功能化水刺粘膠纖維膜的制備及其在漆酶固定化中的應(yīng)用

劉 鎖， 王雅倩， 魏安方， 趙 磊， 鳳 權(quán)

(1. 安徽工程大學(xué) 紡織服裝學(xué)院， 安徽 蕪湖 241000；2. 江南大學(xué) 教育部針織技術(shù)工程研究中心， 江蘇 無錫 214122)

工業(yè)生產(chǎn)中，大量含氨氮有機(jī)物的廢水對生態(tài)系統(tǒng)的平衡構(gòu)成了巨大的威脅。這些污染物可以通過多種環(huán)境介質(zhì)遠(yuǎn)距離遷移，具有長期殘留、生物積累和高毒性[1-2]。漆酶作為使用最廣泛的多酚氧化酶，對酚類、芳香環(huán)和羧酸的衍生物等多種底物具有良好的催化降解能力，且催化降解的最終產(chǎn)物都是無毒的小分子物質(zhì)[3-4]。然而，生物酶對環(huán)境敏感性較強(qiáng)，在高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和有機(jī)溶劑等反應(yīng)條件下易發(fā)生變性或失活，不易長期儲存，不能重復(fù)使用，這在一定程度上阻礙了酶的廣泛應(yīng)用。

酶的固定化是指通過物理或化學(xué)的方法使生物酶與載體相結(jié)合，提高其抵抗外部環(huán)境對酶活性的影響，同時實(shí)現(xiàn)對生物酶回收和重復(fù)使用的一種技術(shù)。該技術(shù)不僅可以改善酶的穩(wěn)定性，減少或者避免酶對產(chǎn)物的污染，而且方便酶的回收和重復(fù)使用，從而大大降低處理成本[5-6]。目前采用的酶固定化載體主要是價格較為便宜的無機(jī)材料、磁性粒子、高聚物和介孔材料等[7-8]，但其與酶結(jié)合之后通常會造成酶的重復(fù)使用性能較差和酶活損失較為嚴(yán)重等問題。選擇合適的載體對提高固定化酶的催化性能有至關(guān)重要的影響。優(yōu)異的載體不僅應(yīng)該具有較高的性價比，更重要的是要具有良好的物理和化學(xué)穩(wěn)定性、較高的酶負(fù)載能力和不對環(huán)境造成二次污染等特性。

近年來，紡織材料由于大的比表面積和易于功能化修飾等優(yōu)點(diǎn)被廣泛用于固定化酶的研究[9-10]。水刺粘膠纖維膜具備較多的羥基官能團(tuán)，將其進(jìn)行加工修飾后通過配位法[11-12]固定化酶，能夠提高其對漆酶的固定化量、活性穩(wěn)定性，可作為固定化漆酶優(yōu)良的載體。原子轉(zhuǎn)移自由基聚合技術(shù)(ATRP)是近年來對材料進(jìn)行功能化改性的主要方法之一，其與普通聚合反應(yīng)相比，具有反應(yīng)可控、適用單體范圍廣和生成的聚合物分子量分布窄等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)在纖維的改性和修飾領(lǐng)域得到了很好的應(yīng)用[13-15]。

本文以工業(yè)化生產(chǎn)的水刺粘膠纖維膜為基材，采用ATRP技術(shù)通過引發(fā)、接枝等步驟對其進(jìn)行功能化修飾，接著通過吸附的Fe3+離子作為漆酶固定化的配合位點(diǎn)，該方法固定化漆酶不僅可以提高酶使用過程中的環(huán)境(溫度、pH值)穩(wěn)定性，而且具有較好的重復(fù)使用性能。

1 試驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

材料：四氫呋喃(THF)、三乙胺(TEA)、2-溴異丁酰溴(2-BIB)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、醋酸(CH3COOH)、醋酸鈉(CH3COONa)、考馬斯亮藍(lán)G-250、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)、1,1,4,7,10,10-六甲基三亞乙基四胺(HMTETA)、氯化亞銅(CuCl)、氯化鐵(FeCl3)，均為分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；水刺粘膠纖維膜(面密度為45 g/m2)，浙江金三發(fā)集團(tuán)有限公司；漆酶(來自云芝，≥0.5 U/mg)，Sigma-Aldrich生物科技有限公司。

儀器：S-4800場發(fā)射掃描電子顯微鏡、掃描電子能譜儀，日本日立公司；IR Prestige-21傅里葉紅外光譜儀，日本島津公司；Lab2000真空手套箱，北京伊特克斯惰性氣體系統(tǒng)有限公司；SHA-B恒溫水浴振蕩器，上海捷呈設(shè)備有限公司；UV-5500紫外-可見分光光度劑，上海元析儀器有限公司；THZ-82恒溫?fù)u床，江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠。

1.2 功能性水刺粘膠纖維膜的制備

1.2.1 引發(fā)反應(yīng)

準(zhǔn)確稱取水刺粘膠纖維膜置于THF溶液中浸泡2 h進(jìn)行除雜處理，接著將除雜后的水刺粘膠纖維膜放入70 μL TEA和63 μL 2-BIB和40 mL THF的混合液中，在35 ℃、120 r/min恒溫水浴振蕩器中進(jìn)行引發(fā)反應(yīng)，待反應(yīng)4 h后用THF進(jìn)行清洗，待用。

1.2.2 接枝反應(yīng)

將24 mL的DMF和400 μL的HMTETA混合液(DMF/HMTETA)與HEMA分別進(jìn)行冷凍脫氧處理后置于手套箱中，之后準(zhǔn)確稱取100 mg CuCl加入到DMF/HMTETA混合液中攪拌2 h，最后將HEMA和完成引發(fā)反應(yīng)的水刺粘膠纖維膜同時加到DMF/HMTETA/CuCl混合液中，待反應(yīng)結(jié)束后取出改性后的水刺粘膠纖維膜，并用去離子水多次清洗后真空干燥得到接枝HEMA的水刺粘膠纖維膜(SV-poly(HEMA))，反應(yīng)示意圖如圖1所示。

圖1 水刺粘膠纖維膜的ATRP接枝過程示意圖Fig.1 Schematic diagram of ATRP grafting process of spunlaced viscose fiber membrane

1.2.3 Fe3+離子吸附

準(zhǔn)確稱取20 mg的SV-poly(HEMA)置于50 mL Fe3+離子(質(zhì)量濃度為1.0 g/L)溶液的藍(lán)蓋瓶中，隨后將藍(lán)蓋瓶放于恒溫?fù)u床(溫度為25 ℃，轉(zhuǎn)速為120 r/min)中24 h，最后將吸附Fe3+離子后的SV-poly(HEMA)取出，用蒸餾水充分洗滌、真空干燥后得到吸附Fe3+離子后的SV-Poly(HEMA) (SV-poly(HEMA)-Fe(Ⅲ))。

1.3 纖維形態(tài)及結(jié)構(gòu)表征

1.3.1 形貌觀察與元素分析

將改性前后的水刺粘膠纖維膜經(jīng)過噴金處理后，采用掃描電子顯微鏡、掃描電子能譜儀進(jìn)行形貌表征和元素分析。

1.3.2 化學(xué)結(jié)構(gòu)表征

分別將改性前后的水刺粘膠纖維膜剪碎成粉末狀，采用傅里葉紅外光譜儀通過溴化鉀壓片法確定其所含的官能團(tuán)。

1.4 漆酶固定化量及活性測試

1.4.1 漆酶固定化過程

分別稱取0.02 g SV-poly(HEMA)-Fe(Ⅲ)置于20 mL、1.0 g/L的漆酶溶液(緩沖液采用100 mmol/L、pH值為4.5的醋酸鈉-醋酸溶液)中，于4 ℃、120 r/min搖床中進(jìn)行酶的固定化12 h。待反應(yīng)結(jié)束后，用緩沖液多次洗滌固定化酶的纖維膜，直至洗滌液中檢測不到漆酶為止。

1.4.2 酶固定化量測定

采用Bradford方法測定SV-poly(HEMA)-Fe(Ⅲ)對漆酶的固定化量。利用紫外-可見分光光度計(jì)測量吸附前后及清洗固定化酶所用緩沖液中的漆酶溶液的含量。按照下式計(jì)算酶的固定化量：

式中：Ge為漆酶固定化量，mg/g；C0為反應(yīng)前漆酶的質(zhì)量濃度，mg/mL；C1為反應(yīng)后漆酶的質(zhì)量濃度，mg/mL；C2為沖洗液中漆酶的質(zhì)量濃度，mg/mL；V0為實(shí)驗(yàn)所用酶溶液的體積，mL；V1為沖洗液的體積，mL；m為用于固定化酶的SV-poly(HEMA)-Fe(Ⅲ)的質(zhì)量，g。

1.4.3 酶活性的測定

采用ABTS作為漆酶的催化底物，測定游離漆酶與固定化漆酶反應(yīng)前后ABTS溶液的吸光度變化，用于表征游離和固定化漆酶活性，根據(jù)下式計(jì)算酶活性：

式中：v為漆酶的活性，U；A0和A分別表示反應(yīng)前后ABTS溶液的吸光度；V為ABTS溶液的體積，mL；T為實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時間，min；K為底物對應(yīng)的常數(shù)；me為漆酶的質(zhì)量，mg。

1.5 環(huán)境穩(wěn)定性和重復(fù)使用性測試

1.5.1 漆酶活性的影響因素

為探究反應(yīng)溫度對游離和固定化漆酶的影響，分別將游離漆酶和固定化漆酶樣品放于pH值為4.5的緩沖液中，在不同溫度條件下用ABTS測定漆酶活性,并以最高活性為100%，得出其他溫度下的相對活性。

為探究pH值對游離和固定化漆酶的影響，分別將游離漆酶和固定化漆酶樣品放于不同pH值的緩沖液中，在各自最適溫度下用ABTS測試漆酶活性，并以最高活性為100%，得出其他pH值下的相對活性。

1.5.2 固定化漆酶的重復(fù)使用性能

為測定固定化漆酶的重復(fù)使用性能，將已經(jīng)固定化漆酶的SV-poly(HEMA)-Fe(Ⅲ)在最適pH值和溫度下進(jìn)行重復(fù)使用，以首次使用時酶活性為100%，測定每次重復(fù)使用后酶相對活性。

1.6 固定化漆酶的儲存穩(wěn)定性能測試

將同一批固定化漆酶的SV-poly(HEMA)-Fe(Ⅲ)和游離酶溶液置于4 ℃下儲存，每隔2 d取出固定化漆酶的纖維膜和游離酶溶液進(jìn)行酶活測試，通過比較漆酶相對活性的變化，研究漆酶的儲存穩(wěn)定性能。

2 結(jié)果與討論

2.1 纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)分析

2.1.1 改性前后纖維膜的表面形貌分析

改性前后的水刺粘膠纖維膜和SV-Poly(HEMA)-Fe(Ⅲ)表面形貌變化如圖2所示。

圖2 水刺粘膠纖維膜的掃描電鏡照片(×400)Fig.2 SEM images of spunlaced viscose fiber membrane(a), SV-poly(HEMA) (b) and SV-poly(HEMA)-Fe(Ⅲ) (c) (×400)

由圖2可以看出：水刺粘膠纖維膜表面光滑，分布較為均勻，經(jīng)過ATRP改性后的水刺粘膠纖維膜由于功能性分子鏈的存在，纖維直徑和粗糙度略微增加，依然保持著良好的纖維形態(tài)；經(jīng)過金屬離子吸附后的SV-poly(HEMA)-Fe(Ⅲ)相較于SV-poly(HEMA)纖維形態(tài)和纖維直徑幾乎沒任何變化，原因是吸附的Fe3+離子的半徑遠(yuǎn)小于接枝的功能性分子鏈的長度，對纖維的形態(tài)結(jié)構(gòu)影響較小。

2.1.2 元素分析

引發(fā)反應(yīng)前后水刺粘膠纖維膜的元素分析結(jié)果如表1所示?？煽闯觯陶衬z纖維膜主要含有C和 O這2種元素；通過引發(fā)反應(yīng)后的水刺粘膠纖維膜含有C、O和Br 3種元素，說明已成功地對水刺粘膠纖維膜進(jìn)行了引發(fā)反應(yīng)，引入了Br原子。

表1 元素種類及其質(zhì)量分?jǐn)?shù)Tab.1 Element types and its weight percentages

2.1.3 化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

圖3 接枝改性前后水刺粘膠纖維膜的紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectrum of spunlaced viscose fiber membrane and SV-poly(HEMA)

2.2 漆酶固定化量分析

圖4示出接枝時間為0、2、4、5和6 h時用于配位法固定化酶的SV-poly(HEMA)-Fe(Ⅲ)對漆酶的固定化量。可看出，隨著接枝處理時間的延長，漆酶的固定量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，原因是在反應(yīng)初期，隨著接枝時間的延長纖維上的功能性基團(tuán)大量增加，其對漆酶的固定化量表現(xiàn)出快速上升的趨勢；當(dāng)接枝時間從2 h延長到4 h時，纖維上供功能性基團(tuán)結(jié)合的位點(diǎn)逐漸減少，但依然能夠結(jié)合新的功能性基團(tuán)，表現(xiàn)出對漆酶的吸附量繼續(xù)增加，但速率有所減緩，且在4 h時其吸附量達(dá)到最大值，為132.9 mg/g；當(dāng)接枝時間進(jìn)一步延長時，纖維上功能性基團(tuán)的配合位點(diǎn)達(dá)到飽和，繼續(xù)增加的官能團(tuán)在減少纖維比表面積的同時伴隨著副反應(yīng)的產(chǎn)生，占據(jù)了之前接枝的功能性基團(tuán)，使得其對漆酶的固定化量有所減少。

圖4 水刺粘膠纖維膜對漆酶固定化量Fig.4 Immobilization laccase of spunlaced viscose fiber membrane with different modification time

2.3 固定化漆酶的性能分析

2.3.1 溫度和pH值對漆酶固定化的影響

在不同溫度和pH值條件下，測定游離漆酶和固定化漆酶的活性，結(jié)果如圖5所示。

圖5 溫度與pH值對游離漆酶和固定化漆酶的影響Fig.5 Relationship of pH (a) and temperature (b) on free and immobilized laccase

由圖5(a)可知，游離漆酶和固定化漆酶的最適pH值都是4.5。從整體而言，固定化漆酶與游離漆酶相比，對于pH值變化表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性，這是因?yàn)檩d體的存在能更好地保證漆酶的空間結(jié)構(gòu),受pH值影響較小，提高其應(yīng)對pH值變化的穩(wěn)定性能。同理，在不同溫度條件下，測定游離漆酶與固定化漆酶的相對活性，從圖5(b)可看出，固定化漆酶的整體活性都較游離漆酶有所提升，同時固定化酶的最適溫度也相較于游離酶有所提高，從50 ℃上升至55 ℃，表明固定化漆酶對較高的溫度表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性。

2.3.2 固定化漆酶的重復(fù)使用性能

重復(fù)使用性能是決定漆酶能否被廣泛應(yīng)用的主要因素之一，也是表征漆酶固定化穩(wěn)定性能的關(guān)鍵因素，本文對固定化漆酶的SV-poly(HEMA)-Fe(Ⅲ)進(jìn)行了10次重復(fù)使用，結(jié)果如圖6所示?？煽闯觯潭ɑ崦冈谧钸mpH值和溫度下，隨著使用次數(shù)的增加，漆酶的催化降解性能有所降低，原因是固定化漆酶在催化降解和清洗過程中，部分固定化漆酶的活性下降或脫落所致。經(jīng)過10次重復(fù)使用后，固定化漆酶仍保留較高的活性，為其初始活性的55%以上，表明SV-poly(HEMA)-Fe(Ⅲ)固定化漆酶具有良好的重復(fù)使用性能。

圖6 固定化漆酶的重復(fù)使用性能Fig.6 Reusability of immobilized laccase

2.3.3 固定化漆酶的儲存穩(wěn)定性能

固定化漆酶和游離酶儲存穩(wěn)定性能測試結(jié)果如圖7所示。

圖7 漆酶的儲存穩(wěn)定性能Fig.7 Storage stability of free and immobilized laccase

由圖7可看出，存儲19 d后，固定化漆酶的活性相較于游離漆酶有很大的提升，從21%增加到57.9%，說明本文研究所制備的功能性復(fù)合纖維膜對酶的存儲性能得到很好地改善，這將對漆酶的廣泛應(yīng)用有非常重要的意義。

3 結(jié) 論

本文通過原子轉(zhuǎn)移自由基聚合技術(shù)對水刺粘膠纖維膜進(jìn)行接枝改性，賦予其特殊的功能性官能團(tuán)，并對改性后的功能性水刺粘膠纖維膜進(jìn)行Fe3+離子吸附，得到的SV-poly(HEMA)-Fe(Ⅲ)可作為配位法固定化酶的載體。當(dāng)接枝時間為4 h時，SV-poly(HEMA)-Fe(Ⅲ)對漆酶的固定化量達(dá)到132.9 mg/g；相比于游離漆酶而言，固定的漆酶有效地降低了其對環(huán)境(pH值、溫度)變化的敏感性；對其進(jìn)行10次重復(fù)使用后，固定化漆酶活性依然保持著55%以上，表現(xiàn)出良好的重復(fù)使用性能，為漆酶的進(jìn)一步應(yīng)用提供了一個有效的方法。

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