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      生長調(diào)節(jié)劑GN-01對蛹蟲草寄生性病原真菌的誘導(dǎo)抗病效果

      2022-05-30 13:46:24崔芙蓉王升厚李夢雪柳葉飛徐方旭
      南方農(nóng)業(yè)·上旬 2022年9期
      關(guān)鍵詞:植物生長調(diào)節(jié)劑

      崔芙蓉 王升厚 李夢雪 柳葉飛 徐方旭

      摘 要 以不同地區(qū)表現(xiàn)白毛病特征的蛹蟲草為材料,分離獲得2種病原真菌,對其進行形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定,其中BYJ1鑒定為日耳曼曲霉(Aspergillus germanicus),BYJ2為焦曲霉(Aspergillus ustus)。通過侵染實驗探討不同添加方法下,植物生長調(diào)節(jié)劑GN-01對蛹蟲草寄生性病原真菌的抗性誘導(dǎo)作用。結(jié)果表明,在培養(yǎng)基中加入或在蛹蟲草生長過程中加入稀釋3 000倍的GN-01可顯著提高蛹蟲草SOD和POD酶活性,降低蛹蟲草白毛病發(fā)病率,說明GN-01可作為防控蛹蟲草寄生性病原真菌的抗性誘導(dǎo)劑。

      關(guān)鍵詞 蛹蟲草;寄生性病原真菌;植物生長調(diào)節(jié)劑;誘導(dǎo)抗病性

      中圖分類號:Q93 文獻標志碼:A DOI:10.19415/j.cnki.1673-890x.2022.17.022

      蛹蟲草(Cordyceps militaris)是一種藥食同源真菌,含有蟲草素、蟲草酸及蟲草多糖等活性成分[1-2]。在蛹蟲草栽培過程中,白毛病危害較為嚴重,極易造成蛹蟲草子實體倒伏和矮小畸形。植物生長調(diào)節(jié)劑是人工合成或天然提取的具有激素生理活性的化合物,目前在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用,并取得了顯著效果。本實驗對蛹蟲草栽培過程中感染的病原真菌進行分離純化及鑒定,通過侵染實驗探究植物生長調(diào)節(jié)劑GN-01對蛹蟲草寄生性病原真菌的誘導(dǎo)抗病作用,旨在為白毛病的控制及預(yù)防提供理論依據(jù)[3]。

      1? 材料與方法

      1.1? 實驗材料

      不同區(qū)域發(fā)病的蛹蟲草、蛹蟲草菌株P(guān)T07(沈陽師范大學(xué)特種菌業(yè)研究所提供)、植物生長調(diào)節(jié)劑(GN-01)、真菌基因組DNA快速抽提試劑盒、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato Dextrose Agar,PDA)培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖水(Potato Dextrose Broth,PDB)培養(yǎng)基[4]。

      1.2? 實驗方法

      1.2.1? 病原真菌分離純化

      刮取發(fā)病蛹蟲草上的病原真菌菌絲,采用劃線法將其接種于PDA培養(yǎng)基上,25 ℃恒溫培養(yǎng)3~7 d;待有菌落形成時,挑取單個菌落,用點接法將其接種至PDA培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。重復(fù)上述操作,直到純化出單一菌落,于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆肹5]。

      1.2.2? 病原真菌形態(tài)鑒定

      將純化后的病原真菌接種于PDA培養(yǎng)基上,25 ℃條件下培養(yǎng)至生長出完整的菌落,觀察菌落形態(tài)特征。利用光學(xué)顯微鏡觀察菌絲和孢子的形態(tài)特征,參照《真菌鑒定手冊》進行形態(tài)學(xué)鑒定。

      1.2.3? 病原真菌分子生物學(xué)鑒定

      將純化后的病原真菌接種于PDA斜面上,樣品送至上海派諾森生物科技有限公司進行真菌基因組DNA提取、真菌基因組PCR擴增、PCR產(chǎn)物的回收及DNA序列的對比分析。將所得序列文件與NCBI數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行比對,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

      1.2.4? 病原真菌侵染蛹蟲草子實體

      GN-01稀釋濃度(均為體積濃度)分別為1∶50(2號)、1∶100(3號)、1∶200(4號)、1∶500(5號)、1∶1 000(6號)、1∶3 000(7號)、1∶3 500(8號)和1∶4 000(9號),對照組(1號)為清水。分別在蛹蟲草栽培培養(yǎng)基中和生長過程中加入不同稀釋濃度的GN-01,并按照蛹蟲草常規(guī)方法進行培養(yǎng)。

      將分離所得病原真菌接種于PDB培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)7 d,將菌體打碎,用無菌水稀釋100倍備用。選擇生長到第35 d的、2種不同培養(yǎng)方式的蛹蟲草子實體進行病原菌侵染實驗,對照組補等量清水,在20 ℃培養(yǎng)55 d后測定防御酶活性及發(fā)病率。

      1.3? 指標檢測

      1.3.1? SOD和POD酶活性測定

      SOD和POD酶活性測定的藥品配制及實驗步驟參照文獻[6]的方法進行。

      1.3.2? 發(fā)病率測定

      按照公式(1)計算不同實驗組別蛹蟲草總發(fā)病率。

      發(fā)病率=(發(fā)病數(shù)/總數(shù))×100%? (1)

      1.4? 數(shù)據(jù)分析

      采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

      2? 結(jié)果與分析

      2.1? 病原真菌形態(tài)鑒定

      分離所得病原真菌分別命名為BYJ1和BYJ2。如圖1所示,2種病原真菌在PDA培養(yǎng)基中生長3~7 d 后,菌絲部分為白色,不透明,菌絲致密,邊緣規(guī)則;菌落顏色正反一致,生長速度較慢;菌絲分枝,有隔;有明顯成熟脫落的孢子且孢子較小,孢子直徑為3.8~4.5 μm。BYJ1菌株菌絲寬度為2.0~5.0 μm,BYJ2菌株菌絲寬度為5.0~6.3 μm。

      2.2? 病原真菌的分子鑒定

      將病原菌BYJ1和BYJ2所得序列進行拼接后與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列數(shù)據(jù)進行比對。由圖2可知,BYJ1為日耳曼曲霉(Aspergillus germanicus),BYJ2為焦曲霉(Aspergillus ustus)。

      2.3? GN-01對蛹蟲草抗病能力的影響

      2.3.1? GN-01對蛹蟲草防御氧化酶活性的影響

      隨著在栽培培養(yǎng)基中添加或在生長過程中補加GN-01稀釋倍數(shù)的增大,蛹蟲草子實體的SOD和POD酶活性呈先增強后降低的趨勢,在稀釋倍數(shù)為3 000時(7號樣品)防御氧化酶活性最高,說明蛹蟲草子實體在受到病原真菌侵害時,適當(dāng)濃度的GN-01可誘導(dǎo)SOD和POD酶活性明顯上升,以抵抗病原真菌侵害(見圖3、圖4)。

      2.3.2? GN-01對蛹蟲草發(fā)病率的影響

      由表1可知,在培養(yǎng)基中添加或在生長過程中補加稀釋50~4 000倍的GN-01,蛹蟲草白毛病發(fā)病率呈逐漸降低趨勢。這說明蛹蟲草受到病原真菌侵害時,在栽培培養(yǎng)基中添加或在生長過程中補加稀釋50~4 000倍的GN-01可顯著減輕病原真菌的侵害,提高蛹蟲草的抗病性。

      2.4? 侵染實驗

      根據(jù)前述預(yù)實驗結(jié)果,選擇稀釋3 000倍的

      GN-01進行病原真菌侵染抗性實驗。如圖5所示,與對照組相比,在栽培培養(yǎng)基中添加和在生長過程中補加稀釋3 000倍的GN-01,蛹蟲草子實體的發(fā)病程度均呈著減輕,與前述的預(yù)實驗結(jié)果相吻合。

      3? 討論與結(jié)論

      植物誘導(dǎo)抗病性被認為是植物保護技術(shù)的新途徑。蛹蟲草自身具有一套完整的防御體系,生物或非生物脅迫都可刺激這種防御反應(yīng),因此通常將防御酶活性變化作為衡量植株防御能力的重要指標。SOD可清除自由基,延緩植物衰老;POD可減少活性氧積累,保護膜結(jié)構(gòu)完整。本實驗以在蛹蟲草培養(yǎng)基添加GN-01和在生長過程中補加GN-012種實驗所得的蛹蟲草子實體為原材料,對蛹蟲草的防御酶活性進行測定,以探究GN-01對蛹蟲草的誘導(dǎo)抗病性作用。結(jié)果表明,當(dāng)蛹蟲草受到病原真菌侵害時,在栽培培養(yǎng)基中添加或在生長過程中補加稀釋50~3 000倍的GN-01時,SOD和POD酶活性呈上升趨勢,且在GN-01稀釋倍數(shù)為3 000時,SOD和POD酶活性達到峰值,能有效減輕病原真菌的侵害,提升蛹蟲草的抗病性,侵染實驗結(jié)果與酶活性實驗結(jié)果吻合。

      將植物生長調(diào)節(jié)劑作為病原菌抑制劑進行開發(fā)有較好的應(yīng)用前景,在栽培培養(yǎng)基中添加或在生長過程中補加稀釋3 000倍的GN-01,都可提高蛹蟲草相關(guān)防御酶活性,有效防治蛹蟲草寄生性病原真菌病害的發(fā)生。目前,蛹蟲草寄生性病原真菌研究體系還不完整,大部分的致病機制有待深入研究,未來應(yīng)著重研究病原菌致病機制和篩選蛹蟲草優(yōu)良抗病菌株。

      參考文獻:

      [1] Sung G H, Hywel-Jones N L, Sung J M, et al. Phylogenetic classification of Cordyceps and the clavicipitaceous fungi[J]. Studies in Mycology, 2007, 57(1): 55-59.

      [2] 王尊生,王升厚,袁勤生.冬蟲夏草(Cordyceps sinensis)菌絲體固體發(fā)酵粉中麥角甾醇的定量分析[J].沈陽師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2005(3):293-296.

      [3] 張卉,郝國良,徐俊斌.生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化[J].沈陽師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2011,29(2):293-296.

      [4] 趙穎,于飛,郭明敏,等.堿蓬內(nèi)生真菌JP3的分離、鑒定及促生作用研究[J].沈陽師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2015,33(1):116-120.

      [5] 馬蓮菊,朱淼,汪雅楠,等.根瘤菌多樣性研究技術(shù)進展[J].沈陽師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2021,39(6):538-543.

      [6] 高華晨.不同高粱品種抗氧化指標及內(nèi)源激素分析[D].沈陽:沈陽師范大學(xué),2019.

      (責(zé)任編輯:張春雨? 丁志祥)

      收稿日期:2022-07-12

      基金項目:遼寧省科技廳重大科技攻關(guān)項目“遼寧蟲草產(chǎn)業(yè)群生產(chǎn)性種源繁育體系風(fēng)險防范技術(shù)研究”(2019JH2/10200003)。

      作者簡介:崔芙蓉(1997—),女,遼寧撫順人,在讀碩士,研究方向為微生物資源與利用。

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