RGB色彩模型在氣動(dòng)微混合芯片中的應(yīng)用

劉旭玲， 左文思， 劉 威， 王良文， 張段芹， 李松晶

(1.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 機(jī)電工程學(xué)院， 河南 鄭州 450002； 2.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 機(jī)電工程學(xué)院， 黑龍江 哈爾濱 150001)

引言

微混合器是微流控應(yīng)用中一個(gè)重要組件，特別是在生化分析和生物領(lǐng)域需要兩個(gè)或更多的液體混合[1-2]。在微尺度下，低雷諾數(shù)流動(dòng)處于層流狀態(tài)，液體混合只能通過(guò)自然對(duì)流進(jìn)行。在體積/面積比較小的微流控芯片中，緩慢的擴(kuò)散混合遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需求，尤其是在有大分子(比如細(xì)胞)需要擴(kuò)散的場(chǎng)合，實(shí)驗(yàn)時(shí)間、研究成本、試劑消耗量大大增加，有悖于“綠色環(huán)保”的科學(xué)實(shí)驗(yàn)宗旨[3-4]。為了克服這個(gè)問(wèn)題，目前很多學(xué)者對(duì)被動(dòng)和主動(dòng)的微混合器進(jìn)行了研究。為了增加不同液體樣品的界面接觸面積，實(shí)現(xiàn)更好的混合，被動(dòng)混合器利用通道幾何形狀來(lái)折疊流體流[5-6]。這類無(wú)源微混合器的缺點(diǎn)是微通道較長(zhǎng)和設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)的較復(fù)雜， 在制造過(guò)程中容易增加故障率。在微流體網(wǎng)絡(luò)中，主動(dòng)混合可以通過(guò)多種方法來(lái)實(shí)現(xiàn)[7-10]。主動(dòng)式微混合器中一種比較流行的是配置式氣動(dòng)微混合器，它由外部正、負(fù)氣壓驅(qū)動(dòng)[11-12]。HSIUNG等[13]研究了一種新型氣動(dòng)微混合器，利用兩對(duì)氣動(dòng)側(cè)動(dòng)壁在動(dòng)態(tài)對(duì)稱和動(dòng)態(tài)不對(duì)稱模式下對(duì)樣品進(jìn)行混合。但該類氣動(dòng)微混合器結(jié)構(gòu)復(fù)雜，封裝時(shí)容易造成坍塌，且很難操作。

在相對(duì)狹小、封閉且操作時(shí)間短的微流控芯片上作業(yè)，這種環(huán)境下混合效果的檢測(cè)面臨很大挑戰(zhàn)。在傳統(tǒng)方法中，利用人眼根據(jù)混合試劑的顏色來(lái)判斷兩種或多種液體試劑的混合效果。該方法受燈光、觀察位置、視差和人為感知能力等因素影響，容易造成對(duì)結(jié)果判斷的不精確。利用熒光顯微鏡獲得定量混合效率來(lái)獲取圖像，用數(shù)字圖像處理技術(shù)評(píng)估密封微通道網(wǎng)絡(luò)中的混合效率，缺點(diǎn)是后期處理復(fù)雜且設(shè)備昂貴。一些學(xué)者通過(guò)圖像中示蹤粒子密度指標(biāo)來(lái)反映混合均勻程度，該方法因需要考慮圖像中每?jī)蓚€(gè)粒子之間的權(quán)值和圖像灰度差，故示蹤粒子密度的計(jì)算量較大。而且，利用微珠濃度來(lái)反應(yīng)液體試劑的混合效率不是一種直接、有效、方便的測(cè)量方法[14-17]。

本研究提出一種新型基于RGB色彩模型的混合效率量化分析方法，根據(jù)數(shù)字圖像對(duì)混合結(jié)果進(jìn)行量化分析。利用高彈PDMS材料和軟刻蝕方式對(duì)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的氣動(dòng)微混合芯片進(jìn)行封裝，利用兩種不同顏色的試劑進(jìn)行混合實(shí)驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這種微混合芯片和混合效率的量化分析方法簡(jiǎn)單、方便，可用于生物反應(yīng)、孵化和其它生物化學(xué)應(yīng)用場(chǎng)合。

1 基于RGB色彩模型的混合效率

利用數(shù)字電荷耦合設(shè)備(CCD)相機(jī)來(lái)捕捉混合圖像的紅、綠、藍(lán)(RGB，三種原色)數(shù)據(jù)，以實(shí)現(xiàn)色度測(cè)量。通過(guò)色彩模型數(shù)學(xué)模型，可以實(shí)現(xiàn)RGB色彩模型向灰度模型的轉(zhuǎn)換。Ri、Gi和Bi分別表示每個(gè)像素的三種原色R、G和B值，通過(guò)計(jì)算其RGB數(shù)據(jù)的平均值，得到每個(gè)像素的灰色數(shù)據(jù)(Ci)。根據(jù)人眼的視覺(jué)特征和對(duì)原色的敏感度，定義了線性加權(quán)平均的權(quán)重來(lái)補(bǔ)償敏感度的不均勻性，一般R、G和B分量值得權(quán)值分別為0.299、0.587和0.114。該轉(zhuǎn)換模型可以用式(1)來(lái)表示，實(shí)現(xiàn)RGB色彩空間到灰度空間的轉(zhuǎn)化[18]。

Ci=Ri*0.299+Gi*0.587+Bi*0.114

(1)

混合效率灰度差評(píng)價(jià)法是根據(jù)顏色的分布表示混合效果的方法。利用立體式顯微鏡采集得到數(shù)字圖像，對(duì)其進(jìn)行分析處理，根據(jù)整個(gè)被測(cè)區(qū)域內(nèi)圖像色彩的偏移量(均勻性)評(píng)價(jià)混合程度，整幅圖像的色彩均勻度通過(guò)計(jì)算數(shù)字圖像上每個(gè)像素點(diǎn)的灰階與其它各像素點(diǎn)的灰階的偏差來(lái)表示。例如，CCD圖像的像素分辨率為m×n，定義其某一像素(i，j)與另一像素(p，q)之間的灰度偏差Eij用式(2)表示[19]。

p≠i或q≠j

(2)

式中,aij—— 像素(i，j)的灰階

apq—— 像素(p，q)像素(i，j)的灰階

Eij—— 像素(i，j)與所有像素點(diǎn)灰度差的加權(quán)和，加權(quán)因子為距離的倒數(shù)

整個(gè)圖像的總灰度差用式(3)表示[20]。

(3)

混合效率可用以下混合效率指數(shù)(混合指數(shù))來(lái)量化，用式(4)表示。

(4)

這種根據(jù)像素點(diǎn)的RGB值計(jì)算圖像混合效率的方法直觀清晰，但是因?yàn)橐?jì)算每個(gè)像素點(diǎn)與其它像素點(diǎn)的灰度差，因此計(jì)算量巨大，一個(gè)分辨率為100×100 ppi的CCD照片，乘法計(jì)算量可達(dá)到107次左右，耗費(fèi)太多的計(jì)算時(shí)間。因此，采用簡(jiǎn)化的灰度偏差來(lái)評(píng)價(jià)混合區(qū)域的混合效率。用式(5)和式(6)的計(jì)算方法定義了混合效率Imix[21]。

(5)

(6)

式中,N—— 測(cè)量區(qū)域內(nèi)的像素點(diǎn)數(shù)目

Ci—— 每一個(gè)像素點(diǎn)的灰階

若兩液流充分混合，則Imix=1，若完全沒(méi)有混合，則Imix=0。

2 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

2.1 材料和設(shè)備的選取

采用具有高彈易變形特性PDMS材料作為封裝微混合器的主要結(jié)構(gòu)材料，相比于其他常見(jiàn)的微流控芯片制備材料，具有許多理想的微制備特性，包括生物相容性、靈活性、透明度和易于封裝的優(yōu)越性[22]。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用的藍(lán)、黃色試劑均采用兩種固態(tài)水彩顏料和DI水混合而成，質(zhì)量比為1∶1。固態(tài)水彩顏料顆粒細(xì)膩，具有水溶解性，試劑顏色較高，有利于觀察和采集數(shù)字圖像。液體水彩顏料具有色彩艷麗、透明高、表現(xiàn)力佳和高耐恒久的穩(wěn)固特性，常用作微流控混合實(shí)驗(yàn)中的有色試劑[23]。

拍照環(huán)境為室內(nèi)環(huán)境自然光源下，混合過(guò)程和結(jié)果由立體顯微鏡(MA2003A)用CCD攝像機(jī)拍攝，拍攝鏡頭垂直于微混合芯片表面拍攝照片。該顯微鏡變倍比為1∶6.4，目鏡采用WF10X/20 mm，放大倍數(shù)為7x-45x。該顯微鏡照明采用透射光源12V/15W鹵素?zé)?，亮度?dú)立可調(diào)，且底座配置7W熒光燈。CCD攝像機(jī)拍攝后上傳到PC機(jī)中利用MATLAB圖像處理功能進(jìn)行處理。需要說(shuō)明的是，在不同的光源強(qiáng)度、照度下，采集的數(shù)字圖像的RGB值會(huì)有微小變化，但是基于圖像的混合效率量化分析方法僅與圖像像素任意兩點(diǎn)之間的灰度差有關(guān)系，因此在自然光源下，輔助光源對(duì)后期混合效率量化分析影響不大。

2.2 設(shè)計(jì)和封裝

氣動(dòng)微混合芯片結(jié)構(gòu)如圖1a所示，把液體溶液a和b分別放置于R1和R2儲(chǔ)液區(qū)，利用氣壓驅(qū)動(dòng)液流系統(tǒng)將其泵入液體微流道內(nèi)。PDMS氣壓驅(qū)動(dòng)微閥Vp1和Vp2分別控制a、b兩種試劑參與混合的量，即當(dāng)兩種液流試劑驅(qū)動(dòng)壓力一定時(shí)，Vp1驅(qū)動(dòng)腔壓力決定了其膜閥閥口開(kāi)度，從而控制系統(tǒng)中a試劑的流速及流量，同樣Vp2驅(qū)動(dòng)腔壓力決定系統(tǒng)中b試劑的流速及流量，從而控制a和b試劑質(zhì)量(體積)比。實(shí)際應(yīng)用中，可根據(jù)需要參與反應(yīng)的量，分別調(diào)節(jié)Vp1和Vp2驅(qū)動(dòng)腔的壓力，以控制不同試劑參與混合的量。

兩種溶液在微混合器M中充分混合并反應(yīng)后，經(jīng)由蠕動(dòng)式微泵P泵出，在儲(chǔ)液區(qū)R3進(jìn)行收集整理。上層液體微混合腔M設(shè)計(jì)尺寸為1.0 mm×1.0 mm×0.1 mm，下層驅(qū)動(dòng)腔尺寸為0.8 mm×0.8 mm×0.1 mm，微混合腔和驅(qū)動(dòng)腔的中心位置在空間上重疊放置，進(jìn)氣微流道和進(jìn)液微流道在空間上垂直，形成對(duì)稱結(jié)構(gòu)，中間層是40 μm厚PDMS驅(qū)動(dòng)薄膜。圖中，黃色代表黃色試劑，藍(lán)色代表藍(lán)色試劑，綠色代表完全混合后試劑，粉色代表氣體驅(qū)動(dòng)層。

圖1b是PDMS驅(qū)動(dòng)薄膜在一個(gè)驅(qū)動(dòng)循環(huán)內(nèi)的運(yùn)動(dòng)，開(kāi)關(guān)信號(hào)控制PDMS氣壓驅(qū)動(dòng)微閥Vp打開(kāi)，黃色和藍(lán)色試劑分別進(jìn)入液體微流道，然后進(jìn)入微混合腔。當(dāng)三通微閥Vt與氣源連接的端口打開(kāi)時(shí)，壓縮氣體進(jìn)入驅(qū)動(dòng)腔，PDMS驅(qū)動(dòng)薄膜向微混合腔

圖1 氣動(dòng)微混合芯片結(jié)構(gòu)及其工作原理示意圖

方向運(yùn)動(dòng)，促使微混合腔內(nèi)流體產(chǎn)生對(duì)流，加速混合。三通微閥Vt與氣源連接端口關(guān)閉，驅(qū)動(dòng)腔與大氣連接的端口打開(kāi)，驅(qū)動(dòng)腔內(nèi)壓力降低時(shí)，PDMS驅(qū)動(dòng)薄膜形變恢復(fù)，擠壓出的液體回流到微混合腔內(nèi)。運(yùn)行多個(gè)循環(huán)，微混合腔內(nèi)兩種試劑由于振動(dòng)產(chǎn)生對(duì)流，快速、充分混合[24]。

微混合腔和驅(qū)動(dòng)室的封裝尺寸分別為1.0 mm×1.0 mm×0.1 mm和0.8 mm×0.8 mm×0.1 mm，如圖2所示，微混合腔與驅(qū)動(dòng)室的中心位置重疊，形成對(duì)稱結(jié)構(gòu)。與驅(qū)動(dòng)腔連接的氣體微通道和與微混合腔連接的液體微通道在空間上垂直，中間層薄膜厚度為40 μm，由勻膠機(jī)設(shè)置1500 r/min旋涂制備。

圖2 封裝的PDMS氣動(dòng)微混合芯片照片

采用干膜負(fù)光刻膠模具制備具有矩形截面的氣動(dòng)層，帶圓弧角的方形微混合腔和帶圓弧邊緣的微通道可采用正性光刻膠高溫回流工藝實(shí)現(xiàn)，關(guān)于封裝過(guò)程的詳細(xì)工藝可以在本課題組之前的研究中找到[25]。

2.3 試劑混合

實(shí)驗(yàn)前，用去離子水(DI)水清洗微微流控芯片約10 min，以排出微混合腔內(nèi)的氣泡。利用藍(lán)色和黃色兩種明亮而易區(qū)分的顏色，進(jìn)行混合性能實(shí)驗(yàn)研究。藍(lán)色液體和黃色液體分別用于代表兩種不同的樣品試劑。實(shí)驗(yàn)研究中，黃色試劑約0.04 μl，藍(lán)色試劑約0.02 μl，通過(guò)驅(qū)動(dòng)裝置泵入到微混合腔中。根據(jù)顏色匹配原理，當(dāng)藍(lán)色試劑大于黃色試劑時(shí)，人眼觀察到的混合試劑顏色為灰色，否則為綠色。對(duì)微混合腔中兩種試劑的混合現(xiàn)象進(jìn)行觀測(cè)，需要借助顯微鏡來(lái)觀察其變化過(guò)程。試劑注入和混合過(guò)程的圖像經(jīng)由MA2003A體視顯微鏡的光路放大后，由高速圖像采集系統(tǒng)CCD感應(yīng)混合動(dòng)態(tài)目標(biāo)光線生成數(shù)字圖像，傳輸給計(jì)算機(jī)，經(jīng)由存儲(chǔ)處理平臺(tái)完成數(shù)字圖像數(shù)據(jù)的合成并動(dòng)態(tài)存儲(chǔ)，為混合效率的量化提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論

利用圖像采集系統(tǒng)采集黃色和藍(lán)色試劑分別充滿微混合腔的數(shù)字圖像，并利用圖像處理軟件Adobe Photoshop中的顏色拾取器工具或仿真軟件MATLAB中的數(shù)據(jù)提取點(diǎn)工具，提取其每個(gè)像素點(diǎn)的RGB值。后續(xù)處理的數(shù)字圖像是通過(guò)CCD線性相機(jī)的成像裝置放大后拍攝，其放大倍數(shù)為30倍。獲取圖像過(guò)程中應(yīng)根據(jù)實(shí)際光線效果調(diào)整CCD參數(shù)，

以實(shí)現(xiàn)正確的自動(dòng)曝光、聚焦和白平衡等。CCD數(shù)字圖像分辨率為每英寸96個(gè)像素點(diǎn)，測(cè)量區(qū)域數(shù)字圖像包含1104×1098個(gè)像素點(diǎn)。向微混合器的微混合腔內(nèi)充入一定比例的黃和藍(lán)色試劑，自然對(duì)流情況下，觀察微混合腔內(nèi)兩種不同顏色試劑的混合情況，如圖3a所示，顏色強(qiáng)度的變化過(guò)程表示樣品混合的過(guò)程。根據(jù)顯微照片的顏色，可以看出在自然對(duì)流條件下25 min時(shí)還沒(méi)有完全混合。驅(qū)動(dòng)腔壓力為0.01 MPa，采用振動(dòng)混合方式，氣動(dòng)微混合芯片振動(dòng)頻率設(shè)置為2 Hz，振動(dòng)混合過(guò)程顯微照片如圖3b所示。人眼觀察微混合腔圖片時(shí)，在5 s時(shí)混合試劑顏色幾乎接近于統(tǒng)一，說(shuō)明微混合腔內(nèi)兩種試劑接近于完全混合，即溶劑在經(jīng)歷5次振動(dòng)后幾乎完全混合。

圖3 微混合腔內(nèi)自然對(duì)流混合和振動(dòng)混合圖片對(duì)比

因?yàn)樵囼?yàn)條件有限，圖片中會(huì)顯示出設(shè)備棱角、反光和有制造瑕疵的地方，這些原因造成的色差會(huì)給混合效率的計(jì)算帶來(lái)背景性誤差。因此，讀取測(cè)量區(qū)域圖片的RGB值后，應(yīng)去除上述具有瑕疵的像素點(diǎn)后，再進(jìn)行混合效率的計(jì)算，以減小計(jì)算誤差。利用式(1)至式(6)計(jì)算混合效率，為了減少計(jì)算量，在CCD數(shù)字圖像中每隔5個(gè)像素點(diǎn)提取一個(gè)像素點(diǎn)進(jìn)行混合效率計(jì)算。如圖4所示，計(jì)算得到自然對(duì)流混合條件下，25 min時(shí)試劑總體混合效率為68.75%，在上述振動(dòng)混合試驗(yàn)條件下，5 s時(shí)試劑總體混合效率為94%，從量化的混合效率對(duì)比結(jié)果看出，振動(dòng)混合器在5 s時(shí)的混合效率高于自然對(duì)流條件下25 min時(shí)的混合效率。

圖4 微混合腔內(nèi)試劑自然對(duì)流混合和振動(dòng)混合量化結(jié)果比較

與目前通常用來(lái)測(cè)定微混合器混合效果方法——PH檢測(cè)法、熒光粒子示綜法和染色對(duì)比法相比，基于數(shù)字圖像的混合效率量化分析方法簡(jiǎn)單直接，僅需要根據(jù)混合過(guò)程中圖片的顏色變化即可判斷密閉微混合腔內(nèi)流體流動(dòng)及混合情況，進(jìn)而評(píng)定微混合芯片性能的優(yōu)劣。

4 結(jié)論

設(shè)計(jì)了一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、封裝容易的PDMS氣動(dòng)微混合芯片，給出了基于RGB色彩模型的混合效率量化分析方法，對(duì)微混合腔內(nèi)藍(lán)、黃試劑充分混合，并與自然對(duì)流混合效率進(jìn)行對(duì)比。研究結(jié)果表明，基于數(shù)字圖像的混合效率量化分析方法簡(jiǎn)單有效、方便可行，且該P(yáng)DMS氣動(dòng)微混合芯片能夠滿足大多數(shù)需要混合應(yīng)用場(chǎng)合的需求。相對(duì)現(xiàn)有的微混合芯片，該設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單且易于實(shí)現(xiàn)，為未來(lái)微流控試劑混合技術(shù)提供了研究基礎(chǔ)。此外，由于基于圖像的混合效率量化分析方法僅與圖像像素的RGB值和相鄰兩點(diǎn)之間的灰度差有關(guān)系，因此該方法不僅適用于兩種不同顏色試劑混合，也適用于多種顏色試劑混合。

可通過(guò)流體仿真軟件進(jìn)一步研究微混合腔的質(zhì)量流動(dòng)特性，通過(guò)研究其質(zhì)量流動(dòng)特性來(lái)獲得合適的驅(qū)動(dòng)空氣壓力和驅(qū)動(dòng)頻率和優(yōu)化PDMS薄膜厚度和微混合腔的深度，進(jìn)一步提高混合芯片上不同試劑的混合效率。