玫瑰石斛組培快繁體系的建立

許丁帆 何遠(yuǎn)秦 劉艷軍 賀峰

摘? ? 要：以玫瑰石斛蒴果為外植體，通過種子無菌萌發(fā)誘導(dǎo)原球莖、原球莖增殖與叢生芽分化、生根壯苗試驗(yàn)，建立玫瑰石斛組培快繁體系，為玫瑰石斛繁育和優(yōu)質(zhì)種苗生產(chǎn)提供了參考依據(jù)。結(jié)果顯示：玫瑰石斛蒴果經(jīng)外植體消毒后，將蒴果內(nèi)種子撒播于1/2MS培養(yǎng)基上，種子可快速萌發(fā)形成原球莖;玫瑰石斛原球莖增殖與分化最佳培養(yǎng)基為1/2MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA，原球莖的增殖系數(shù)達(dá)6.04，叢生芽生長(zhǎng)速度快;玫瑰石斛最適的生根壯苗培養(yǎng)基為1/2MS+0.2 mg·L-1 NAA+50 g·L-1土豆泥，生根率達(dá)100%，平均根數(shù)為5.14條，平均株高達(dá)5.54 cm。

關(guān)鍵詞：玫瑰石斛;組織培養(yǎng);激素;培養(yǎng)基

中圖分類號(hào)：S664.1? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2022.05.001

Establishment of Tissue Culture and Rapid Propagation System in Dendrobium crepidatum

XU Dingfan1， HE Yuanqin1， LIU Yanjun1， HE Feng2

（1. College of Horticulture and Landscape Architecture，Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384，China; 2. WeixianYiju Planting and Gardening Design Co. Ltd， Handan， Hebei 056800， China）

Abstract：Taking the capsules of Dendrobium crepidatum as the explant， the tissue culture and rapid propagation system of Dendrobium crepidatum was established through the experiment of inducing protocorm， protocorm proliferation， cluster bud differentiation， rooting and strengthening seedlings by aseptic germination of seeds， which provided a reference basis for Dendrobium crepidatum breeding and high-quality seedling production. The results showed that after the capsules were disinfected， the seeds in the capsule were sown on 1/2MS medium， then the seeds could germinate rapidly to form protocorms; the optimum medium for the proliferation and differentiation of protocorms was 1/2MS+1.0 mg·L-1 BA+0.5 mg·L-1 NAA， which the proliferation coefficient of protocorms reached 6.04 and the growth rate of cluster buds was fast; The optimum rooting medium was 1/2MS+0.2 mg·L-1 NAA+50 g·L-1 mashed potato， which the rooting rate was 100%， the average number of roots was 5.14， and the average plant height was 5.54 cm. The results of this experiment laid a foundation for the rapid propagation of Dendrobium crepidatum， and provided a reference basis for Dendrobium crepidatum breeding and high-quality seedling production.

Key words： Dendrobium crepidatum; tissue culture; hormone; medium

玫瑰石斛（Dendrobium crepidatum Lindl.et Paxt.），蘭科石斛屬植物，具有滋陰益胃、生津除煩等功效[1]。同時(shí)，玫瑰石斛花色艷麗，具有較高的園藝觀賞價(jià)值，是市場(chǎng)熱門的觀賞石斛之一。但玫瑰石斛野生資源匱乏，種源成為制約玫瑰石斛人工大規(guī)模生產(chǎn)的重要因素。

當(dāng)前，玫瑰石斛主要以分株、扦插等方式繁殖，生產(chǎn)效率低、繁殖速度慢，不能滿足市場(chǎng)的需求;且長(zhǎng)期的營(yíng)養(yǎng)繁殖易導(dǎo)致病毒累積從而使品種退化。以組培快繁技術(shù)對(duì)玫瑰石斛進(jìn)行種苗繁殖，可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量?jī)?yōu)質(zhì)種苗，速度快、繁殖系數(shù)高，同時(shí)還可以解決玫瑰石斛種源問題，在一定程度上保護(hù)玫瑰石斛野生資源。然而，目前關(guān)于玫瑰石斛的研究主要集中生藥學(xué)鑒定[2]、主要功能成分分析[3-4]等方面，關(guān)于玫瑰石斛的組織培養(yǎng)研究報(bào)道較少。白音等[5]最早以玫瑰石斛無菌萌發(fā)的種胚苗莖節(jié)或莖段為材料建立組織培養(yǎng)及快速繁殖體系;蘇江等[6]以玫瑰石斛莖段為外植體誘導(dǎo)原球莖，并對(duì)原球莖進(jìn)行增殖，進(jìn)而獲得玫瑰石斛種苗;許丁帆等[7]以玫瑰石斛葉片為外植體誘導(dǎo)原球莖并增殖，建立了穩(wěn)定高效的玫瑰石斛原球莖生產(chǎn)體系。這些研究大多局限于某一階段，未形成系統(tǒng)、可靠的玫瑰石斛快繁技術(shù)體系。因此，建立一個(gè)完整、系統(tǒng)的組培快繁體系對(duì)玫瑰石斛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

無菌播種是目前常用的石斛種苗繁育方式。在自然條件下，石斛種子極為細(xì)微且無胚乳，只能在適宜環(huán)境下與真菌共生才可萌發(fā)，自然萌發(fā)率不到5%[8]。在使用無菌播種的方式時(shí)，通過人工給予豐富的養(yǎng)分及適宜的條件，使種子的萌發(fā)率能達(dá)到90%以上[9]。在提高種子萌發(fā)率的同時(shí)，無菌播種也能發(fā)揮出蘭科植物種子量極大的優(yōu)勢(shì)，可以顯著提高石斛種苗的繁育速度[10]。使用無菌播種的方式誘導(dǎo)鐵皮石斛原球莖的研究較多，也因種子擁有直接成苗的能力，許多研究進(jìn)一步改進(jìn)了組織培養(yǎng)技術(shù)，形成了三步成苗乃至一步成苗的工藝，極大的簡(jiǎn)化了鐵皮石斛的成苗程序[11-12]。目前尚未見到相關(guān)研究在玫瑰石斛組織培養(yǎng)中使用無菌播種的方法。

本研究以玫瑰石斛種子為外植體，研究無菌播種、原球莖誘導(dǎo)、原球莖增殖、叢生芽分化及生根壯苗等組培技術(shù)流程，以期建立一套高效的玫瑰石斛組培快繁體系，為玫瑰石斛大規(guī)模生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用玫瑰石斛蒴果取自魏縣益聚種植園藝設(shè)計(jì)有限公司玫瑰石斛盆栽苗，盆栽基質(zhì)為水苔。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無菌播種與原球莖誘導(dǎo) 摘取玫瑰石斛蒴果于燒杯中，滴1～2滴吐溫，流水下沖洗30 min，然后在超凈工作臺(tái)中用75%乙醇浸泡45 s， 之后用含2%有效氯的次氯酸鈉溶液滅菌20 min， 最后用無菌水浸泡3次，每次浸泡5 min。滅菌之后用無菌濾紙吸干玫瑰石斛蒴果表面水分，并切開蒴果前端，將種子均勻撒播于1/2MS培養(yǎng)基上，接種后每天觀察記錄種子萌發(fā)情況，并采用尼康SMZ25體視顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.2.2 原球莖增殖與叢生芽分化 將種子萌發(fā)后獲得的原球莖轉(zhuǎn)接到原球莖增殖與叢生芽分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基以1/2MS+1.0 mg·L-16-BA為基礎(chǔ)，附加不同濃度的NAA（0.1，0.2，0.5，1.0 mg·L-1）。每種培養(yǎng)基接種5瓶，每瓶接種約100個(gè)原球莖，試驗(yàn)重復(fù)3次。培養(yǎng)45 d后觀察記錄原球莖生長(zhǎng)情況并統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)。

1.2.3 玫瑰石斛的生根壯苗培養(yǎng) 選擇長(zhǎng)勢(shì)一致且生長(zhǎng)健壯的0.5～1.0 cm的叢生苗接種到生根壯苗培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基采用1/2MS為基本培養(yǎng)基，其中附加一定濃度的NAA（0.2 mg·L-1）、土豆泥（20，50，100 mg·L-1）。每個(gè)培養(yǎng)基配方接種10瓶，每瓶接種玫瑰石斛叢生苗5個(gè)，試驗(yàn)重復(fù)3次。培養(yǎng)開始后，每天觀察植株生長(zhǎng)情況，培養(yǎng)50 d后統(tǒng)計(jì)每個(gè)處理玫瑰石斛的生根率、平均根數(shù)和平均株高。

1.2.4 培養(yǎng)條件 以上培養(yǎng)基均添加6.5 g·L-1瓊脂，20 g·L-1蔗糖，滅菌前調(diào)節(jié)pH為5.8～6.0，121 ℃、0.1 MPa下滅菌20 min。培養(yǎng)條件為25±2 ℃，24 h光照，光照強(qiáng)度1 000～1 500 lx。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

增殖系數(shù)=增殖后的有效原球莖總數(shù)/起始接種總數(shù)[13];

生根率%=產(chǎn)生根的幼苗數(shù)/接種芽數(shù)×100%;

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2013和SPSS Statistic 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子萌發(fā)及原球莖的誘導(dǎo)

玫瑰石斛播種后逐漸吸水膨脹，5～7 d后種子膨大明顯并呈淡綠色，30 d后逐漸形成綠色原球莖。

2.2 玫瑰石斛原球莖增殖與叢生芽誘導(dǎo)

由表1可知，在1/2MS+1.0 mg·L-1 BA的基礎(chǔ)上附加一定量的NAA有利于原球莖的增殖，原球莖的增殖系數(shù)顯著高于未附加NAA的培養(yǎng)基上的原球莖增殖系數(shù)。在NAA濃度在0至0.5 mg·L-1范圍內(nèi)時(shí)，原球莖的增殖系數(shù)隨添加的NAA濃度上升而增加。當(dāng)在1/2MS+1.0 mg·L-1 6-BA的基礎(chǔ)上附加0.5 mg·L-1 NAA時(shí)，原球莖增殖系數(shù)最高，達(dá)6.04，且此時(shí)原球莖多數(shù)萌發(fā)成叢生芽，且叢生芽生長(zhǎng)速度快，長(zhǎng)勢(shì)均勻、整齊。當(dāng)增加NAA用量至1.0 mg·L-1時(shí)，原球莖的增殖系數(shù)未顯著提高，但此時(shí)分化的叢生芽出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。因此，玫瑰石斛原球莖增殖與分化最佳培養(yǎng)基為：1/2MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA。

2.3 玫瑰石斛生根壯苗培養(yǎng)

從表2可以看出，玫瑰石斛在1/2MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，植株矮小，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)葉片逐漸黃化;當(dāng)在1/2MS培養(yǎng)基中添加0.2 mg·L-1 NAA時(shí)，玫瑰石斛生長(zhǎng)速度略有加快，生根率、平均根數(shù)和平均株高均有顯著提高，但后期仍然停止生長(zhǎng)，葉片出現(xiàn)黃化現(xiàn)象。在1/2MS+0.2 mg·L-1NAA培養(yǎng)基中添加一定濃度的土豆泥，玫瑰石斛生根與生長(zhǎng)勢(shì)顯著提高，說明添加適量土豆泥較有利于玫瑰石斛生根壯苗;當(dāng)在培養(yǎng)基中添加50 g·L-1土豆泥時(shí)，玫瑰石斛生根壯苗情況最佳，生根率、平均根數(shù)和平均株高顯著高于其他處理，此時(shí)玫瑰石斛植株粗壯、葉翠綠舒展。因此，玫瑰石斛最適的生根壯苗培養(yǎng)基為1/2MS+0.2 mg·L-1 NAA+50 g·L-1土豆泥。

3 結(jié)論與討論

外植體消毒是建立玫瑰石斛無菌體系的關(guān)鍵步驟。在玫瑰石斛組培快繁研究中，前人均以HgCl2為消毒劑進(jìn)行外植體消毒[5-6]。但目前HgCl2使用受到嚴(yán)格管控，較難獲取。因此，本研究以易獲取的2%有效氯的次氯酸鈉溶液為消毒劑。蒴果的果皮對(duì)石斛種子具有保護(hù)作用，在外植體消毒過程中可以避免因消毒程度過深而損傷種子，故在石斛無菌播種中，控制污染率的關(guān)鍵在于對(duì)蒴果表皮的消毒上。本研究適當(dāng)?shù)难娱L(zhǎng)了外植體消毒的時(shí)間，對(duì)蒴果進(jìn)行了20 min的消毒，以此來降低污染率。試驗(yàn)結(jié)果顯示種子播種后未見污染現(xiàn)象，可見使用次氯酸鈉溶液對(duì)蒴果進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間消毒的方法可以有效降低污染風(fēng)險(xiǎn)。

在原球莖增殖試驗(yàn)中，本研究討論了NAA濃度對(duì)原球莖增殖率的影響，結(jié)果顯示NAA對(duì)原球莖的增殖具有顯著影響，且適宜的NAA濃度為0.5 mg·L-1。而在蘇江等[6]的試驗(yàn)結(jié)果顯示NAA對(duì)原球莖增殖的影響不顯著，與本試驗(yàn)的結(jié)果存在差異。初步推斷，產(chǎn)生差異的原因可能在于原球莖的來源不同，本研究中的原球莖直接由種子誘導(dǎo)而來，蘇江等使用的原球莖由莖段誘導(dǎo)而來，因此對(duì)NAA可能存在敏感性上的差異。具體原因有待進(jìn)一步的試驗(yàn)來討論。

本研究在玫瑰石斛的壯苗培養(yǎng)中對(duì)土豆泥進(jìn)行了討論，分別設(shè)置了20，50，100 g·L-1 3種用量梯度，結(jié)果顯示添加50 g·L-1土豆泥的培養(yǎng)基壯苗效果最佳。土豆泥是在石斛組培中一種常見的有機(jī)添加物，對(duì)種子的萌發(fā)、原球莖的增殖生長(zhǎng)以及芽的生長(zhǎng)等方面都具有促進(jìn)作用。目前對(duì)于土豆泥對(duì)石斛生長(zhǎng)促進(jìn)作用的機(jī)理尚不明確，有待進(jìn)一步的研究討論。謝寅峰等[14]認(rèn)為土豆泥等天然有機(jī)添加物中的糖類、有機(jī)成分、各種維生素及礦物質(zhì)等微量元素能給組培苗提供生長(zhǎng)發(fā)育所需要的各種養(yǎng)分，同時(shí)提高了組培苗在組培室的弱光環(huán)境下的碳代謝的能力，進(jìn)而促進(jìn)組培苗壯苗。土豆泥天然有機(jī)添加劑存在成分大多不明、含量不穩(wěn)定等問題，無法確定各種成分中促進(jìn)組培苗生長(zhǎng)的具體有效成分，在進(jìn)行具體的有機(jī)添加劑試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)先做預(yù)備試驗(yàn)加以驗(yàn)證再進(jìn)行具體試驗(yàn)[15]。同時(shí)有研究顯示相較于對(duì)照組，添加了土豆泥的培養(yǎng)基褐化現(xiàn)象更加嚴(yán)重，這可能是由于有機(jī)添加物的復(fù)雜成分里有易引起褐化的物質(zhì)，在培養(yǎng)的過程中需要及時(shí)的繼代出現(xiàn)褐化的組培苗[16]。因土豆泥具有成本較低的優(yōu)勢(shì)，在春石斛、鐵皮石斛等工廠化育苗中土豆泥得到了廣泛運(yùn)用[17-18]。白音等[5]的研究表明土豆泥提取物對(duì)玫瑰石斛種子的萌發(fā)具有促進(jìn)作用。蘇江等[6]研究了不同有機(jī)添加劑對(duì)玫瑰石斛原球莖增殖的影響，結(jié)果表明椰子汁和土豆提取物的效果較好，其中椰子汁的效果更佳，但是此試驗(yàn)僅對(duì)有機(jī)添加劑的種類進(jìn)行了討論，沒有對(duì)添加量進(jìn)行研究，具體的效果有待于進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

本研究對(duì)玫瑰石斛完整組培快繁體系進(jìn)行了探索。以玫瑰石斛種子為外植體，使用無菌播種的方式，經(jīng)過種子萌發(fā)誘導(dǎo)原球莖、原球莖增殖及叢生芽分化，并進(jìn)行生根壯苗培養(yǎng)，建立了玫瑰石斛組培快繁體系，為玫瑰石斛繁育和優(yōu)質(zhì)種苗生產(chǎn)提供了參考依據(jù)。研究結(jié)果顯示：使用無菌播種的方式，將種子撒播于1/2MS培養(yǎng)基上，種子可快速萌發(fā)形成原球莖;NAA對(duì)玫瑰石斛原球莖的增殖具有顯著影響，原球莖增殖與分化最佳培養(yǎng)基為1/2MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA;土豆泥對(duì)玫瑰石斛生根壯苗具有顯著影響，添加適量的土豆泥可以顯著的促進(jìn)生根壯苗，最適的生根壯苗培養(yǎng)基為1/2MS+0.2 mg·L-1 NAA+50 g·L-1土豆泥。

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