磷脂酰肌醇蛋白激酶，與AKT蛋白的Ser308位點發(fā)生磷酸化，導(dǎo)致AKT蛋白的激活從而介導(dǎo)下游信號通路的激活，主要參與調(diào)控細(xì)胞周期、增殖和凋亡的過程[13]。PI3K-AKT信號通路的異?；罨谌祟惸[瘤的很多發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用，如細(xì)胞增殖、生長、分化和凋亡等，其異常活化和人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。林瓊燕等[14]通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路使子宮內(nèi)膜癌Ishiikawa細(xì)胞發(fā)生自噬，發(fā)揮抗腫瘤作用。Akt及其下游分子mTOR能夠通過多種機(jī)制參與惡性腫瘤進(jìn)展，并且調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)家族蛋白的表達(dá)[15-17]。多項研究結(jié)果表明通過靶定p-AKT可達(dá)到抑制腫瘤生長的目的。

MMP是一類內(nèi)源性蛋白酶家族，參與人體眾多的病理生理過程，其表達(dá)水平升高與機(jī)體炎癥反應(yīng)及腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[18]。MMP-2是MMD家族成員之一，在組織重構(gòu)、炎癥調(diào)控和腫瘤轉(zhuǎn)移等多種病理生理過程中發(fā)揮重要作用[19-21]。MMP-2廣泛表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞中，可通過降解細(xì)胞外基質(zhì)成分而促進(jìn)腫瘤血管新生，在腫瘤細(xì)胞浸潤、遷移到其他組織中起著關(guān)鍵作用[22-23]。Coticchia等[24]對97例卵巢癌患者的尿液檢測發(fā)現(xiàn)，糖類抗原(CA)125正常的卵巢癌患者M(jìn)MP-2表達(dá)水平均存在明顯差異，表明MMP-2在卵巢癌的進(jìn)展和復(fù)發(fā)過程中起著重要作用。另外，在肺癌[25]、頭頸部腫瘤[26]、黑色素瘤[27]中均發(fā)現(xiàn)MMP-2與腫瘤的相關(guān)性。

在本研究中，我們選擇miR-144作為研究對象，結(jié)果表明在CCA細(xì)胞系HCCC-9810和CCLP1細(xì)胞中通過慢病毒載體過表達(dá)miR-144后，可對CCA細(xì)胞的多種生物學(xué)行為產(chǎn)生影響。首先，我們通過CCK8檢測miR-144對CCA細(xì)胞的增殖能力的影響，表明過表達(dá)miR-144明顯抑制CCA細(xì)胞的增殖；其次，通過細(xì)胞劃痕實驗和Transwell侵襲實驗檢測miR-144對CCA細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，結(jié)果顯示miR-144過表達(dá)的CCA細(xì)胞系細(xì)胞遷移和侵襲能力均顯著下降；最后發(fā)現(xiàn)在過表達(dá)miR-144的CCA細(xì)胞系中，p-AKT、MMP-2與細(xì)胞增殖和遷移密切相關(guān)的指標(biāo)明顯下調(diào)。這一結(jié)果提示miR-144通過下調(diào)p-AKT、MMP-2的表達(dá)，從而抑制CCA細(xì)胞的增殖和遷移能力，其對CCA體內(nèi)的作用機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。