豬流產(chǎn)胎兒中豬圓環(huán)病毒3型的檢測及其遺傳演化分析

何 慶，李周勉，王 歡，李丹彤，譚慶輝，鄒亞文，蘇建明，鄧治邦，楊 毅，王乃東*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 獸用蛋白質(zhì)工程疫苗湖南省重點實驗室 獸用疫苗逆向創(chuàng)制湖南省工程研究中心，長沙 410128；2.長沙市望城區(qū)高塘嶺街道農(nóng)業(yè)農(nóng)村綜合服務中心，長沙 410128；3.婁底市動物疫病預防控制中心，婁底 417000)

豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus，PCVs)是目前報道最小的單股負鏈DNA病毒，病毒粒子大小為17 nm左右，呈正20面體結(jié)構(gòu)。迄今為止，PCVs分為4種(即PCV1、PCV2、PCV3和PCV4)，其中PCV1無致病性；PCV2能引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PWMS)等一系列豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(porcine circovirus associated diseases，PCVAD)，給世界生豬產(chǎn)業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失；PCV3是于2016年在美國從患有豬皮炎腎病綜合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)和繁殖障礙母豬及其流產(chǎn)胎兒體內(nèi)鑒定出的新型豬圓環(huán)病毒，其致病性目前尚不明確；而PCV4是于2020年在中國湖南病豬體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的新型豬圓環(huán)病毒。

PCV3已在日本、中國、瑞典、俄羅斯、巴西、丹麥、意大利和西班牙等多個國家和地區(qū)流行，PCV3通常與PCV2、PEDV、TTSuV和PPV等其他病毒發(fā)生混合感染，并且PCV3還可以感染犬和牛等其他動物。PCV3基因組全長為2 000 bp，與PCV1和PCV2基因組序列的相似性僅為31%～48%，與PCV4的相似性為43.2%。PCV3包括3個主要開放閱讀框(open reading frames，ORFs)，ORF1具有非ATG啟動子(GTC)，編碼由296～297 aa組成的復制酶(replication-associated protein，Rep)；ORF2編碼214 aa組成的衣殼蛋白(capsid protein，Cap)，與蝙蝠圓環(huán)病毒相似性為35%，與PCV2 Cap的核苷酸和氨基酸相似性僅36%和26%，有研究表明，PCV2和PCV3不具有交叉免疫保護的特性?；赑CV3唯一結(jié)構(gòu)蛋白Cap的兩個突變位點(A24V和R27K)，可將PCV3分為PCV3a、PCV3b和PCV3c。根據(jù)已有報道，PCV3的突變位點主要位于Cap蛋白，且集中在R10K、A24V、K77R、N56D、S77T、F104Y和I150L。多項研究認為PCV3感染主要與繁殖障礙和皮炎腎病綜合征等臨床癥狀有關(guān)。

目前，在我國已有27個省級行政區(qū)域報道了PCV3陽性病例，PCV3廣泛流行對我國生豬產(chǎn)業(yè)造成了威脅。為分析豬流產(chǎn)胎兒中PCV3的感染及其遺傳進化情況，本研究采用PCR檢測方法對2015—2017年采集的豬流產(chǎn)胎兒病料進行PCV3的檢測，結(jié)合序列的生物信息學分析，解析其遺傳進化規(guī)律，為后續(xù)深入研究PCV3遺傳變異及其相關(guān)致病性提供了重要參考信息。

1 材料與方法

1.1 臨床病料及試劑

2015—2017年，從湖南省長沙市、湘潭市和婁底市等12個行政區(qū)域的30個豬場共采集了680份表現(xiàn)為弱胎、死胎和木乃伊胎等臨床癥狀的流產(chǎn)胎兒病料(肺、淋巴結(jié)、肝、脾、腎、血清等)，提取病料中病毒基因組DNA后-80 ℃保存于實驗室。2×Easy聚合酶和大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；病毒DNA/RNA提取試劑盒、OMEGA瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和小提質(zhì)粒試劑盒，均購自廣州飛揚生物工程有限公司。

1.2 引物設計

根據(jù)GenBank中登錄的全長PCV3序列為模板(GenBank：KY363870.1)，設計1對引物檢測PCV3及擴增ORF2基因序列；設計3對引物分段擴增PCV3全基因組(見表1)。參考實驗室已發(fā)表文獻，合成PCV2檢測引物，引物均由擎科新業(yè)生物技術(shù)(長沙)有限公司合成。

表1 引物序列信息

1.3 PCV3 ORF2基因的PCR擴增

向適量的病料中加入PBS緩沖液，在無菌條件下研磨，并反復凍融3次, 6 000×離心10 min, 取上清用于病毒核酸的提取，病毒基因組提取嚴格按照試劑盒說明書進行。采用PCR方法檢測PCV3，PCR反應體系為50 μL，其中，25 μL 2×Easy聚合酶，模板DNA 5 μL，上下游引物各2 μL，ddHO 16 μL。反應條件：95 ℃2 min；95 ℃ 20 s，56 ℃20 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.4 PCV3全基因組擴增

采用3對引物(PCV3-P1、PCV3-P2和PCV3-P3，表1)分段擴增PCV3全基因組，PCR反應體系同“1.3”。PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.5 PCV2 PCR檢測

采用常規(guī)PCR方法對PCV3陽性樣本，進行PCV2檢測，PCR反應體系為50 μL，其中，25 μL 2×Easy聚合酶，模板DNA 5 μL，上下游引物各2 μL，ddHO 16 μL。反應條件為95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。使用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增產(chǎn)物。

1.6 目的片段膠回收、克隆鑒定和測序

對PCR檢測為陽性的樣本，用OMEGA瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收陽性PCR產(chǎn)物，連接至pMD18-T克隆載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑取單克隆菌落繼續(xù)擴增過夜，提取質(zhì)粒后送長沙擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序。

1.7 PCV3全基因組和ORF2基因變異與演化分析

使用DNAStar軟件對PCV3全基因組測序結(jié)果進行拼接，將其與國內(nèi)外參考毒株序列進行同源性分析、比對。利用MEGA 5.0軟件，使用Neighbor-joining法對獲得的PCV3全基因組序列和Cap蛋白氨基酸序列分別構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。通過ClustalW軟件對PCV3 Cap蛋白氨基酸進行多重序列比對分析。

2 結(jié) 果

2.1 豬流產(chǎn)胎兒樣品中PCV3檢出情況

為了調(diào)查豬流產(chǎn)胎兒中PCV3感染率，選擇2015—2017年湖南省12個行政區(qū)域的豬場采集保存的680份流產(chǎn)胎兒病料，提取病毒基因組DNA后進行PCR檢測，PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。電泳結(jié)果顯示(部分病料的檢測見圖1)：在680份病料中共檢測出166份病料呈PCV3陽性，PCV3陽性率為24.4%(166/680)，其中，2015年為18.2%(26/143)，2016年為22.7%(54/238)，2017年為28.8%(86/299)(圖2A)。在湖南省各個地區(qū)的樣本中均檢測出PCV3陽性(圖2B)：長沙(39/166)、益陽(7/166)、婁底(24/166)、湘潭(19/166)、株洲(12/166)、永州(6/166)、常德(2/166)、邵陽(8/166)、郴州(10/166)、岳陽(27/166)、湘西(4/166)和懷化(8/166)，說明PCV3在湖南省地區(qū)豬流產(chǎn)胎兒中廣泛存在。對PCV3陽性樣本DNA進行PCV2混合感染檢測發(fā)現(xiàn)，166份病料中共有49份呈PCV2陽性，PCV3和PCV2 混合感染率為29.5%(49/166)。

1～9.臨床樣品；NC.陰性對照；M.DL5000 DNA相對分子質(zhì)量標準

A.2015—2017年采集病料樣品的PCV3陽性率；B.PCV3陽性樣品的地區(qū)分布

2.2 基因組序列相似性分析

重組陽性質(zhì)粒經(jīng)測序、拼接，獲得1株P(guān)CV3全基因組序列，序列全長2 000 nt，將該序列命名為PCV3/CN/Hunan-57(GenBank登錄號為MZ934695)。利用MEGA 5.0軟件將PCV3/CN/Hunan-57序列與NCBI上報道的國內(nèi)外PCV3毒株序列進行比對分析，并繪制系統(tǒng)進化樹(圖3)。發(fā)現(xiàn)PCV3/CN/Hunan-57與參考毒株序列相似性為97.8%～99.2%。其中，與PCV3-CN/FuJian-1215-2016(KY924474)和CN/Hubei-610/2016(KY354038)親緣關(guān)系最近，與PCV3/CN/Fujian-12/2016毒株(KY075987)親緣關(guān)系最遠。

黑色圓點表示本研究此次獲得的PCV3基因組序列

2.3 Cap的遺傳演化分析

從PCV3陽性樣品中擴增獲得了5株P(guān)CV3 Cap序列(CHN/HN-1/2016、CHN/HN-2/2016、CHN/HN-3/2016、CHN/HN-4/2017和CHN/HN-5/2017)，與GenBank已登錄的PCV3 Cap序列進行遺傳進化分析，結(jié)果顯示，PCV3可分為PCV3a、PCV3b和PCV3c 3個亞群(圖4)，本試驗獲得的PCV3序列分別位于其中2個亞群上，1株屬于PCV3a(24 A和27 R)，4株屬于PCV3c(24 V和27 K)。CHN/HN-1/2016和CHN/HN-3/2016與這3株參考毒株[PCV3/CN/Guangdong-SG/2016(MF589117)、PCV3/CN/Hunan-CZ/2017(MF589126)和PCV3/CN/Guangxi-L2/2017(MF589119)]親緣關(guān)系較近。此外CHN/HN-4/2017和CHN/HN-5/2017處于同一進化分支，同源關(guān)系較近。CHN/HN-2/2016與其余毒株處于不同進化分支，提示有不同類型的PCV3毒株在湖南省地區(qū)豬流產(chǎn)胎兒中流行。

黑色圓點表示本研究此次獲得的PCV3 Cap基因序列

2.4 Cap同源性分析和多重序列比對

同源性分析結(jié)果顯示，獲得的5株P(guān)CV3 ORF2基因序列之間的核苷酸和氨基酸相似性分別為97.5%～98.3%和96.7%～99.7%，與國內(nèi)外參考毒株ORF2基因序列相比，其核苷酸和氨基酸相似性分別為96.3%～99.2%和96.8%～100.0%。對獲得的5株和GenBank報道的PCV3 Cap蛋白氨基酸序列進行多重序列比對，以評估PCV3 Cap蛋白的氨基酸突變。結(jié)果顯示，PCV3a突變頻率高于PCV3b和PCV3c，從流產(chǎn)胎兒樣品獲得的Cap序列中鑒定出T100A、G113S和A184S突變位點(圖5)，基于截至2021年8月10日的GenBank中PCV3序列同源性分析，本研究鑒定的氨基酸突變位點在已經(jīng)報道的PCV3序列中未出現(xiàn)。

黑色方框表示鑒定出的新氨基酸突變位點

3 討 論

PCV3自2016年被發(fā)現(xiàn)以來，陸續(xù)在不同臨床癥狀(如PDNS、母豬繁殖障礙、多系統(tǒng)炎癥和神經(jīng)癥狀等)或健康豬中檢測出PCV3感染，其中繁殖障礙和多系統(tǒng)炎癥是報道最多的臨床癥狀。Deim等從豬流產(chǎn)胎兒和弱仔的多種器官中檢測到PCV3感染；Santo等對276例木乃伊胎進行病原體檢測，發(fā)現(xiàn)270例檢測為PCV3陽性，其中,PCV3單獨感染僅有12例；Saporiti等通過原位雜交(hybridization，ISH)方法在豬流產(chǎn)胎兒的組織學病變中發(fā)現(xiàn)PCV3基因組；Zou等研究發(fā)現(xiàn)有繁殖障礙癥狀的母豬中PCV3陽性率高于健康母豬，Kedkovid等發(fā)現(xiàn)母豬的初乳樣本中PCV3陽性率為44.74%(17/38)，血清樣本中陽性率為47.37%(18/38)；初產(chǎn)母豬的初乳樣本中PCV3陽性率高達71%，高于經(jīng)產(chǎn)母豬陽性率(33%～43%)。另一項研究發(fā)現(xiàn)初產(chǎn)母豬的PCV3感染胎兒數(shù)量顯著高于經(jīng)產(chǎn)母豬，且PCV3病毒載量較高，這些進展進一步證實了PCV3在導致母豬繁殖障礙中具有潛在的作用。

近期報道西班牙農(nóng)場中豬流產(chǎn)胎兒或死產(chǎn)仔豬組織樣品的qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，PCV3陽性率為33.9%，本研究對湖南省680份豬流產(chǎn)胎兒病料樣品PCR檢測發(fā)現(xiàn)，PCV3陽性率也較高(24.4%)，并且PCV3陽性率在2015—2017年，呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，說明PCV3在流產(chǎn)胎兒中一直有較高水平的流行。盡管多數(shù)報道中認為PCV3是一種可導致母豬繁殖障礙的病原體，但仍需進一步分離毒株，通過試驗驗證PCV3對母豬或胎兒、仔豬的具體致病性。

PCV2誘導的淋巴細胞增殖或免疫抑制可增強對其他病毒復制和感染的易感性，而PCV3與其他病原混合感染后的影響尚不完全清楚。Ha等統(tǒng)計分析顯示，PCV3可能提高PCV2和PRRSV感染率，并與豬臨床疾病有潛在關(guān)聯(lián)。在作者前期的另一項PCV3和PPV7混合感染檢測研究中發(fā)現(xiàn)，母豬PPV7 陽性血清樣本中PCV3的拷貝數(shù)顯著高于PPV7陰性血清樣本，因此推測PPV7可能促進PCV3復制。本研究檢測發(fā)現(xiàn)PCV3和PCV2混合感染可達29.5%(49/166)，這與前期國內(nèi)外的報道基本一致。鑒于PCV3臨床混合感染和母豬繁殖障礙影響的存在，需加強PCV3與豬常見繁殖障礙病原體的混合感染檢測(如新一代測序NGS)，并探索PCV3混合感染與繁殖障礙等致病性的關(guān)系。

PCV3結(jié)構(gòu)蛋白Cap突變可能會影響PCV3的毒力和致病性。Ha等對PCV3進化過程中Cap蛋白主要氨基酸的突變情況進行了分析，其中突變頻率最高的氨基酸位點分別為A24V、K27R、S77T、F104Y和I150L。前期報道臨床表現(xiàn)有繁殖障礙的母豬和流產(chǎn)胎兒樣品中的 PCV3 Cap序列均存在S77T和I150L突變位點，且這些突變位點常出現(xiàn)在PCV3a毒株。近期有研究表明，從越南豬流產(chǎn)胎兒中鑒定出3個PCV3 Cap蛋白的新突變位點(K139R、I150F和P169T)。本研究發(fā)現(xiàn)來自豬流產(chǎn)胎兒的PCV3 Cap序列中出現(xiàn)T100A、G113S和A184S新的突變位點，且進化分析顯示，陽性毒株均屬于PCV3c，這表明雖然PCV3基因組穩(wěn)定，但仍在不斷適應進化，而Cap突變位點的改變是否影響PCV3感染和致病性需進一步驗證。

4 結(jié) 論

本研究對湖南省地區(qū)于2015—2017年采集的豬流產(chǎn)胎兒病料樣品進行PCR檢測，結(jié)果表明豬流產(chǎn)胎兒中PCV3感染率較高，且存在不同類型的PCV3毒株感染。