兩種澤蘭酸性多糖的結(jié)構(gòu)和生物活性

張武霞，胡懿化，何嘉琦，王星滟，趙晉忠，李 鵬

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)部，中獸醫(yī)藥現(xiàn)代化山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太谷 030801）

植物中豐富的活性多糖具有綠色天然、毒性低等獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，因此被廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥領(lǐng)域[1]。例如，枸杞多糖能夠促進(jìn)雙歧桿菌和乳桿菌的增殖，改善腸道健康[2]。五味子多糖能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫力，上調(diào)血清中硒水平和白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-2的表達(dá)，直接或間接地抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[3]。大棗多糖通過(guò)促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖和淋巴細(xì)胞因子分泌提高機(jī)體免疫功能[4]。柴胡多糖能夠降低炎癥因子水平和巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，從而有效地抑制巨噬細(xì)胞衰老和炎癥衰老[5]。杜仲多糖可以通過(guò)增加機(jī)體的抗氧化因子活性，減少氧化應(yīng)激對(duì)胰腺的損傷，從而改善胰腺組織的損傷[6]。研究發(fā)現(xiàn)多糖主要通過(guò)激活T、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、補(bǔ)體和促進(jìn)腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、IL-6等細(xì)胞因子的生成來(lái)發(fā)揮免疫作用[7-8]。

澤蘭是多年生雙子葉草本植物，其莖葉經(jīng)過(guò)炮制后可入藥，具有活血化瘀、行水消腫、改善血液循環(huán)和補(bǔ)養(yǎng)氣血的功效，現(xiàn)今已被納入保健食品原料（衛(wèi)法監(jiān)發(fā)[2002]51號(hào)文件）[9-10]。澤蘭中含有寡糖水蘇糖和α-低聚半乳糖混合物（alpha-galacto-oligosaccharides，GOS），水蘇糖能夠通過(guò)雙歧桿菌的選擇性增殖來(lái)平衡腸道微生態(tài)系統(tǒng)，GOS可顯著提高體液免疫，并增強(qiáng)脾淋巴細(xì)胞增殖[11]。目前對(duì)澤蘭中的多糖研究停留在粗多糖層面。因此本研究從澤蘭中分離酸性純多糖，利用高效凝膠滲透色譜（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）、化學(xué)比色法，高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）以及紅外光譜對(duì)其分子質(zhì)量、單糖組成等進(jìn)行分析，并通過(guò)化學(xué)和免疫學(xué)方法對(duì)這兩種澤蘭多糖的體外抗氧化活性和細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，以期為澤蘭多糖的生物活性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、動(dòng)物與試劑

澤蘭購(gòu)買(mǎi)于安徽北銘藥業(yè)有限公司。

C57BL/6小鼠購(gòu)買(mǎi)于山西醫(yī)科大學(xué)，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（晉）2020-0003，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（晉）2019-0001；RAW264.7細(xì)胞由西北農(nóng)林科技大學(xué)段金友教授實(shí)驗(yàn)室提供，最初購(gòu)買(mǎi)于上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

甘露糖（mannose，Man）、半乳糖醛酸（galacturonic acid，GalA）、鼠李糖（rhamnose，Rha）、阿拉伯糖（arabinose，Ara）、葡萄糖（glucose，Glc）、半乳糖（galactose，Gal）、巖藻糖（fucose，F(xiàn)uc）、木糖（xylose，Xyl）、噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、伴刀豆球蛋白（concanavalin A，ConA）和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 北京索萊寶公司；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）美國(guó)Sigma-Aldrich公司；小鼠TNF-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒美國(guó)Novus公司；核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）激活-核轉(zhuǎn)運(yùn)試劑盒 上海碧云天公司。其他試劑藥品均為分析純級(jí)別。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800型紫外分光光度計(jì) 上海精科儀器廠；1260型液相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司； TCS SP8型激光掃描共聚焦顯微鏡 德國(guó)Leica公司；DNM-9602型酶標(biāo)分析儀 北京普朗新技術(shù)有限公司；TENSOR 27傅里葉變換紅外光譜儀 德國(guó)Bruker公司；515 HPGPC儀 美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 澤蘭多糖的提取、分離及其純化

將干燥的澤蘭粉碎后，用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液，80 ℃加熱回流2 h脫脂，蒸餾水80 ℃浸提2 h（固液比1∶10），重復(fù)操作3 次，收集合并濾液，進(jìn)行濃縮。濃縮后，向其中加入4 倍體積的95%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇溶液，在低溫條件下沉淀24 h，使多糖完全沉淀后抽濾，收集多糖沉淀，蒸餾水溶解后透析（截留分子質(zhì)量為1 000 Da）。透析后凍干獲得澤蘭粗多糖（記為L(zhǎng)HP）。LHP分別用2 L蒸餾水和不同濃度的NaCl溶液（0.1、0.2、0.5 mol/L）進(jìn)行梯度洗脫，經(jīng)DEAE-52纖維柱（5 cmh50 cm，OH－型）分離純化，上樣量為15 mL，流速為0.5 mL/min，并用硫酸-苯酚法[12]檢測(cè)多糖含量，根據(jù)多糖含量分別收集0.1 mol/L NaCl和0.5 mol/L NaCl洗脫組分，再用蒸餾水以0.2 mL/min流速洗脫，經(jīng)SephadexG-100凝膠過(guò)濾柱層析分離純化后得到兩種純多糖，分別命名為L(zhǎng)HPS1和LHPS5。

1.3.2 澤蘭多糖分子質(zhì)量和化學(xué)組分的測(cè)定

1.3.2.1 分子質(zhì)量的測(cè)定

多糖LHPS1和LHPS5的分子質(zhì)量通過(guò)HPGPC測(cè)定[13]。7?種葡聚糖（5.2、11.6、23.8、48.6、148、273、410 kDa）為標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）。色譜條件：515 HPGPC儀（配備2414示差檢測(cè)器）；3 根分子排阻色譜柱（Ultrahydrogel 250（7.8 mmh30 cm，6 μm）、Ultrahydrogel 1000（7.8 mmh30 cm，12 μm）和Ultrahydrogel 2000（7.8 mmh30 cm，12 μm））串聯(lián)；洗脫液為3 mmol/L乙酸鈉溶液，流速為0.5 mL/min，進(jìn)樣量為100 μL。根據(jù)洗脫峰的保留時(shí)間和對(duì)應(yīng)葡聚糖分子質(zhì)量得到的線性回歸方程，如式（1）所示。

式中：m為分子質(zhì)量；t為保留時(shí)間/min。

1.3.2.2 化學(xué)組分的測(cè)定

分別用硫酸-苯酚法[12]、考馬斯亮藍(lán)法[14]和間羥基聯(lián)苯比色法[15]測(cè)定LHPS1和LHPS5的中性糖、蛋白質(zhì)和糖醛酸的含量。

1.3.2.3 單糖組成的測(cè)定

利用柱前PMP衍生法，通過(guò)HPLC分析LHPS1和LHPS5的單糖組成[16]。將TFA加入多糖LHPS1或LHPS5溶液中振蕩混勻，110 ℃反應(yīng)4 h，徹底水解為單糖，冷卻后旋蒸除去TFA，蒸餾水溶解得到多糖水解液。將50 μL多糖水解液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液與等體積0.6 mol/L的氫氧化鈉溶液充分混合后，加入100 μL 0.5 mol/L的PMP-甲醇溶液混勻，70 ℃反應(yīng)100 min進(jìn)行衍生化。鹽酸中和后，用氯仿多次萃取除去未反應(yīng)的PMP，制備好的樣品溶液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)行HPLC分析。以等物質(zhì)的量的Man、Rha、GalA、Glc、Gal、Xyl、Ara和Fuc作為單糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）通過(guò)同樣方法衍生化并進(jìn)行HPLC測(cè)定。HPLC色譜條件：C18色譜柱（250 mmh4.6 mm，5 mm），柱溫20 ℃，流動(dòng)相A：15%乙腈＋85%磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）；流動(dòng)相B：40%乙腈＋60% PBS；PBS為pH 6.7、0.05 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。各單糖的物質(zhì)的量比參考文獻(xiàn)[17]計(jì)算。

1.3.3 紅外光譜分析

分別稱(chēng)取2 mg冷凍干燥的LHPS1或LHPS5與KBr粉末混合研磨，壓片，用紅外光譜儀在4 000～400 cm－1波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描[18]。

1.3.4 澤蘭多糖體外抗氧化活性的測(cè)定

將LHPS1和LHPS5配成質(zhì)量濃度分別為0.5、1、2、4、8 mg/mL的樣品溶液，參照文獻(xiàn)[19]測(cè)定LHPS1和LHPS5的總還原能力和DPPH自由基清除能力，評(píng)估兩種澤蘭酸性多糖的體外抗氧化活性。樣品總還原能力以700 nm波長(zhǎng)處的吸光度A700nm表征，DPPH自由基清除能力以DPPH自由基清除率表征。

1.3.5 澤蘭多糖細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性的測(cè)定

1.3.5.1 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性的測(cè)定

MTT法體外評(píng)估澤蘭多糖對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響[20]。利用頸椎脫臼法處死小鼠，無(wú)菌取出脾臟置于100 目的篩網(wǎng)上，用5 mL注射器芯緩慢研磨，用0.01 mol/L PBS（pH 7.4）洗滌2 次后，加入紅細(xì)胞裂解液裂解，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液后，用1640培養(yǎng)基洗滌2 次，將獲得的脾淋巴單細(xì)胞培養(yǎng)于1640培養(yǎng)基。終質(zhì)量濃度分別為50、100、200 μg/mL的LHPS1或LHPS5作用小鼠脾淋巴細(xì)胞（1h107個(gè)/mL，90 μL/孔），以等體積的PBS為空白對(duì)照，以ConA（終質(zhì)量濃度5 μg/mL）和LPS（終質(zhì)量濃度2.5 μg/mL）為兩個(gè)陽(yáng)性對(duì)照，孵育48 h后加入10 μL MTT（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值OD600nm以表征小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性。

1.3.5.2 RAW264.7細(xì)胞吞噬能力和TNF-α質(zhì)量濃度的測(cè)定

采用中性紅法測(cè)定RAW264.7細(xì)胞的吞噬能力[21]。將RAW264.7細(xì)胞（1h105個(gè)/mL）接種于96 孔板（90 μL/孔），分別加入10 μL LHPS1或LHPS5（終質(zhì)量濃度分別為50、100、200 μg/mL）孵育24 h，再加入0.07%中性紅溶液孵育2 h。棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌2 次。加入裂解緩沖液（1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）冰醋酸-乙醇（等體積混合），100 μL/孔），在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。分別以等體積PBS和LPS（2.5 μg/mL）作為空白對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。按式（2）計(jì)算吞噬指數(shù)。

式中：A加藥組為加入不同質(zhì)量濃度澤蘭多糖或LPS溶液孵育24 h后測(cè)得的吸光度；A空白對(duì)照為加入PBS孵育24 h后測(cè)得的吸光度。

用LHPS1或LHPS5（終質(zhì)量濃度分別為50、100、200 μg/mL）處理RAW264.7細(xì)胞24 h，以等體積的PBS為空白對(duì)照，LPS（終質(zhì)量濃度2.5 μg/mL）為陽(yáng)性對(duì)照。收集上清液，根據(jù)ELISA試劑盒的操作說(shuō)明測(cè)定細(xì)胞上清液中的TNF-α的質(zhì)量濃度。

1.3.5.3 甘露糖抑制劑處理

將RAW264.7細(xì)胞（5h105個(gè)/mL）接種到96 孔板（80 μL/孔）中。設(shè)置無(wú)Man預(yù)處理組和Man預(yù)處理組，LPS作為陽(yáng)性對(duì)照。無(wú)Man預(yù)處理組先各加10 μL PBS作用1 h后，再分別加入10 μL PBS（空白對(duì)照）、LPS（25 μg/mL）、LHPS1（2 000 μg/mL）、LHPS5（2 000 μg/mL）；Man預(yù)處理組：提前加入10 μL Man（5 000 μg/mL）作用1 h后，再分別加入10 μL的PBS（空白對(duì)照）、LPS（25 μg/mL）、LHPS1（2 000 μg/mL）、LHPS5（2 000 μg/mL）。37 ℃孵育24 h后，使用ELISA試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)上清液中TNF-α的質(zhì)量濃度。

1.3.5.4 NF-κB激活-核轉(zhuǎn)運(yùn)檢測(cè)

用NF-κB激活-核轉(zhuǎn)運(yùn)試劑盒檢測(cè)LHPS1和LHPS5是否能夠激活RAW264.7中的NF-κB核轉(zhuǎn)錄因子。分別用200 μg/mL LHPS1、LHPS5和2.5 μg/mL的LPS處理RAW264.7細(xì)胞3 h，吸除培養(yǎng)液，洗滌和固定，用封閉緩沖液孵育細(xì)胞1 h。加入一抗NF-κB p65亞基孵育1 h后，加入異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的山羊抗兔抗體G（H＋L）孵育1 h。4’,6-二氨基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）處理5 min后，用激光共聚焦顯微鏡觀察呈藍(lán)色熒光的細(xì)胞核和呈綠色熒光的NF-κB p65亞基。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。用GraphPad Prism 5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。采用單因素方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著，P＜0.001表示差異高度顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 澤蘭多糖的組成

2.1.1 分子質(zhì)量和化學(xué)組成

LHPS1和LHPS5的HPGPC分析結(jié)果如圖1所示，樣品LHPS1和LHPS5分別在37.988 min和39.067 min出現(xiàn)較窄的吸收峰，說(shuō)明這兩種多糖純度比較高。根據(jù)公式（1）計(jì)算得LHPS1和LHPS5的分子質(zhì)量分別為1.13h105Da和7.40h104Da。

圖1 LHPS1（A）和LHPS5（B）的HPGPC圖Fig. 1 High performance gel permeation chromatograms of LHPS1 (A)and LHPS5 (B)

LHPS1和LHPS5的化學(xué)組成如表1所示，LHPS1主要成分是中性糖（（91.55f0.22）%），還含有（11.47f0.23）%糖醛酸。LHPS5主要含有中性糖、蛋白質(zhì)和糖醛酸，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別是（28.38f0.14）%、（51.60f2.05）%和（12.43f0.33）%。兩種多糖中均含有一定量的糖醛酸，這說(shuō)明LHPS1和LHPS5均是酸性多糖。

表1 澤蘭多糖分子質(zhì)量及組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 1 Molecular masses and compositions of polysaccharides from Lycopi Herba

2.1.2 單糖組成

為了確定單糖的組成，用TFA水解LHPS1或LHPS5，用PMP進(jìn)一步對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行柱前衍生化后，HPLC分析結(jié)果如圖2所示，LHPS1和LHPS5具有相似的單糖組成，都主要含有Man、Rha、GalA、Glc、Gal和Ara，但比例不同，LHPS1中Man、Rha、GalA、Glc、Gal和Ara物質(zhì)的量比為13.05∶6.08∶1.83∶7.79∶55.32∶15.93，LHPS5中為17.65∶10.81∶12.52∶10.43∶25.54∶9.15。

圖2 單糖標(biāo)準(zhǔn)品（A）、LHPS1（B）和LHPS5（C）的HPLC圖Fig. 2 High performance liquid chromatograms of a mixture of monosaccharide standards (A), LHPS1 (B) and LHPS5 (C)

2.2 澤蘭多糖紅外光譜分析結(jié)果

如圖3所示，LHPS1和LHPS5分別在3 391.33 cm－1和3 299.7 cm－1處出現(xiàn)較寬的吸收峰，這說(shuō)明它們結(jié)構(gòu)中均含有羥基官能團(tuán)。在1 640 cm－1附近有C＝O伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的吸收峰，說(shuō)明LHPS1和LHPS5的結(jié)構(gòu)中含有糖醛酸。此外，LHPS5在1 640 cm－1附近的透光率比LHPS1的大，結(jié)合表1結(jié)果分析可知，LHPS5在1 640 cm－1附近的峰還可能是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中酰胺鍵的伸縮振動(dòng)引起的。在1 401 cm－1附近的吸收峰是由CüH的可變角振動(dòng)引起的。在950～1 200 cm－1處的吸收峰是由CüOüC和CüO的伸縮振動(dòng)引起的[22]。

圖3 LHPS1（A）和LHPS5（B）的紅外光譜圖Fig. 3 Infrared spectra of LHPS1 (A) and LHPS5 (B)

2.3 澤蘭多糖的體外抗氧化活性

通過(guò)體外補(bǔ)充抗氧化成分可以減輕氧化損傷和延緩衰老[23]。因此，從植物中研究篩選出抗氧化活性成分對(duì)于保護(hù)人類(lèi)健康具有重要意義[24]。通過(guò)測(cè)定LHPS1和LHPS5的總還原能力和DPPH自由基清除率評(píng)估其抗氧化活性。結(jié)果表明LHPS1和LHPS5具有良好的體外抗氧化活性（圖4）。樣品總還原能力（A700nm）與樣品呈劑量依賴(lài)關(guān)系，這說(shuō)明樣品溶液的還原能力隨質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)，LHPS5的總還原能力強(qiáng)于LHPS1（圖4A）。LHPS1和LHPS5 DPPH自由基清除能力（以DPPH自由基清除率表征）也隨樣品質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)。樣品質(zhì)量濃度達(dá)到8 mg/mL時(shí)，LHPS1和LHPS5的DPPH自由基清除率達(dá)到最高，分別是54%和65%。此外，LHPS5 DPPH自由基清除能力也強(qiáng)于LHPS1（圖4B）。這些結(jié)果說(shuō)明LHPS1和LHPS5具有成為抗氧化補(bǔ)充劑的潛能。

圖4 澤蘭多糖抗氧化活性評(píng)估Fig. 4 Assessment of antioxidant activity of polysaccharides from Lycopi Herba

2.4 澤蘭多糖的細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性

2.4.1 澤蘭多糖對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響

脾淋巴細(xì)胞增殖活性是評(píng)估多糖免疫活性的重要指標(biāo)[25]。如圖5所示，LHPS1和LHPS5能夠明顯促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的增殖。LHPS1的促增殖能力呈劑量依賴(lài)增強(qiáng)，質(zhì)量濃度為200 μg/mL時(shí)，LHPS1的促增殖能力最強(qiáng)。LHPS5在質(zhì)量濃度為100 μg/mL和50 μg/mL時(shí)表現(xiàn)出最強(qiáng)的促增殖能力。

圖5 LHPS1和LHPS5對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖的影響Fig. 5 Effects of LHPS1 and LHPS5 on splenocyte proliferation

2.4.2 澤蘭多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬能力和TNF-α質(zhì)量濃度的影響

先前研究表明在炎癥反應(yīng)過(guò)程中最早產(chǎn)生的炎癥細(xì)胞因子TNF-α能夠激活淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，同時(shí)能夠調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)并促進(jìn)其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生[26]。如圖6A所示，LHPS1和LHPS5能顯著增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞的吞噬能力。LHPS1和LHPS5顯著促進(jìn)了RAW264.7細(xì)胞中TNF-α的產(chǎn)生，其中LHPS5的促進(jìn)作用強(qiáng)于LHPS1（圖6B）。研究表明TNF-α表達(dá)失調(diào)和許多疾病有關(guān)，如阿爾茨海默癥、抑郁癥、銀屑病等[27-28]，因此，能夠促進(jìn)TNF-α產(chǎn)生的LHPS1和LHPS5可能對(duì)這些疾病具有預(yù)防和治療作用。

圖6 LHPS1和LHPS5對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬能力（A）和TNF-α分泌水平（B）的影響Fig. 6 Effects of LHPS1 and LHPS5 on the phagocytosis index (A) and TNF-α production (B) of RAW264.7 cells

2.4.3 甘露糖對(duì)澤蘭多糖激活RAW264.7免疫應(yīng)答的影響

為了驗(yàn)證Man受體（Man receptor，MR）是否參與LHPS1和LHPS5對(duì)RAW264.7細(xì)胞的激活作用，本實(shí)驗(yàn)采用MR的抑制劑Man預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞。如圖7所示，LHPS1和LHPS5（200 μg/mL）刺激Man預(yù)處理的RAW264.7細(xì)胞后，培養(yǎng)液中TNF-α質(zhì)量濃度降低。這說(shuō)明MR可能是RAW264.7細(xì)胞中LHPS1和LHPS5激活巨噬細(xì)胞的受體之一。單糖組成分析結(jié)果顯示兩種澤蘭多糖含有一定比例的Man，因此其可以和細(xì)胞表面的MR結(jié)合從而激活RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α。

圖7 Man對(duì)澤蘭多糖刺激RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α的影響Fig. 7 Effect of mannose on TNF-α production in RAW264.7 cells stimulated by polysaccharides from Lycopi Herba

2.4.4 NF-κB激活-核轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

NF-κB是存在于動(dòng)物細(xì)胞中的一種核轉(zhuǎn)錄因子，一般與NF-κB的抑制蛋白IκB以復(fù)合體的形式存在于細(xì)胞漿中。當(dāng)細(xì)胞受到外界藥物刺激，復(fù)合體被激活后解聚，核定位序列暴露，被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)識(shí)別靶基因上的結(jié)合位點(diǎn)，從而促使靶基因的轉(zhuǎn)錄[29]。

如圖8所示，LPS、LHPS1和LHPS5分別與RAW264.7細(xì)胞作用后，在RAW264.7細(xì)胞中觀察到所有刺激都導(dǎo)致NF-κB p65蛋白亞基（綠色熒光）移位到細(xì)胞核（藍(lán)色熒光）中，NF-κB被激活，這證明LHPS1和LHPS5都是有效的NF-κB激活劑，能夠參與細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等過(guò)程。結(jié)果表明，LHPS1和LHPS5能夠通過(guò)激活RAW264.7細(xì)胞的核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB來(lái)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞免疫活性。

圖8 LHPS1和LHPS5激活RAW264.7細(xì)胞中NF-κB p65蛋白Fig. 8 LHPS1 and LHPS5 activated NF-κB p65 in RAW264.7 cells

3 討 論

近年來(lái)，采用不同工藝手段從澤蘭中提取出粗多糖。例如，通過(guò)超聲提取、酶法提取和水提取等不同工藝提取的澤蘭粗多糖具有抗氧化的藥理活性[30-31]。本研究旨在提取分離出澤蘭中潛在的純多糖，并探討其結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性。

本研究從澤蘭中鑒別出兩種酸性純多糖LHPS1和LHPS5。結(jié)果表明，LHPS1和LHPS5具有顯著的還原能力和DPPH自由基清除能力，這說(shuō)明LHPS1和LHPS5與澤蘭粗多糖一樣具有抗氧化活性，并且還發(fā)現(xiàn)LHPS5的抗氧化能力強(qiáng)于LHPS1。此外，LHPS1和LHPS5能夠顯著增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞的吞噬能力，促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的增殖和RAW264.7細(xì)胞中TNF-α的產(chǎn)生。研究報(bào)道植物多糖的生物活性與其單糖組成、分子質(zhì)量、化學(xué)組成、構(gòu)象、分支程度和官能團(tuán)有關(guān)[32-33]。例如，水果桑葚由糖醛酸和7種中性單糖組成，可有效激活小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，同時(shí)誘導(dǎo)包括TNF-α、IL-6和COX-2等其他免疫相關(guān)基因的表達(dá)[34]。類(lèi)似地，高分子質(zhì)量、高糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)和豐富的單糖種類(lèi)使LHPS1和LHPS5具有顯著的抗氧化活性和免疫調(diào)節(jié)活性，但由于LHPS1和LHPS5中中性糖、蛋白、糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)和各種單糖比例不同，因此它們的抗氧化作用和免疫調(diào)節(jié)作用強(qiáng)弱也不同。

Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）介導(dǎo)髓樣分化因子（myeloid differentiation factor88，MyD88）和NF-κB的這條信號(hào)通路（TLR-MyD88-NF-κB）是機(jī)體炎癥體系中最經(jīng)典的途徑，在多種疾病的發(fā)生和治療過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[35]。據(jù)報(bào)道，百合多糖[36]、小鹿藿根多糖[37]和黃芪多糖[38]能夠通過(guò)TLR4和MR介導(dǎo)的信號(hào)通路促進(jìn)免疫反應(yīng)中細(xì)胞因子的表達(dá)。LHPS1和LHPS5能夠激活RAW264.7細(xì)胞中的NF-κB，并且MR抑制劑能夠部分抑制其誘導(dǎo)的TNF-α的分泌，這說(shuō)明LHPS1和LHPS5可以通過(guò)MR和NF-κB信號(hào)通路激活RAW264.7細(xì)胞發(fā)生免疫應(yīng)答。此外，MR抑制劑不能完全抑制TNF-α的分泌，說(shuō)明巨噬細(xì)胞上還存在其他可識(shí)別澤蘭多糖的受體。