康楠偉　薛雁　劉翠　陳蕾

[摘要] 目的 探究內(nèi)源性apelin對大鼠丘腦底核神經(jīng)元興奮性的影響。方法 利用在體細胞外單一細胞電生理實驗，使用三管玻璃微電極微壓力注射10 μmol/L apelin受體阻斷劑ML221，觀察其對正常大鼠丘腦底核神經(jīng)元自發(fā)放電頻率的影響。結果 丘腦底核注射ML221使8個神經(jīng)元的自發(fā)放電頻率顯著降低（t=4.263，P<0.01），使另外5個神經(jīng)元的自發(fā)放電頻率增加（t=-1.697，P>0.05）。結論 丘腦底核內(nèi)源性apelin可雙向調(diào)節(jié)神經(jīng)元放電頻率，以興奮效應為主。

[關鍵詞]愛帕琳肽;丘腦底核;神經(jīng)電生理監(jiān)測;大鼠

[中圖分類號]R338.2[文獻標志碼]A[文章編號]2096-5532（2022）03-0357-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.116

EFFECT OF ENDOGENOUS APELIN ON THE EXCITABILITY OF SUBTHALAMIC NEURONS IN RATS

KANG Nanwei， XUE Yan， LIU Cui， CHEN Lei

（Department of Physiology and Pathophysiology，? School of Basic Medicine， Qingdao University Medical College， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT] Objective To investigate the effect of endogenous apelin on the excitability of subthalamic neurons in rats.Methods An in vivo electrophysiological single-unit experiment was performed， and micropressure injection of 10 μmol/L apelin receptor blocker， ML221， was performed using a three-barrel glass microelectrode to observe its effect on the spontaneous discharge frequency of subthalamic neurons in normal rats.?Results Injection of ML221 into the subthalamic nucleus significantly reduced the spontaneous discharge frequency of 8 neurons （t=4.263，P<0.01） and increased the spontaneous discharge frequency of another 5 neurons （t=-1.697，P>0.05）.?Conclusion Endogenous apelin bidirectionally modulates the spontaneous discharge frequency of subthalamic neurons and mainly exerts an excitatory effect.

[KEY WORDS] apelin; subthalamic nucleus; neurophysiological monitoring; rats

Apelin是由長度為77個氨基酸的前體肽被血管緊張素酶2切割成的不同亞型的生物活性肽，根據(jù)其C末端氨基酸數(shù)量可分為apelin-13、apelin-17和apelin-36等[1-2]。apelin受體屬于7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體家族[3]。apelin及其受體系統(tǒng)廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)[3-4]。有文獻報道，apelin與機體運動調(diào)控密切相關[5-6]。丘腦底核是基底神經(jīng)核間接通路和超直接通路中的關鍵核團，在軀體運動調(diào)控中發(fā)揮重要功能[7]。丘腦底核深部腦刺激可以增強與運動和認知網(wǎng)絡相關的振蕩活動，降低丘腦底核神經(jīng)元的興奮性，改善運動和認知能力[8]。形態(tài)學研究結果證實，丘腦底核表達apelin及其受體，然而內(nèi)源性apelin對丘腦底核神經(jīng)元放電頻率的影響目前尚不清楚。為此，本實驗用apelin受體阻斷劑ML221阻斷丘腦底核內(nèi)源性apelin，利用在體電生理記錄方法觀察內(nèi)源性apelin是否參與調(diào)控丘腦底核神經(jīng)元自發(fā)放電活動。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物成年雄性Wistar大鼠，體質量250～300 g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司。大鼠每籠5只飼養(yǎng)在（22±1）℃的溫控室內(nèi)，給予人工光照（12 h光暗循環(huán)），正常標準飲食，自由飲水。在開始實驗前適應環(huán)境1周。所有動物實驗操作均遵循醫(yī)學倫理學原則。

1.1.2實驗藥品ML221購于美國MedChemExpress公司，烏拉坦購于上海麥克林生化科技有限公司，滂胺天藍和乙酸鈉溶液購于美國Sigma公司。

1.2實驗方法

腹腔注射烏拉坦1 g/kg麻醉大鼠，將大鼠放置在立體定向框架中，水平固定頭部，切牙桿位于雙耳線下方3.3 mm處。定位丘腦底核（前囟后3.1～4.2 mm，旁開2.0～3.0 mm，顱骨外表面下7.2～9.0 mm）并進行開顱手術。三管玻璃微電極的記錄電極管內(nèi)注入含有20 g/L滂胺天藍的0.5 mol/L乙酸鈉溶液，其余兩管則分別注入無菌生理鹽水和10 μmol/L的ML221[9]。使用液壓推進器將玻璃微電極尖端推至丘腦底核，記錄到神經(jīng)元放電并穩(wěn)定5 min后，通過生物細胞納升精密注射器將生理鹽水或ML221注射到記錄的細胞表面。放大器和數(shù)模轉換器將生物信號轉化為數(shù)字信號后傳輸至計算機，用Spike 2軟件進行記錄和分析。

以加藥前120 s的平均放電頻率為基礎放電頻率，加藥后反應高峰處50 s的平均放電頻率為藥物反應頻率。如果藥物反應頻率大于基礎放電頻率均數(shù)+2倍標準差或小于基礎放電頻率均數(shù)-2倍標準差，則認為神經(jīng)元對藥物有反應，否則認為神經(jīng)元對藥物無反應。

1.3統(tǒng)計學分析

采用SPSS軟件進行統(tǒng)計學分析。實驗數(shù)據(jù)以x±s形式表示，神經(jīng)元加藥前后放電頻率的比較采用配對t檢驗，兩組神經(jīng)元自發(fā)放電頻率的比較采用成組t檢驗;細胞放電頻率變化百分數(shù)的比較采用曼-惠特尼秩和檢驗;ML221對神經(jīng)元自發(fā)放電頻率影響與基礎放電頻率的關系分析采用雙變量相關分析方法。以P<0.05為差異有顯著性。

2結果

2.1丘腦底核微量注射ML221對大鼠神經(jīng)元放電頻率的影響

在記錄到的6個丘腦底核神經(jīng)元中，微壓力注射生理鹽水后，其放電頻率由（7.44±2.39）Hz變?yōu)椋?.56±2.49）Hz（t=-0.346，P>0.05），放電頻率變化百分數(shù)為（4.15±4.77）%。另外記錄到的18個丘腦底核神經(jīng)元，其基礎放電頻率為（5.39±0.94）Hz。微壓力注射10 μmol/L的ML221可使其中8個神經(jīng)元的自發(fā)放電頻率由（7.44±1.41）Hz降低至（1.81±0.32）Hz（t=4.263，P<0.01）;其放電頻率降低百分數(shù)為（72.34±6.10）%，與生理鹽水對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（Z=-3.098，P<0.01）。在另外5個神經(jīng)元中，ML221使細胞自發(fā)放電頻率由（2.80±0.90）Hz升高至（5.06±2.12）Hz（t=-1.697，P>0.05），雖然差異無顯著意義，但單獨分析這5個細胞，其加藥后放電頻率均大于基礎放電頻率均數(shù)+2倍標準差，故認為ML221增加其放電頻率;這5個神經(jīng)元放電頻率增加的百分數(shù)為（64.85±19.86）%，與生理鹽水對照組比較差異有顯著性（Z=2.739，P<0.01）。在剩余的5個丘腦底核神經(jīng)元中，注射ML221后，其自發(fā)放電頻率由（3.08±1.51）Hz變?yōu)椋?.24±1.56）Hz（t=-2.390，P>0.05），加藥后放電頻率均小于基礎放電頻率均數(shù)+2倍標準差且大于基礎放電頻率均數(shù)-2倍標準差，放電頻率變化的百分數(shù)為（8.82±4.38）%。見圖1。

2.2ML221對丘腦底核神經(jīng)元自發(fā)放電頻率調(diào)控與基礎放電頻率及神經(jīng)元放電模式的關系

上述ML221引起放電頻率降低的8個丘腦底核神經(jīng)元的自發(fā)放電頻率為（7.44±1.41）Hz，而ML221引起放電頻率增加的5個丘腦底核神經(jīng)元的自發(fā)放電頻率為（2.80±0.90）Hz，兩組神經(jīng)元自發(fā)放電頻率比較差異有統(tǒng)計學意義（t=2.392，P<0.05）。ML221引起的放電頻率降低（r=-0.409，P>0.05）和增加（r=0.620，P>0.05）與基礎放電頻率沒有相關性。

根據(jù)放電間隔直方圖和自相關圖分析，丘腦底

核神經(jīng)元分為規(guī)則放電、不規(guī)則放電和簇狀放電3種放電模式。在ML221引起放電頻率降低的8個神經(jīng)元中，這3種放電模式所占比例分別為12.5%、25.0%和62.5%;而在ML221引起放電頻率增加的5個丘腦底核神經(jīng)元中，這3種放電模式所占比例分別為20.0%、20.0%和60.0%。

3討論

基底神經(jīng)核是包括紋狀體、蒼白球、黑質及丘腦底核等核團在內(nèi)的皮質下一系列核團的總稱，其中紋狀體是其輸入結構，蒼白球內(nèi)側部和黑質網(wǎng)狀帶是其輸出結構。輸入、輸出結構之間核團的信息交流構成兩大經(jīng)典環(huán)路，即直接通路和間接通路[10]。

此外，丘腦底核也可直接接受來自興奮性皮質和丘腦的纖維投射（即超直接通路）[11]。直接通路提高大腦皮質的興奮性，而間接通路和超直接通路則具有相反的作用，三條通路相互協(xié)調(diào)、相互制約以保證運動的平衡性[12]。

丘腦底核是基底神經(jīng)核最主要的核團之一，也是唯一的興奮性核團，其神經(jīng)元電活動變化在調(diào)節(jié)皮質神經(jīng)元興奮性方面具有重要作用[12]。ARON等[13]于2007年利用功能性磁共振成像技術發(fā)現(xiàn)，當運動計劃被終止時，丘腦底核顯著激活。因此，丘腦底核也被認為是運動控制系統(tǒng)中起“制動”作用的主要核團之一。由此推測，丘腦底核神經(jīng)元基礎放電頻率的改變，可能通過基底神經(jīng)核內(nèi)的直接通路、間接通路或超直接通路來調(diào)控皮質運動區(qū)神經(jīng)元興奮性，最終參與運動的調(diào)控。

Apelin及其受體系統(tǒng)在大腦、心臟、胃、脂肪組織和血管內(nèi)皮細胞等器官組織中均有表達，具有廣泛而重要的生理功能。KASAI等[5]發(fā)現(xiàn)，apelin缺乏加速肌萎縮側索硬化癥的病理進展。apelin-13能抑制促炎細胞因子的分泌，促進脊髓損傷動物的感覺功能恢復，并增加其運動行為[6]。本研究觀察到，丘腦底核微量注射apelin受體阻斷劑ML221可改變神經(jīng)元的自發(fā)放電頻率，提示丘腦底核內(nèi)源性apelin參與調(diào)控神經(jīng)元興奮性。以往也有研究觀察到內(nèi)源性apelin發(fā)揮重要功能。例如，鞘內(nèi)單次注射apelin受體拮抗劑ML221，可暫時減少慢性壓榨損傷引起的疼痛過敏[9];急性應激可引起下丘腦室旁核內(nèi)apelin受體mRNA的水平升高，而慢性反復應激則可誘導apelin受體表達的持久上調(diào)[14]。

本研究觀察到，丘腦底核內(nèi)源性apelin對神經(jīng)元自發(fā)放電具有雙向效應。丘腦底核給予ML221可以引起大部分神經(jīng)元放電頻率降低，提示內(nèi)源性apelin增加神經(jīng)元的興奮性;而在少部分神經(jīng)元，ML221可增加其放電頻率，提示內(nèi)源性apelin抑制其興奮性。之前也有關于apelin雙向效應的相關報道。DAI等[15]運用膜片鉗技術研究發(fā)現(xiàn)，apelin-13對穹隆下器神經(jīng)元具有除極化和超極化的雙向效應，這些效應似乎分別是由非選擇性陽離子通道和鉀通道的激活而引發(fā)。本研究結果表明，ML221產(chǎn)生抑制和興奮效應的兩組神經(jīng)元的基礎放電頻率存在差異，推測可能與丘腦底核神經(jīng)元的種類不同有關。近期的形態(tài)學研究揭示丘腦底核確實存在有軸突側支和無軸突側支兩種不同類型神經(jīng)元[16]。雖然該文獻同時報道了這兩類不同形態(tài)神經(jīng)元的膜電阻、膜電容、動作電位幅度和興奮閾值等電生理特性無顯著差異，但是并沒有報道這兩類神經(jīng)元的自發(fā)放電頻率是否存在差異。因此，就目前的研究尚不能確定丘腦底核是否存在具有不同自發(fā)放電頻率的神經(jīng)元亞群。但之前有文獻報道，與丘腦底核有緊密形態(tài)和功能聯(lián)系的蒼白球，其兩類神經(jīng)元（小清蛋白陽性神經(jīng)元和PAS結構域蛋白1陽性神經(jīng)元）的自發(fā)放電頻率有差異[17]。本實驗室最近的電生理實驗研究結果顯示，apelin-13對蒼白球神經(jīng)元的自發(fā)放電頻率調(diào)控亦具有興奮和抑制的雙向效應[18]。由上述研究可見，ML221對丘腦底核神經(jīng)元興奮性的雙向效應可能因為不同類型神經(jīng)元介導的信號通路和離子通道機制不同。既往研究表明，在不同的細胞apelin可以激活不同的信號通路而發(fā)揮不同的作用。例如，激活apelin受體/緩激肽1受體異源二聚體促進內(nèi)皮型一氧化氮合酶磷酸化并導致Gαq介導的PKC信號通路活性顯著增加[19]。而在轉染apelin受體的中國倉鼠卵巢細胞中，apelin抑制forskolin誘導的環(huán)磷酸腺苷產(chǎn)生，提示apelin受體與Gαi有功能性聯(lián)系[20]。apelin在表達apelin受體的293T細胞中誘導Akt/PKB的磷酸化，但在沒有表達apelin受體的293T細胞中則沒有該效應[21]。此外，還有研究觀察到apelin對血壓也可以發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)作用。apelin-13與其受體結合，能夠拮抗血管緊張素Ⅱ對血管的收縮作用，從而舒張血管、降低血壓[22]。而在慢性腎病病人中，apelin-13可以直接引起人臍靜脈血管平滑肌細胞肌球蛋白輕鏈的增多，從而升高血壓[23-24]。

綜上所述，內(nèi)源性apelin可雙向調(diào)節(jié)丘腦底核神經(jīng)元自發(fā)放電頻率，以興奮效應為主。本實驗結果為進一步探討丘腦底核內(nèi)apelin及其受體系統(tǒng)可能作為運動相關疾病的潛在靶點提供了一定的理論和實驗依據(jù)。

[參考文獻]

[1]KAWAMATA Y， HABATA Y， FUKUSUMI S， et al. Molecular properties of apelin： tissue distribution and receptor binding[J].? Biochimica et Biophysica Acta， 2001，1538（2/3）：162-171.

[2]LEE D K， CHENG R， NGUYEN T， et al. Characterization of apelin， the ligand for the APJ receptor[J].? Journal of Neurochemistry， 2000，74（1）：34-41.

[3]ODOWD B F， HEIBER M， CHAN A， et al. A human gene that shows identity with the gene encoding the angiotensin receptor is located on chromosome 11[J].? Gene，1993，136（1/2）：355-360.

[4]LUO H Q， HAN L， XU J. Apelin/APJ system： a novel promising target for neurodegenerative diseases[J].? Journal of Cellular Physiology， 2020，235（2）：638-657.

[5]KASAI A， KINJO T， ISHIHARA R， et al. Apelin deficiency accelerates the progression of amyotrophic lateral sclerosis[J].? PLoS One， 2011，6（8）：e23968.

[6]VAFAEI-NEZHAD S， NIKNAZAR S， NOROUZIAN M， et al. Therapeutics effects of [Pyr1] apelin-13 on rat contusion model of spinal cord injury： an experimental study[J].? Journal of Chemical Neuroanatomy， 2021，113：101924.

[7]DELAVILLE C， MCCOY A J， GERBER C M， et al. Subthalamic nucleus activity in the awake hemiparkinsonian rat： relationships with motor and cognitive networks[J].? The Journal of Neuroscience， 2015，35（17）：6918-6930.

[8]DAVID F J， MUNOZ M J， CORCOS D M. The effect of STN DBS on modulating brain oscillations： consequences for motor and cognitive behavior[J].? Experimental Brain Research， 2020，238（7-8）：1659-1676.

[9]XIONG Q M， HE W Y， WANG H B， et al. Effect of the spinal apelin-APJ system on the pathogenesis of chronic constriction injury-induced neuropathic pain in rats[J].? Molecular Medicine Reports， 2017，16（2）：1223-1231.

[10]BOLAM J P， HANLEY J J， BOOTH P A C， et al. Synaptic organisation of the basal Ganglia[J].? Journal of Anatomy， 2000，196（4）：527-542.

[11]FGER J， BEVAN M， CROSSMAN A R. The projections from the parafascicular thalamic nucleus to the subthalamic nucleus and the striatum arise from separate neuronal populations： a comparison with the corticostriatal and corticosubthalamic efferents in a retrograde fluorescent double-labelling study[J].? Neuroscience，1994，60（1）：125-132.

[12]NAMBU A， TOKUNO H， TAKADA M. Functional significance of the cortico-subthalamo-pallidal ‘hyperdirect pathway[J].? Neuroscience Research， 2002，43（2）：111-117.

[13]ARON A R， BEHRENS T E， SMITH S， et al. Triangulating a cognitive control network using diffusion-weighted magnetic resonance imaging （MRI） and functional MRI[J].? The Journal of Neuroscience， 2007，27（14）：3743-3752.

[14]OCARROLL A M， DON A L J， LOLAIT S J. APJ receptor mRNA expression in the rat hypothalamic paraventricular nucleus： regulation by stress and glucocorticoids[J].? Journal of Neuroendocrinology， 2003，15（11）：1095-1101.

[15]DAI L， SMITH P M， KUKSIS M， et al. Apelin acts in the subfornical organ to influence neuronal excitability and cardiovascular function[J].? The Journal of Physiology， 2013，591（13）：3421-3432.

[16]GOUTY-COLOMER L A， MICHEL F J， BAUDE A， et al. Mouse subthalamic nucleus neurons with local axon collaterals[J].? Journal of Comparative Neurology， 2018，526（2）：275-284.

[17]ABECASSIS Z A， BERCEAU B L， WIN P H， et al. Npas1⁺-Nkx2.1⁺neurons are an integral part of the cortico-pallido-cortical loop[J].? The Journal of Neuroscience： the Official Journal of the Society for Neuroscience， 2020，40（4）：743-768.

[18]WANG Y， XUE Y， LIU C， et al. Apelin-13 regulates electrical activity in the globus pallidus and induces postural changes in rats[J].? Neural Regeneration Research， 2021，16（11）：2264-2268.

[19]MEDHURST A D， JENNINGS C A， ROBBINS M J， et al. Pharmacological and immunohistochemical characterization of the APJ receptor and its endogenous ligand apelin[J].? Journal of Neurochemistry， 2003，84（5）：1162-1172.

[20]REAUX A， DE MOTA N， SKULTETYOVA I， et al. Phy-siological role of a novel neuropeptide， apelin， and its receptor in the rat brain[J].? Journal of Neurochemistry， 2001，77（4）：1085-1096.

[21]HASHIMOTO Y， ISHIDA J， YAMAMOTO R， et al. G protein-coupled APJ receptor signaling induces focal adhesion formation and cell motility[J].? International Journal of Molecular Medicine， 2005，16（5）：787-792.

[22]ZHU P L， HUANG F， LIN F， et al. Plasma apelin levels， blood pressure and cardiovascular risk factors in a coastal Chinese population[J].? Annals of Medicine， 2013，45（7）：494-498.

[23]HAN X， ZHANG D L， YIN D X， et al. Apelin-13 deteriorates hypertension in rats after damage of the vascular endothelium by ADMA[J].? Canadian Journal of Physiology and Pharmacology， 2013，91（9）：708-714.

[24]WANG L Y， ZHANG D L， ZHENG J F， et al. Apelin-13 passes through the ADMA-damaged endothelial barrier and acts on vascular smooth muscle cells[J].? Peptides， 2011，32（12）：2436-2443.

（本文編輯馬偉平）