策勒黑羊ERα基因克隆、生物信息學(xué)分析及卵巢組織表達(dá)研究

張繼虎，米熱妮薩，王子渲，李 琳，邢 鳳，劉書(shū)東

(1.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，阿拉爾 843300；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，阿拉爾 843300；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，青島 266109)

雌激素是動(dòng)物體內(nèi)最重要的激素之一，對(duì)完善動(dòng)物生殖系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能是不可或缺的。雌激素通常指內(nèi)源性雌激素化合物17β-雌二醇(E2)、雌酮和雌三醇，其中E2活性最強(qiáng)[1]，其廣泛的生物作用是通過(guò)與其受體結(jié)合實(shí)現(xiàn)的，這幾種物質(zhì)都可與由雌激素受體1(estrogen receptor 1，ESR1)基因編碼的雌激素受體α(estrogen receptor α,ERα)結(jié)合[2-4]。ERα是核受體家族的成員[5-6]，對(duì)促進(jìn)動(dòng)物卵泡發(fā)育和提高繁殖力具有重要作用[7-9]。促性腺激素釋放激素(gonadotropin releasing hormone，GnRH)通過(guò)脈沖式的方式從下丘腦分泌到垂體前葉，并與垂體促性腺激素細(xì)胞上的受體結(jié)合，從而促進(jìn)促卵泡素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)和促黃體生成素(luteinizing hormone，LH)的合成與分泌[10]。FSH和LH通過(guò)血液循環(huán)到達(dá)卵巢促進(jìn)卵巢發(fā)育，并促使卵巢合成雌激素[11]。雌激素與卵巢ERα特異性結(jié)合后，能夠刺激卵巢顆粒細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)顆粒細(xì)胞促性腺激素受體的水平和顆粒細(xì)胞對(duì)促性腺激素的應(yīng)答[12]。研究表明，ERα基因發(fā)生突變后可導(dǎo)致卵巢早衰喪失生育功能[13]；小鼠ERα基因缺失后可導(dǎo)致LH分泌和發(fā)情周期紊亂[14]。策勒黑羊是新疆地區(qū)典型的代表品種，具有性成熟早、常年發(fā)情等特點(diǎn)，目前，國(guó)內(nèi)外少有對(duì)策勒黑羊ERα基因原核表達(dá)及卵巢不同時(shí)期表達(dá)等研究報(bào)道。鑒于此，本研究對(duì)策勒黑羊ERα基因進(jìn)行克隆及生物信息學(xué)分析，并對(duì)卵泡期、黃體期和妊娠30 d時(shí)卵巢中ERα基因表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，以期為研究ERα基因的功能及其對(duì)綿羊發(fā)情、妊娠等過(guò)程的影響提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

于新疆阿克蘇市某屠宰場(chǎng)，選取處于卵泡期、黃體期和妊娠30 d的策勒黑羊各3只，取適量上述時(shí)期策勒黑羊的卵巢，用無(wú)菌手術(shù)剪剪碎后放入凍存管中，迅速置于液氮中保存，后轉(zhuǎn)入-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

DL2000 DNA Marker、膠回收試劑盒均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；pMD19-T克隆載體購(gòu)自TaKaRa公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；藍(lán)白斑試劑購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 RNA提取及cDNA合成

取出卵巢組織，利用Transzol法提取RNA，提取后的RNA利用核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)濃度。檢測(cè)合格后，統(tǒng)一濃度進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)體系：5×gDNA Eraser 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，RNA 2 μL，RNase-free ddH2O 5 μL,反應(yīng)條件為42 ℃ 2 min；RNase-free ddH2O 4 μL，Prime Script RT Enzyme Mix 1 μL，RT Prime Mix 1 μL，5×Prime Script Buffer 4 μL，反應(yīng)條件為42 ℃ 2 min，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。

1.4 引物設(shè)計(jì)及合成

從GenBank中查詢綿羊ERα基因序列(登錄號(hào)：XM_042253635.1)，用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)ERα基因克隆和實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，引物信息見(jiàn)表1。其中，引物ERα-1擴(kuò)增編碼區(qū)的1-805 bp，ERα-2擴(kuò)增777-1 401 bp，ERα-3擴(kuò)增1 284-1 791 bp。以β-actin(登錄號(hào)：NM_001009784.3)為內(nèi)參基因。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5 PCR擴(kuò)增及克隆

PCR反應(yīng)體系25 μL：2×EasyTaqPCR SuperMix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。其中，ERα-1為60 ℃(每個(gè)循環(huán)降0.5 ℃)，ERα-2和ERα-3退火溫度為58 ℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，膠回收純化目的片段并與pMD19-T克隆載體連接，16 ℃反應(yīng)30 min；取5 μL連接產(chǎn)物與100 μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞混合，冰浴30 min后，42 ℃條件下熱激90 s，快速轉(zhuǎn)入離心管中冰浴；加入400 μL不含氨芐青霉素的培養(yǎng)基，于37 ℃、225 r/min搖床復(fù)蘇90 min。待溶液變渾濁后，4 000 r/min離心5 min，棄掉適量上清液，將剩余菌液均勻地鋪在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上，放置30 min；將培養(yǎng)皿倒置，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱過(guò)夜。合格菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 相似性比對(duì)、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建及生物信息學(xué)分析

通過(guò)DNAMAN對(duì)策勒黑羊ERα基因與山羊(登錄號(hào)：XP_042109569.1)、牛(登錄號(hào)：NP_001001443.1)、豬(登錄號(hào)：XP_020938716.1)、人(登錄號(hào)：NP_000116.2)、犬(登錄號(hào)：XP_038509304.1)和小鼠(登錄號(hào)：NP_001289460.1)進(jìn)行氨基酸序列相似性比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。利用表2中的在線軟件對(duì)策勒黑羊ERα氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增

以策勒黑羊cDNA為模板，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)卵泡期、黃體期和妊娠30 d時(shí)策勒黑羊卵巢中ERα基因表達(dá)量。PCR反應(yīng)體系15 μL：2×Transtant qPCR Mix 7.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL,ddH2O 5.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，68 ℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

采用2-ΔΔCt法計(jì)算策勒黑羊卵泡期、黃體期和妊娠30 d時(shí)卵巢中ERα基因的相對(duì)表達(dá)量。使用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 策勒黑羊ERα基因克隆

策勒黑羊ERα基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后顯示片段長(zhǎng)度分別為811、624和791 bp(圖1)，與預(yù)期片段大小相符。將得到的序列通過(guò)BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，與綿羊ERα基因序列相似性為99.78%。在第242、681、862和1 238 bp處發(fā)生替換，分別是G→A、G→A(同義突變)、G→C和G→T，相應(yīng)第81、288和413位氨基酸變化為G→D、R→T、R→S。

綿羊ERα氨基酸序列劃分為6個(gè)功能區(qū)(圖2)，分別是A/B(1-182)、C(183-258)、D(259-328)、E(329-525)和F(526-596)區(qū)域，在A/B和E域含分別含有AF-1(activation function 1)和AF-2(activation function 2)區(qū)域。策勒黑羊ERα氨基酸突變分別在發(fā)生A/B、D和E區(qū)域。

2.2 相似性比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

由圖3可知，策勒黑羊ERα氨基酸序列與山羊、牛、豬、人、犬和小鼠的相似性較高，分別為99.0%、97.8%、92.4%、92.1%、91.2%和89.1%。由圖4可知，策勒黑羊與山羊、牛的親緣關(guān)系較近，與豬、人和犬的親緣關(guān)系次之，與小鼠的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

M，DL2000 DNA Marker；1，ERα-1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2～4，ERα-2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；5～7，ERα-3基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M，DL2000 DNA Marker；1，PCR amplification product of ERα-1 gene；2-4，PCR amplification products of ERα-3 gene；5-7，PCR amplification products of ERα-3 gene圖1 策勒黑羊ERα基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)Fig.1 Detection of PCR amplification products of ERα gene in Cele Black sheep

圖2 ERα氨基酸序列功能劃分Fig.2 Function division of ERα amino acid sequences

圖3 ERα氨基酸相似性比對(duì)Fig.3 Amino acid similarity alignment of ERα protein

圖4 不同物種ERα系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建Fig.4 Phylogenetic tree construction of ERαin different species

2.3 生物信息學(xué)分析

2.3.1 理化性質(zhì)及親/疏水性 利用ExPASy軟件預(yù)測(cè)策勒黑羊ERα蛋白的理化性質(zhì)及親/疏水性，結(jié)果顯示，策勒黑羊ERα蛋白分子式為C2930H4600N822O862S41，理論等電點(diǎn)(pI)為7.32，存在60個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸殘基(天冬氨酸+谷氨酸)和60個(gè)帶正電荷的氨基酸殘基(精氨酸+賴氨酸)，不穩(wěn)定指數(shù)為50.33，屬于不穩(wěn)定蛋白；ERα氨基酸序列第271位谷氨酰胺(Gln)親水性指數(shù)最小，為-3.433，位于389位的蛋氨酸(Met)親水性指數(shù)最大，為2.511，親水性總平均值為-0.355，表明該多肽屬于親水蛋白(圖5)。

2.3.2 糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn) 使用NetOGlyc 4.0預(yù)測(cè)策勒黑羊ERα蛋白的O-糖基化位點(diǎn)，結(jié)果顯示存在28個(gè)O-糖基化位點(diǎn)；利用NetNGlyc 1.0預(yù)測(cè)N-糖基化位點(diǎn)，結(jié)果顯示不存在N-糖基化位點(diǎn)；利用NetPhos 3.1預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn)，結(jié)果顯示存在54個(gè)磷酸化位點(diǎn)(圖6)。

2.3.3 亞細(xì)胞定位 利用PSORTⅡ預(yù)測(cè)ERα蛋白在細(xì)胞中的定位發(fā)現(xiàn)，ERα主要定位于細(xì)胞核中，占比為73.9%；線粒體中占8.7%，細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、囊泡和質(zhì)膜中各占4.3%。

2.3.4 二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu) 通過(guò)SOPMA軟件預(yù)測(cè)策勒黑羊ERα蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，主要由α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲組成，分別為39.43%和43.79%，其余結(jié)構(gòu)為延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角，分別為11.41%和5.37%(圖7)。利用SWISS-MODEL在線軟件預(yù)測(cè)策勒黑羊ERα蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，仍以α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主(圖8)。

2.4 策勒黑羊卵泡期、黃體期及妊娠30 d時(shí)卵巢中ERα基因表達(dá)水平

以β-actin為內(nèi)參基因，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)ERα基因在策勒黑羊卵泡期、黃體期和妊娠30 d卵巢中的表達(dá)情況，結(jié)果見(jiàn)圖9。由圖9可知，與卵泡期相比，ERα基因在黃體期表達(dá)量極顯著下降(P<0.01)，妊娠30 d時(shí)卵巢中的表達(dá)量極顯著上升(P<0.01)。

圖5 策勒黑羊ERα蛋白質(zhì)親/疏水性預(yù)測(cè)Fig.5 Hydrophilicity and hydrophobicity prediction of ERα protein in Cele Black sheep

圖6 策勒黑羊ERα蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.6 Phosphorylation sites prediction of ERα protein in Cele Black sheep

線條從長(zhǎng)到短依次為α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角及無(wú)規(guī)則卷曲The order of lines from long to short are alpha helix,extended chain,beta turn and random coil圖7 策勒黑羊ERα蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.7 Secondary structure prediction of ERα protein in Cele Black sheep

圖8 策勒黑羊ERα蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.8 Tertiary structure prediction of ERα protein in Cele Black sheep

肩標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)Values with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01)；While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05)圖9 策勒黑羊卵泡期、黃體期及妊娠30 d卵巢中ERα基因表達(dá)量Fig.9 Expression of ERα gene in ovary of Cele Black sheep at follicular phase,luteal phase and 30 days of pregnancy

3 討 論

本研究克隆獲得策勒黑羊ERα基因CDS序列，全長(zhǎng)1 791 bp，編碼596個(gè)氨基酸。策勒黑羊ERα氨基酸序列與山羊、牛的相似性較高，分別為99.0%和97.8%，與小鼠的相似性為89.1%，表明該基因在進(jìn)化上有較高的保守性。ERα定位在細(xì)胞內(nèi)，且細(xì)胞核中占比最多，屬于核受體家族成員，為親水蛋白，不存在跨膜結(jié)構(gòu)，這與其屬于核受體家族成員相符合。ERα蛋白具有54個(gè)磷酸化位點(diǎn)，可能成為蛋白激酶和磷酸酶的修飾位點(diǎn)，在細(xì)胞調(diào)節(jié)通路過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

目前已證明ERα可分為6個(gè)功能區(qū)：A/B、C、D、E、F區(qū)域[15]。A/B域包含1個(gè)非配體依賴型轉(zhuǎn)錄激活功能區(qū)AF-1區(qū)，能與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子相互作用激活靶基因[16]；C域包含有2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，并富含高度保守的堿性氨基酸殘基，主要參與DNA的結(jié)合[17]；D區(qū)域?yàn)榻g鏈區(qū)，在無(wú)雌激素的條件下，該區(qū)可結(jié)合1個(gè)熱應(yīng)激蛋白并進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼郫B以保護(hù)疏水的配體結(jié)合區(qū)，從而維持受體的非活性狀態(tài)[18]，這一不保守的無(wú)規(guī)則區(qū)域在A/B和C域具有分子變構(gòu)的作用，能夠?qū)ι锃h(huán)境的變化做出反應(yīng)；E區(qū)域含有1個(gè)在激素依賴的轉(zhuǎn)錄過(guò)程中有重要作用的AF-2區(qū)，在轉(zhuǎn)錄激活中起調(diào)節(jié)作用[19]；F區(qū)域?yàn)樘级私Y(jié)合域。雌激素受體是所有性類固醇激素受體中唯一存在該區(qū)域的受體，目前對(duì)這一區(qū)域功能了解甚少。

本研究結(jié)果表明，ERα基因在策勒黑羊不同時(shí)期卵巢組織中均有表達(dá)，表明其在生殖系統(tǒng)中發(fā)揮作用。雌激素主要來(lái)源于卵泡內(nèi)膜細(xì)胞和卵巢顆粒細(xì)胞，與ERα結(jié)合后可以與神經(jīng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)動(dòng)物的排卵周期。雌激素在卵巢卵泡發(fā)育的過(guò)程中逐漸積累，卵泡期時(shí)呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，在排卵之前達(dá)到最高峰，排卵后急劇降低。Juengel等[20]在綿羊卵巢顆粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)ERα基因有表達(dá)，且三級(jí)卵泡和成熟卵泡中表達(dá)量偏高。如果排出的卵子未受精，黃體維持一段時(shí)間后在前列腺素(PGF2α)作用下退化。處于卵泡期的策勒黑羊卵巢受到外周血液中高水平雌激素的影響，ERα基因表達(dá)量極顯著高于黃體期。包瑩瑩等[21]在甘加藏羊(綿羊)卵巢中發(fā)現(xiàn)，發(fā)情期和發(fā)情前期ERα基因相對(duì)表達(dá)量高于發(fā)情后期和間情期，且間情期其蛋白表達(dá)量相對(duì)較低。如果排出的卵子已受精，PGF2α則會(huì)受到抑制，維持黃體功能并成為妊娠黃體。妊娠后卵泡不再發(fā)育，雌激素的分泌量減少，但黃體和胎盤可以分泌雌激素，所以仍可以檢測(cè)到雌激素。在綿羊妊娠14～33 d時(shí)，黃體細(xì)胞經(jīng)過(guò)未成熟和成熟2個(gè)階段。18～28 d時(shí)成熟黃體期細(xì)胞數(shù)量增多、體積變大，未成熟黃體細(xì)胞較少，這2種細(xì)胞占據(jù)全部黃體細(xì)胞的83%[22]，在妊娠90 d左右時(shí)，雌激素含量達(dá)到最高。策勒黑羊妊娠30 d時(shí)卵巢中ERα基因高表達(dá)，暗示其在妊娠過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。Berisha等[23]觀察到牛妊娠90 d時(shí)卵巢中ERα基因表達(dá)量較少，推測(cè)可能是不同物種不同妊娠時(shí)間存在差異。ERα基因在策勒黑羊卵巢卵泡期、黃體期和妊娠30 d時(shí)均有表達(dá)且有顯著變化，表明ERα基因在卵泡生長(zhǎng)、黃體形成和妊娠的調(diào)節(jié)中起著重要作用，但其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究克隆獲得策勒黑羊ERα基因序列，全長(zhǎng)1 791 bp，編碼596個(gè)氨基酸，與山羊和牛的相似性較高。ERα為親水蛋白，定位在細(xì)胞內(nèi)，不存在跨膜結(jié)構(gòu)，二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲為主。ERα基因在策勒黑羊卵泡期、黃體期和妊娠30 d的卵巢中均有表達(dá)，卵泡期和妊娠30 d時(shí)高表達(dá)，黃體期時(shí)表達(dá)量最低，表明ERα基因在策勒黑羊生殖過(guò)程中發(fā)揮重要作用。