■劉曉烜 孫 楠 張海文 石惠宇 李連彬 王學梅

(海南大學動物科技學院，海南 ?？?570100)

β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC3.2.1.21）能夠水解β-1,4-糖苷鍵，從非還原端釋放葡萄糖。它屬于纖維素酶的一大類，是纖維素水解過程中的限速酶。近年來，許多研究報道了β-葡萄糖苷酶水解纖維素資源[1]、大豆苷[2-3]、染料木苷[4]、甜菊糖苷[5]等生物質(zhì)的能力。

在纖維素水解過程中生成的葡萄糖會抑制β-葡萄糖苷酶活性，從而會負反饋抑制內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的活性，阻礙纖維素的水解[6-7]。具有高耐受性的β-葡萄糖苷酶可以減弱葡萄糖對自身的抑制，然而自然界中存在的葡萄糖耐受型β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量很低，很大程度上限制了該酶在工業(yè)上的應用[8]。因此，開發(fā)新的高產(chǎn)葡萄糖耐受型β-葡萄糖苷酶的菌株具有重要意義。紅樹林擁有豐富生物資源，林璐等[9]從海南演豐紅樹林國家自然保護區(qū)土壤中分離出325株真菌，包括木霉、曲霉和青霉等；Gao等[10]從紅樹林中分離到一種耐鹽堿纖維素酶Cel5A；麥志茂等[11]通過宏基因組技術(shù)在海南紅樹林土壤中鑒定得到了兩種β-葡萄糖苷酶。

本研究從海南東寨港紅樹林自然保護區(qū)土壤中分離到一株不需要特定碳源誘導產(chǎn)高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶的菌株，并通過響應面Plackett-Burman設(shè)計、最陡爬坡設(shè)計、Box-Behnken設(shè)計優(yōu)化培養(yǎng)條件提高了其產(chǎn)酶水平，為β-葡萄糖苷酶的研究與應用提供理論基礎(chǔ)和新的菌種來源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

在海口東寨港紅樹林選取腐殖質(zhì)豐富的土壤作為樣品點采集不同深度（5～20 cm）土壤, 從中篩選高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基及溶液配制

①富集培養(yǎng)基：CMC 10 g、CaCl20.3 g、（NH4）2SO41.4 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、K2HPO4·3H2O 2.62 g、微量元素母液1 mL、水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

②初篩培養(yǎng)基：CMC 10 g、NH4NO31 g、（NH4）2SO41 g、NaCl 0.5 g、瓊脂20 g，121 ℃滅菌20 min，待冷卻至60 ℃時加入1 mL氯霉素溶液。

③檸檬酸高鐵銨-七葉苷瓊脂培養(yǎng)基：CMC 10 g、蛋白胨1 g、FeSO4·5H2O 0.01 g、NaCl 0.5 g、七葉苷1 g、檸檬酸高鐵銨2.5 g、水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

④發(fā)酵培養(yǎng)基：微晶纖維素10 g、酵母提取物0.3 g、CaCl20.3 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、K2HPO4·3H2O 2.62 g，加入500 mL McIlvaine 緩沖液，快速攪拌徹底溶解可溶成分，加入1 mL微量元素母液，用純化水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min，備用。

⑤微量元素母液：FeSO4·7H2O 0.5 g、ZnSO4·7H2O 0.14 g、MnSO4·H2O 0.17 g、CoCl2·6H2O 0.287 g、水100 mL。

⑥McIlvaine 緩沖液：配制0.2 mol/L Na2HPO4和0.1 mol/L 檸檬酸溶液，用檸檬酸溶解加入Na2HPO4溶液中，直至pH為5.0。

1.2 ?產(chǎn)β-?葡萄糖苷酶菌株的篩選與鑒定

1.2.1 菌株的篩選

取10 g紅樹林源土樣，置于90 mL滅菌ddH2O中振搖。靜置后取10 mL上清液于三角瓶并加90 mL富集培養(yǎng)液，于28 ℃、180 r/min富集培養(yǎng)48 h。取10 mL富集培養(yǎng)液作梯度稀釋后涂布于初篩平板上，28 ℃培養(yǎng)7 d。挑取生長單菌落進行劃線分離，直至得到單一菌種。將分離得到的純化菌株接種于七葉苷平板，每個菌株重復3次，28 ℃培養(yǎng)過夜，測量黑色沉淀圈直徑。

選擇上述沉淀圈較大的菌株接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）平板上，28 ℃培養(yǎng)7 d，挑取孢子制作孢子懸液，按1×105個/mL 接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，28 ℃、180 r/min 的發(fā)酵條件下培養(yǎng)7 d。取發(fā)酵液12 000 r/min離心15 min，收集上清液即粗酶液。取經(jīng)過適當稀釋后的上清液100 μL，加入100 μL 5 mmol/L對硝基苯-α-D-葡萄糖苷（pNPG）后于40 ℃反應10 min，加入600 μL 1 mol/L Na2CO3顯色，采用煮沸10 min失活的粗酶液作為對照，于400 nm波長下測定吸光度值。

酶活單位U定義：每分鐘產(chǎn)生1 μmol對硝基苯酚（pNP）所需要的酶量。

1.2.2 菌株的鑒定

形態(tài)學鑒定：觀察菌落形態(tài)，并進行棉蘭染色鏡檢。

分子學鑒定：提取菌株基因組，利用引物ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）、ITS4（TCCTCCGCTTA TTGATATGC)擴增菌株ITS 序列，瓊脂糖凝膠電泳檢測后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結(jié)果在NCBI進行BLAST比對。

1.3 聚多曲酶J1粗酶液β-葡萄糖苷酶的酶學性質(zhì)研究

1.3.1 粗酶液制備

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，將原發(fā)酵培養(yǎng)基中唯一碳源微晶纖維素改進為葡萄糖，并將培養(yǎng)基最終pH調(diào)整為7.0，孢子按1×107個/mL 接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃、180 r/min 的發(fā)酵條件下培養(yǎng)7 d。取發(fā)酵液于4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，收集上清液即粗酶液待測。

1.3.2 不同pH對β-葡萄糖苷酶酶活的影響

將粗酶液在pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0 條件下分別進行酶促反應，將90 μL 緩沖液和10 μL粗酶液混勻后孵育2 min，加入100 μL 5 mmol/L pNPG 在40 ℃反應10 min，反應完畢后加入600 μL 1 mol/L Na2CO3終止反應，測定OD400nm的吸光度，每個反應3個重復，將最高酶活定義為100%。

1.3.3 不同溫度對β-葡萄糖苷酶酶活的影響

在相同pH條件下，取90 μL緩沖液和10 μL粗酶液混勻后加入100 μL 5 mmol/L pNPG，將混合液于30～90 ℃（間隔為10 ℃）條件下進行反應10 min，反應完畢后加入600 μL 1 mol/L Na2CO3終止反應，測定OD400nm的吸光度。每個反應3個重復，將最高酶活定義為100%。

1.3.4 不同濃度葡萄糖對β-葡萄糖苷酶酶活的影響

在最適酶反應條件下，測定粗酶液在葡萄糖終濃度分別為0、20、40、60、80、100、200、300、400 mmol/L和500 mmol/L 條件下的酶活，每個反應3 個重復，以葡萄糖濃度為0時酶活定義為100%。

1.4 響應面法優(yōu)化發(fā)酵條件

1.4.1 Plackett-Burman設(shè)計法

Plackett-Burman設(shè)計可以通過較少的試驗次數(shù)來快速篩選出具有顯著效應的因子[12]。因此在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以葡萄糖為唯一碳源，選取對發(fā)酵結(jié)果影響較大的7個因子進行篩選，包括：碳源濃度（A）、氮源濃度（B）、pH（D）、溫度（G）、接種量（E）、轉(zhuǎn)速（I）、裝液量（K），以C、F、H、J為空項估計試驗誤差，每個因素取高低兩個水平。設(shè)計12組測試，每組3個重復，響應值為β-葡萄糖苷酶酶活，以此篩選具有顯著效應的因子。

1.4.2 最陡爬坡路徑法

最陡爬坡路徑法即在Plackett-Burman 基礎(chǔ)上，進一步逼近最優(yōu)區(qū)域進而確定Box-Behnken 設(shè)計的中心點[13]。根據(jù)Plackett-Burman設(shè)計的各因素水平及效應評價確定關(guān)鍵因子的爬坡方向及步長，測定發(fā)酵培養(yǎng)液中酶活變化趨勢，確定關(guān)鍵因子的最優(yōu)范圍。

1.4.3 Box-Behnken試驗設(shè)計

根據(jù)Plackett-Burman和最陡爬坡法試驗結(jié)果，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計了3因素3水平15個測試組，其中3個為中心復合點，進一步研究影響酶活關(guān)鍵因素的最佳水平，使用方差分析來確定顯著的試驗因素。采用Design-Expert 8.0 擬合試驗數(shù)據(jù)，得到二次方程，分析主效應和交互效應，預測得到最優(yōu)值。

1.4.4 驗證試驗

以最優(yōu)條件進行驗證，重復3 次平行試驗，測定β-葡萄糖苷酶酶活的最佳值，以評估模型的可靠性，并確定優(yōu)化條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選與鑒定

2.1.1 菌株的篩選（見表1）

由表1可知，在分離純化后的13株菌株中觀察到共有5株菌株產(chǎn)生明顯黑色沉淀圈，編號J1～J5，進一步檢測了這5 株菌株發(fā)酵7 d 后發(fā)酵液酶活，菌株J1的粗酶液酶活達到1.01 U/mL，最高。綜合試驗結(jié)果，選擇J1作為后續(xù)發(fā)酵產(chǎn)酶菌株。

表1 七葉苷平板及搖瓶發(fā)酵篩選結(jié)果

2.1.2 目的菌株的鑒定（見圖1）

對菌株J1 鑒定如圖1，形態(tài)學見圖1A，在PDA 平板上28 ℃培養(yǎng)7 d后直徑約22 mm，質(zhì)地為絲絨狀至絮狀、致密；顏色呈暗藍灰綠色，間有淡褐色區(qū)域；有輻射形溝紋；具滲出液，褐色至暗褐色；分生孢子見圖1B，其頭球形為輻射形。

圖1 菌株J1在PDA平板上的菌落形態(tài)及孢子形態(tài)

在NCBI 上進行BLAST 比對，結(jié)果表明J1與聚多曲霉的同源性為99.82%。結(jié)合菌株的形態(tài)學和分子生物學鑒定菌株J1為聚多曲霉。

2.2 聚多曲酶J1粗酶液中β-葡萄糖苷酶的酶學性質(zhì)研究

2.2.1 不同pH 和溫度對β-葡萄糖苷酶酶活的影響（見圖2）

由圖2可知，聚多曲酶J1粗酶液β-葡萄糖苷酶最適酶促反應pH為5，與大多數(shù)研究結(jié)果一致。推測粗酶液中存在多個β-葡萄糖苷酶組分，使得其在酸性和堿性條件下仍保留20%左右的相對酶活。聚多曲酶J1粗酶液β-葡萄糖苷酶最適酶促反應溫度為60 ℃，由此可見聚多曲酶J1所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶多為嗜溫酶。其他文獻中報道的紅樹林土壤來源的β-葡萄糖苷酶，如紅樹林土壤宏基因組文庫中鑒定表達的Bgl1269最適pH為6.0，最適溫度為40 ℃[14]，同樣從紅樹林土壤宏基因組文庫中鑒定表達的r-mLBgl 最適pH 為7.0，最適溫度為40 ℃[15]。一般來說，生物質(zhì)酶促水解反應溫度為30～50 ℃，其最適酶促反應溫度為60 ℃意味著其可以在較高溫度下進行酶水解反應，可以有效避免雜菌的污染。

圖2 pH和溫度對酶活的影響

2.2.2 葡萄糖對β-葡萄糖苷酶酶活的影響（見圖3）

纖維素資源轉(zhuǎn)化為生物能源過程中產(chǎn)生的葡萄糖可以抑制纖維素水解并起到反饋抑制的作用。因為β-葡萄糖苷酶水解纖維二糖的β-1，4鍵，在糖化過程中積累的葡萄糖會導致β-葡萄糖苷酶的產(chǎn)物抑制，進而導致纖維二糖的積累和其他纖維素分解酶的抑制[16]。研究一般用葡萄糖抑制常數(shù)IC50來衡量β-葡萄糖苷酶的葡萄糖耐受性。聚多曲酶J1粗酶液β-葡萄糖苷酶葡萄糖耐受性試驗結(jié)果如圖3所示，在葡萄糖濃度為200 mmol/L時可保持49.3%活性，其IC50為178.5 mmol/L。有大量學者研究表明[17-20]，曲霉屬A.niger、A.foetidus、A.oryzae、A.japonicus等IC50在10～50 mmol/L不等。所以聚多曲酶J1具有產(chǎn)葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶的潛力，值得進一步挖掘。

圖3 葡萄糖耐受性

2.3 Plackett-Burman試驗（見表2、表3）

通過Plackett-Burman 試驗設(shè)計測定不同組合β-葡萄糖苷酶酶活結(jié)果見表2，各組酶活在0.426～1.367 U/mL 范圍內(nèi)，其中第2組酶活最高。對7個影響因素的效應評價如表3所示，氮源濃度、pH、接種量、轉(zhuǎn)速這4因素為正效應，碳源濃度、溫度和裝液量這3個因素為負效應。其中pH（P=0.000 5）、溫度（P=0.023 9）、接種量（P=0.039 8）3個因素的P值都小于0.05，表明這3個因素具有顯著性，因此選取這3個因素進行爬坡試驗。

表2 Plackett-Burman試驗設(shè)計及結(jié)果

表3 Plackett-Burman設(shè)計的各因素水平及效應評價

2.4 最陡爬坡試驗（見表4）

表4 最陡爬坡路徑試驗設(shè)計及結(jié)果

最陡上升路徑分析表明，隨著pH 和接種量的增加，溫度的減少，酶活呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當pH為8.0、接種量1×106個/mL、溫度28 ℃時，酶活達到最大，為這3 個因素的最大響應值區(qū)域，故Box-Behnken以第3組條件為中心點進行響應面分析。

2.5 Box-Behnken試驗設(shè)計（見表5、表6）

根據(jù)Box-Behnken 試驗設(shè)計確定顯著因子的最優(yōu)水平，試驗設(shè)計及結(jié)果如表5所示，設(shè)計3因子3水平的響應面分析試驗，中心點設(shè)置3 次重復，試驗設(shè)計及結(jié)果分析如表6。由Design-Expert 8.05 軟件進行回歸分析得到多元回歸模型:

表5 回歸模型的方差分析

表6 Box-Behnken設(shè)計因素水平和聚多曲霉J1 β-葡萄糖苷酶酶活

決定系數(shù)R2為0.988 1，說明回歸方程的擬合較好，模型自變量和因變量之間存在顯著線性關(guān)系。模型P值=0.000 3＜0.05，表明此模型顯著；失擬項P=0.213 5＞0.05，表明模型與試驗數(shù)據(jù)之間擬合度好，可用此模型在搖瓶水平預測聚多曲霉J1產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的情況。

2.6 響應面結(jié)果分析（見圖4）

由圖4可知，當接種量不變時，隨著pH增加和溫度升高，β-葡萄糖苷酶酶活先增大后減小，表明在一定范圍內(nèi)，適當增加pH并提高發(fā)酵溫度有利于菌株產(chǎn)酶，pH和溫度交互作用響應面圖坡度較陡且二維等高線圖呈橢圓形，表明對β-葡萄糖苷酶酶活有顯著的影響（圖4A、B）；當溫度不變時，根據(jù)響應面圖的坡度可以看出pH對β-葡萄糖苷酶酶活影響較大，pH和接種量交互作用等高線圖呈圓形，表明其無顯著交互作用（圖4C、D）；當pH不變時，根據(jù)響應面可以看到隨接種量的增加酶活呈不斷上升趨勢，而隨溫度變化酶活先增大后減小，從等高線圖容易看出，溫度對酶活的影響顯著（圖4E、F）。

圖4 兩因素對β-葡萄糖苷酶酶活交互作用影響的等高線和響應面

2.7 模型驗證

根據(jù)該模型，當培養(yǎng)溫度28.7 ℃，初始pH 8.05，接種量5.02×106個/mL，預測的最大響應值為3.2 U/mL。預測相應比優(yōu)化前提高了3倍。為了驗證預測結(jié)果，我們在該優(yōu)化條件下進行了3次平行試驗，測得發(fā)酵液中β-葡萄糖苷酶酶活分別為3.37、3.28、3.26 U/mL，與預測值接近。優(yōu)化后的聚多曲霉J1菌株發(fā)酵條件為：碳源1%、氮源0.5%、pH 8.05、接種量5.02×106個/mL、培養(yǎng)溫度28.7 ℃、搖床轉(zhuǎn)速160 r/min、裝液量100 mL/250 mL。

3 討論

紅樹林生態(tài)系統(tǒng)中蘊含著豐富的微生物資源，包括細菌、真菌等[21]。本研究利用七葉苷平板顯色法[22]從紅樹林腐殖質(zhì)土壤中篩選分離出一株具有高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的真菌，綜合形態(tài)學與分子生物學鑒定[23]結(jié)果鑒定其為聚多曲霉。

傳統(tǒng)上，商業(yè)化纖維素和經(jīng)過處理的生物質(zhì)被用作誘導纖維素酶的碳源，這是生產(chǎn)該類酶最好的方法[24]，但底物通常很昂貴。所以，挖掘可以不受碳源誘導限制而能分泌高效的纖維素酶的生物可以很大程度上降低酶的成本。有研究報道，艾米斯托克籃狀菌可以在不同碳源的培養(yǎng)基中生長并分泌較高水平的纖維素酶[25]。本研究發(fā)現(xiàn)聚多曲酶J1 可以在以葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中分泌較高水平的β-葡萄糖苷酶，這種現(xiàn)象是特殊的，因為纖維素分解酶通常需要纖維素或其衍生物的誘導，而它們在水解過程中會受到水解最終產(chǎn)物葡萄糖的抑制[26]，如Hanif等[27]研究表明葡萄糖的添加對纖維素酶的產(chǎn)生有抑制作用。

據(jù)報道，β-葡萄糖苷酶的差異性與培養(yǎng)基中提供的碳源有關(guān)[28]，這可能是真菌對環(huán)境的一個適應，可以利用這一特性通過控制碳源從該菌株中選擇性地表達所需的酶[24]。有研究表明大多數(shù)微生物β-葡萄糖苷酶對葡萄糖都很敏感[29]，為了獲得具有葡萄糖耐受性特性的酶，本研究以葡萄糖為唯一碳源對聚多曲酶J1進行發(fā)酵，結(jié)果表明粗酶液具有一定的葡萄糖耐受性。

工業(yè)生產(chǎn)中β-葡萄糖苷酶存在酶活低等問題，優(yōu)化其產(chǎn)酶條件是解決該問題的重要途徑之一[30]。已有研究表明固態(tài)發(fā)酵中涉及到的誘導機制較為復雜[31]，碳源、氮源、接種量、溫度和酸堿度等因素都會影響固態(tài)發(fā)酵條件下的產(chǎn)酶水平。Idris 等[32]利用響應面法對里氏木霉的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，優(yōu)化后酶活提高3.2倍。為進一步提高聚多曲酶J1產(chǎn)酶水平，通過響應面法優(yōu)化其發(fā)酵條件，其中接種量、溫度、pH顯著影響了β-葡萄糖苷酶酶活。根據(jù)發(fā)酵中菌體形態(tài)及密度變化我們判斷隨著接種量超過5.05×106個/mL后產(chǎn)酶水平開始下降，可能是由于生長和生物量積累的增加，其中大部分資源用于菌體的生長而非用于產(chǎn)酶；溫度過低或過高均會導致產(chǎn)酶量降低，可能是因為低溫狀態(tài)下菌體生長較為緩慢不利于產(chǎn)酶，而高溫會影響酶的穩(wěn)定性；初始pH 對產(chǎn)酶的影響可能是因為該菌株篩選自紅樹林深層土壤，其生長環(huán)境偏堿性，其最佳發(fā)酵初始pH為8.05，符合海水酸堿度。

4 結(jié)論

①研究從紅樹林土壤中篩選出一株不需要特定碳源誘導產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株J1，綜合形態(tài)學和分子生物學鑒定為聚多曲酶。

②聚多曲酶J1可以產(chǎn)葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶，該酶較好的葡萄糖耐受性使其具有潛在的應用價值與開發(fā)潛力。

③經(jīng)響應面優(yōu)化確定其產(chǎn)β-葡萄糖苷酶最佳發(fā)酵條件為碳源1%、氮源0.5%、pH 8.05、接種量5.02×106個/mL、培養(yǎng)溫度28.7 ℃、搖床轉(zhuǎn)速160 r/min、裝液量100 mL/250 mL，優(yōu)化后酶活提高了約3倍。