不同產(chǎn)區(qū)來源柴胡的農(nóng)藝性狀及品質(zhì)比較

韓文靜，萬河妨，劉海軍，劉新冉，隋 春，魏建和

（1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所/中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點實驗室/瀕危藥材繁育國家工程實驗室，北京 100193；2中國醫(yī)藥健康產(chǎn)業(yè)股份有限公司，北京 100061）

0 引言

柴胡是國內(nèi)傳統(tǒng)大宗藥材，用藥歷史悠久，具有疏散退熱、疏肝解郁、升舉陽氣之效[1]。現(xiàn)代藥理研究表明柴胡具有良好的抗炎、抗病毒、抗過敏等作用[2-3]，在抗擊新冠肺炎(COVID-19)方面也有研究和應(yīng)用。柴胡皂苷對COVID-19的免疫應(yīng)答可能有一定的積極的改善作用[4-7]，在抗抑郁復(fù)方中柴胡的使用頻率居前列[8]，多項研究表明柴胡復(fù)方制劑具有良好的抗抑郁作用[9-11]。柴胡皂苷d與西藥聯(lián)合用藥可產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，增強抗腫瘤效果[12-14]。種質(zhì)的優(yōu)劣對于藥材品質(zhì)與產(chǎn)量具有重要影響[15-16]。國內(nèi)柴胡野生資源較少，主要依賴于栽培[17]，柴胡耐寒耐旱的特性，使其分布地區(qū)較廣，現(xiàn)主產(chǎn)于河北、山西、陜西、甘肅等地[18-19]，栽培地眾多使得柴胡栽培種質(zhì)多而雜亂[20-21]，不同栽培地區(qū)的柴胡性狀差異較大[22-23]。選擇高產(chǎn)高質(zhì)的柴胡品種加以推廣種植，對于保證柴胡藥材的穩(wěn)定與產(chǎn)量等具有重要意義。已選育鑒定的中柴系列品種對規(guī)范柴胡藥源和柴胡高產(chǎn)栽培產(chǎn)生了一定促進(jìn)作用[24]，但目前各柴胡產(chǎn)區(qū)的栽培類型仍較多，加之上述鑒定品種距今已有10余年，需要進(jìn)一步選育提升。提高柴胡品種特性，并在生產(chǎn)中推廣種植，不僅有助于從提高產(chǎn)量角度提高柴胡生產(chǎn)效益，還有助于規(guī)范柴胡種植和質(zhì)量提升。本試驗對不同產(chǎn)區(qū)來源的柴胡進(jìn)行比較，旨在為進(jìn)一步開展品種選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甘肅、陜西、山西、黑龍江與河北是柴胡主產(chǎn)區(qū)，本研究種質(zhì)來源于上述產(chǎn)區(qū)多年大面積種植柴胡的農(nóng)戶，為現(xiàn)場收集種子；另外，包括了課題組選育的種植于北京地區(qū)試驗地的柴胡品種，共32份。具體種質(zhì)信息見表1。

表1 32份種質(zhì)的來源

1.2 儀器與試劑

XSE105電子天平（德國METTLER公司生產(chǎn)），Waters 2487檢測器高效液相色譜儀（沃特世科技有限公司），KQ-500DE型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)），數(shù)顯電子恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）。

續(xù)表1

甲醇、乙腈均購自于賽默飛世爾科技（中國）有限公司，純度＞99.9%。柴胡皂苷a、d購自于成都曼思特生物科技有限公司，純度≥98%。濃氨水由北京化工廠生產(chǎn)，分析純。

1.3 試驗地點

試驗在北京市海淀區(qū)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所試驗地（東經(jīng)116°16′，北緯40°02′）進(jìn)行。

1.4 試驗設(shè)計

試驗采用隨機區(qū)組方式排列，2019年5月2日將32份種質(zhì)統(tǒng)一播種于試驗地，每個小區(qū)2 m2，播種方式為撒播，于田間進(jìn)行統(tǒng)一管理。2019年11月15日進(jìn)行采收。

1.5 柴胡根部性狀測定

將收獲的柴胡去凈泥沙，每份種質(zhì)隨機選取20株，去凈泥沙后測量根鮮重、根長、根粗等指標(biāo)。將收獲的柴胡放置陰干房晾干至恒重，稱量干重。

1.6 柴胡皂苷含量測定

采用高效液相色譜法(HPLC)測定柴胡皂苷a、d的含量。

1.6.1 色譜條件 ASB-vensil C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)，流動相A為乙腈，流動相B為純凈水，流速1.0 mL/min，上樣量20 μL，柱溫(25±0.5)℃。按照表2進(jìn)行梯度洗脫。

表2 柴胡HPLC梯度洗脫程序 %

1.6.2 對照品溶液的制備 精密稱取柴胡皂苷a、d標(biāo)準(zhǔn)品各2.5 mg，分別置于5 mL容量瓶中，加入色譜甲醇定容至刻度。

1.6.3 供試品溶液的制備 將柴胡樣品粉碎研磨后過4號篩，精密稱定0.5g，置于具塞錐形瓶中，加入含5%的氨水甲醇溶液25 mL，密封后超聲提取3次，每次35 min，水溫不宜超過30℃。搖勻，過濾至蒸發(fā)皿后于70℃水浴鍋蒸干。加1 mL純凈水與4 mL甲醇溶解，加甲醇定容于5 mL容量瓶中。搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用0.22μL有機濾膜過濾至進(jìn)樣瓶。

1.6.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 精密稱定柴胡皂苷a 3.99 mg、柴胡皂苷d 3.96 mg混合于5 mL容量瓶中并用甲醇滴加至刻度溶解。將溶液進(jìn)行梯度稀釋后按上述色譜條件進(jìn)樣，以濃度X為橫坐標(biāo)、峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程。

1.7 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Microsoft Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計，并進(jìn)行方差與差異顯著性分析。利用Microsoft Excel 2019和Origin 2019對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 根部性狀數(shù)據(jù)與分析

研究測定不同種質(zhì)柴胡的農(nóng)藝性狀（表3），并進(jìn)行頻數(shù)分布分析（圖1），以呈現(xiàn)柴胡的整體性狀。柴胡根長多集中在14.00～15.00 cm，有6個種質(zhì)根長超過15.00 cm。柴胡根粗分布較為平均，多在3.500～5.500 mm，占總數(shù)的84%，僅5種高于5.500 mm。BC-SX-WR平均根粗最高，為6.718 mm。柴胡側(cè)根多集中在4～7個之間，占總數(shù)的66%，僅5份種質(zhì)側(cè)根數(shù)為3～4個。柴胡平均單根干重分布差異較大，1.50～2.00 g分布最多，2.50～3.00 g次之，有6個種質(zhì)超過3.00 g。

圖1 不同柴胡種質(zhì)根部性狀主要指標(biāo)的頻次分析

表3 不同種質(zhì)農(nóng)藝性狀構(gòu)成

2.2 不同種質(zhì)柴胡皂苷含量分析

柴胡皂苷a、d在線性范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系（表4）。供試品及柴胡皂苷a與柴胡皂苷標(biāo)準(zhǔn)品均能夠得到良好的分離（圖2）。32份柴胡種質(zhì)皂苷含量均達(dá)到2020版《中國藥典》規(guī)定，即柴胡皂苷a、d總含量不低于0.3%，不同種質(zhì)之間存在較大差異（表5），多集中在北柴胡間，BC-SX-CZI-1（來源于山西）柴胡皂苷含量最高，可達(dá)0.973%，其次為山西與甘肅地區(qū)的BC-SX-CZ-3、BC-GS-GN、BC-SX-WUX、BC-SXPS-2和BC-SX-YC-1，含量均在0.7%以上。BC-SXWR（來源于山西）含量最低，為0.316%。三島柴胡與狹葉柴胡不同種質(zhì)間皂苷含量差異不明顯，皂苷含量在0.4%左右。

圖2 對照品(A)與供試品(B)HPLC圖

表4 柴胡皂苷a、d的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

表5 柴胡皂苷含量

2.3 不同種質(zhì)柴胡與產(chǎn)地分析

將測得的數(shù)據(jù)按根粗、單根重和含量進(jìn)行三維聚類分析（圖3），山西地區(qū)種質(zhì)差異較大，部分種質(zhì)與甘肅地區(qū)柴胡聚為一類，部分種質(zhì)與河北、北京聚為一類。還存在個別種質(zhì)沒有聚類，這些種質(zhì)具有特異性，BC-GS-LX-1（來源于甘肅）的皂苷含量及BC-SX-PS-1、BC-SX-HY（來源于山西）的根重遠(yuǎn)高于其他種質(zhì)。

圖3 基于根粗、根重和含量的不同地區(qū)來源柴胡的聚類分析

3 結(jié)論與討論

不同產(chǎn)地的種質(zhì)，從產(chǎn)量、含量與根型3個方面綜合比較差異顯著，綜合性狀好的可以作為目前主栽種質(zhì)，通過擴(kuò)繁種子應(yīng)用于生產(chǎn)。個別性狀突出的作為育種材料。比如BC-SX-HY（來源于山西）種質(zhì)在根型單根重以及含量均表現(xiàn)優(yōu)異，建議作為優(yōu)良種質(zhì)擴(kuò)繁。而BC-SX-PS-1及BC-SX-PS-2（均來源于山西）含量及單根重等表現(xiàn)突出，但側(cè)根數(shù)較多。BC-SX-WR（來源于山西）、BC-SX-YC-2（來源于山西）和BS-HBAG（來源于河北）根型及單根重均比較靠前，但柴胡皂苷含量偏低。BC-SX-CZI-1（來源于山西）種質(zhì)柴胡皂苷含量最高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出藥典規(guī)定含量，但其根型與根重較差。將上述品種不斷進(jìn)行育種優(yōu)化有望選育出更優(yōu)質(zhì)品種。

山西是柴胡主產(chǎn)區(qū)，大約70%流通的柴胡藥材源于山西地區(qū)，所以本試驗取自山西產(chǎn)區(qū)的種質(zhì)較多，比較來看，有5個種質(zhì)和其他差別較大。另外，有的種質(zhì)具有很高的產(chǎn)量優(yōu)勢，但含量相對偏低，有的種質(zhì)正好與之相反，這些種質(zhì)可以作為良好的育種資源，進(jìn)一步選育出更優(yōu)質(zhì)的品種。試驗過程中發(fā)現(xiàn)部分柴胡農(nóng)藝性狀整齊度不高，植株間良莠不齊，而農(nóng)藝性狀整齊度對產(chǎn)量和品質(zhì)都有影響[20]，因此需加大選育力度，一方面需要選育出整齊度高的品種，另一方面需進(jìn)一步提高生產(chǎn)用的種子質(zhì)量。盡管目前已經(jīng)選育出較好的柴胡品種，但柴胡選育仍需要進(jìn)一步推進(jìn)，力求柴胡在生產(chǎn)上的產(chǎn)量與應(yīng)用中的質(zhì)量都保持較高的水平。本研究在試驗過程中發(fā)現(xiàn)群體中有個別性狀突出的單株，可為下一步選育提供參考。