龍須菜蛋白質(zhì)的提取及其酶解產(chǎn)物的抗氧化特性

劉 晶，胡 曉，楊賢慶，*，陳勝軍，吳燕燕，李來好，戚 勃，鄧建朝

(1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306； 2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所，國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300)

龍須菜()屬于紅藻門、杉藻目、江蘺屬植物。龍須菜是我國第三大經(jīng)濟(jì)藻類，分支多且生長快、生長周期長。由于其含膠量高，早期主要被用作提取瓊脂的原料。近年來，研究者多對龍須菜源多糖進(jìn)行研究，已證明具有抗病毒、抗腫瘤活性、免疫調(diào)節(jié)作用、抗衰老作用等在內(nèi)的多種活性，但對龍須菜蛋白的研究較少。隨著對龍須菜了解的深入，發(fā)現(xiàn)龍須菜不僅蛋白質(zhì)含量高，而且必需氨基酸所占比例高(占總氨基酸含量的35.5%)、種類齊全，還含有具有生理活性的牛磺酸，是營養(yǎng)價(jià)值較高的蛋白質(zhì)資源。此外，龍須菜藻膽蛋白還具有清除自由基、抗腫瘤及提高小鼠免疫能力的活性作用。

現(xiàn)代研究認(rèn)為，人類攝入蛋白質(zhì)后，消化道的酶將其分解為小肽或氨基酸，絕大多數(shù)以小肽的形式消化吸收，少數(shù)以游離氨基酸形式吸收。生物活性肽是一種介于2～20個(gè)氨基酸的序列，分子量通常小于6 ku。由于氨基酸組成的多樣化，使其具有多種生物活性，包括抗氧化、抗凍、免疫調(diào)節(jié)、抗菌等功能。

蛋白質(zhì)提取的方法常有滲透法、浸漬法、凍融法、均質(zhì)法和溶劑萃取、超聲破碎和纖維素酶法等。其中超聲運(yùn)用頻率大于20 kHz的聲波產(chǎn)生壓縮和減壓，對細(xì)胞產(chǎn)生破碎、侵蝕、聲毛細(xì)血管效應(yīng)、聲穿孔、局部剪切應(yīng)力和植物細(xì)胞壁基質(zhì)的破壞性損傷。本實(shí)驗(yàn)將超聲輔助堿提酸沉法運(yùn)用在龍須菜蛋白質(zhì)的制備上。超聲波輔助法具有操作便利，提取時(shí)間短，溶劑消耗小，得率高等優(yōu)勢，作用于大型海藻細(xì)胞壁，可增加組織的多孔性和滲透性，提高蛋白溶出效果，并獲得溶解性和乳化性較好的蛋白質(zhì)。以液固比、堿濃度、超聲時(shí)間和超聲溫度對蛋白質(zhì)提取率的影響實(shí)施單因素實(shí)驗(yàn)。依據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到回歸模型以及各因素交互作用的響應(yīng)面3D圖和等高線圖，確定出最優(yōu)龍須菜粗蛋白質(zhì)提取工藝方案。制備出龍須菜蛋白質(zhì)，并測定其氨基酸組成。此外，分別使用5種酶(木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、植物蛋白復(fù)合酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶)對龍須菜蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解，測定酶解產(chǎn)物的抗氧化活性和分子量分布。并利用紅外光譜掃描比較龍須菜蛋白質(zhì)及其酶解物的結(jié)構(gòu)特性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

龍須菜()，廣東省汕頭市南澳島采收，于60 ℃烘箱中干燥至恒重，粉碎過80目篩，密封保存；BCA試劑盒，南京建成生物有限公司；木瓜蛋白酶，堿性蛋白酶，植物蛋白復(fù)合酶，胰蛋白酶，胃蛋白酶，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；1，1-二苯基-2-苦基肼自由基，2，2′-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽，Sigma-Aldrich(上海)貿(mào)易有限公司；2，4，6-三(2-吡啶基)三嗪，Adamas(上海)貿(mào)易有限公司；NaOH、濃鹽酸、濃硫酸、石油醚、無水乙醇等均為分析純。

Kjeltec TM 2 300型蛋白自動(dòng)分析儀，丹麥FOSS公司；BioTek全自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國Bio-Tek公司；JY99LLDN超聲波細(xì)胞粉碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；3K30臺式高速冷凍離心機(jī)，德國Sigma公司；Delta320精密pH 計(jì)，梅特勒-托利多儀器( 上海) 公司；Alpha1-4真空冷凍干燥機(jī)，德國Christ公司；日立835-50型高速氨基酸自動(dòng)分析儀，日本日立公司；SHZ·82A水浴恒溫振蕩器，精達(dá)儀器制造有限公司；LC-20AD高效液相色譜儀，日本島津SHINADZU公司；IRAffinity-1紅外光譜儀，日本島津SHINADZU公司。

1.2 龍須菜蛋白制備工藝

稱取適量龍須菜粉末，按照一定液固比加入NaOH，在適當(dāng)條件下采用超聲輔助堿提法處理，得到粗提取液在10 000 r·min，4 ℃下離心15 min，取上清液，即為龍須菜蛋白質(zhì)提取液，測定蛋白含量，并計(jì)算龍須菜蛋白提取率。之后用0.1 mol·LHCl調(diào)節(jié)pH至蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，靜置2 h后在10 000 r·min，4 ℃下離心15 min，收集沉淀，加超純水溶解，用0.1 mol·LNaOH調(diào)pH至中性，透析脫鹽，冷凍干燥得龍須菜粗蛋白，-20 ℃下密封保存。

1.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

以蛋白質(zhì)提取率為指標(biāo)，分別研究超聲功率、超聲時(shí)間、液固比和堿濃度4個(gè)因素對蛋白質(zhì)提取效果的影響。蛋白質(zhì)提取的因素設(shè)置為以下水平：固定超聲溫度30 ℃，超聲時(shí)間70 min，堿濃度0.2 mol·L，液固比25∶1 (mL·g)，考察不同的超聲功率300、400、500、600、700 W對蛋白質(zhì)提取率的影響；固定超聲溫度30 ℃，超聲功率500 W，堿濃度0.2 mol·L，液固比25∶1 (mL·g)，考察不同超聲時(shí)間40、50、60、70、80 min對蛋白提取率的影響；固定超聲溫度30 ℃，超聲時(shí)間70 min，超聲功率500 W，堿濃度0.2 mol·L，考察不同的液固比15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1 (mL·g)對蛋白提取率的影響；固定超聲溫度30 ℃，超聲時(shí)間70 min，超聲功率500 W，液固比25∶1 (mL·g)，考察不同的堿濃度0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mol·L對蛋白提取率的影響。每組實(shí)驗(yàn)3次平行，結(jié)果依據(jù)SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析和多重比較分析，得到顯著性因素。

1.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

利用Design-Expert 10.0.3軟件中的Box-behnken design(BBD)設(shè)計(jì)原理采取合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)施相應(yīng)曲面法。超聲功率、液固比、超聲時(shí)間和堿濃度(由單因素實(shí)驗(yàn)確定)作為實(shí)驗(yàn)因素，-1、0、1分別代表各因素的三個(gè)水平，共設(shè)計(jì)出29組實(shí)驗(yàn)。以龍須菜蛋白提取率為響應(yīng)值。實(shí)驗(yàn)水平因素見表1。

表1 因素水平編碼表

1.3 酶解產(chǎn)物的制備

稱取一定質(zhì)量的龍須菜粗蛋白質(zhì)，以料液比為1∶50(g·mL)比例加入超純水，根據(jù)表2的實(shí)驗(yàn)條件調(diào)節(jié)pH和溫度，分別按3%的加酶量加入5種酶，水浴振蕩酶解4 h，酶解完成后煮沸滅酶20 min，冷卻，10 000 r·min，4 ℃下離心15 min，取上清液，即為龍須菜蛋白酶解液，冷凍干燥后得龍須菜酶解產(chǎn)物，-20 ℃下密封保存。

表2 龍須菜蛋白酶解條件

1.4 抗氧化活性測定

1.4.1 鐵離子還原能力(FRAP)

測定方法參考文獻(xiàn)[12]，制備FRAP工作液，含0.3 mol·L醋酸鹽緩沖液(pH 3.6)、0.01 mol·L2，4，6-三吡啶-S-三嗪[TPTZ]、0.02 mol·LFeCl·6HO 10∶1∶1，現(xiàn)配現(xiàn)用。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)不同濃度的FeSO標(biāo)準(zhǔn)液(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L)與FRAP工作液反應(yīng)后測得的吸光度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得回歸方程為=0232 3+0001 2，=0.996，線性良好。

在0.1 mL 2 mg·mL待測樣品中加入1.8 mL FRAP工作液，并用蒸餾水補(bǔ)足至5 mL，混勻，37 ℃下反應(yīng)30 min，593 nm處讀出吸光度。同時(shí)以0.1 mL蒸餾水作空白對照。所有實(shí)驗(yàn)3組平行。計(jì)算鐵離子還原能力。

1.4.2 DPPH自由基清除能力

測定方法參考文獻(xiàn)[13]，將1 mL 2 mg·mL待測樣品與1 mL 100 μmol·LDPPH溶液(無水乙醇作為溶劑)混合均勻，暗室孵育30 min(室溫)。于517 nm處測得吸光度。所有實(shí)驗(yàn)3組平行。計(jì)算DPPH自由基清除活性。

1.4.3 ABTS自由基清除能力

測定方法參考文獻(xiàn)[14]，14.8 mmol·LABTS和5.2 mmol·L過硫酸鉀1∶1混合并在黑暗條件下反應(yīng)12 h制備ABTS工作液。在734 nm處用無水乙醇稀釋上述制得的工作液以獲得1.1±0.02的吸光度。用50 μL 2 mg·mL待測樣品與950 μL ABTS試劑混合，黑暗條件下靜置2 h，并在734 nm處測量上清液的吸光度。所有實(shí)驗(yàn)3組平行。計(jì)算ABTS自由基清除活性。

1.5 基礎(chǔ)特性測定

1.5.1 氨基酸分析

精確稱取龍須菜蛋白質(zhì)于密封瓶中，加入6 mol·LHCl，充氮?dú)夥馄浚?10 ℃下水解22 h，過膜，使用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行分析。色氨酸測定用5 mol·LNaOH，在110 ℃下堿解22 h后上機(jī)分析。氨基酸評分(AAS)依據(jù)FAO/WHO提出的人體必需氨基酸均衡模式進(jìn)行計(jì)算?；瘜W(xué)評分(CS)依據(jù)中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究所提出的雞蛋蛋白氨基酸評分模式分析計(jì)算。

1.5.2 傅里葉紅外光譜

取用適量龍須菜蛋白質(zhì)及酶解產(chǎn)物進(jìn)行壓片，將制備好的樣品KBr壓片在400～4 000 cm波長范圍內(nèi)掃描。

1.5.3 分子量的測定

采用高效體積排阻色譜法，色譜柱為TSK-GELG2000SWXL(7.8 mm×300 mm)，流動(dòng)相為0.1%三氟乙酸的乙腈和0.1%三氟乙酸的雙蒸水，以0.5 mL·min的流速洗脫40 min。將還原性谷胱甘肽(307.3 u)、L-氧化型谷胱甘肽(612.63 u)、桿菌肽(1 422.69 u)、抑肽酶(6 511.83 u)、細(xì)胞色素C(12 400 u)，用流動(dòng)相溶解并配制成濃度為2 mg·mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在214 nm的波長下檢測。

1.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用IBM SPSS Statistics 25.0軟件進(jìn)行單因素方差(One-way ANOVA)的顯著性差異分析， 通過LSD法進(jìn)行單因素多重比較分析。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，差異顯著水平設(shè)置為<0.05。采用Origin 2019b軟件制圖。利用Design-Expert 10.0.3軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的多元回歸擬合分析。紅外光譜掃描采用OMNIC軟件擬合制圖。

2 結(jié)果及分析

2.1 不同超聲條件對龍須菜蛋白提取率的影響

如圖1所示，在超聲功率小于500 W的條件下，超聲功率的增加會帶動(dòng)空化作用及機(jī)械作用的加強(qiáng)，使得分子運(yùn)動(dòng)加劇，龍須菜細(xì)胞壁被加速破壞，蛋白質(zhì)溶出加快，所以蛋白質(zhì)提取率迅速上升；在500 W時(shí)蛋白質(zhì)的提取率達(dá)到最大，隨后提取率下降可能是因?yàn)槌晱?qiáng)度過大產(chǎn)生大量的空化氣泡無法完全潰滅，空化效率減弱。由單因素方差分析，各處理組之間存在顯著性差異(<0.05，圖1-A)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用500 W。

當(dāng)超聲提取時(shí)間從40～70 min增加時(shí)，龍須菜蛋白質(zhì)提取率也在逐漸增加，70 min時(shí)的提取率最大。這是超聲時(shí)間的延長促進(jìn)了蛋白質(zhì)的溶出，因此，增加了蛋白質(zhì)的提取率；當(dāng)提取時(shí)間進(jìn)一步延長到大于70 min后，提取率出現(xiàn)了下降，這可能是由于超聲波將龍須菜細(xì)胞中的酶溶出，部分之前溶出的蛋白質(zhì)被酶降解，從而造成蛋白質(zhì)提取率下降。由單因素方差分析，各處理組之間存在顯著性差異(<0.05，圖1-B)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用70 min的超聲時(shí)間。

當(dāng)液固比從15∶1(mL·g)增加至25∶1(mL·g)，隨著溶劑的量逐漸加大，龍須菜蛋白質(zhì)提取率迅速增加，液固比為25∶1(mL·g)時(shí)蛋白質(zhì)的提取率最大。這是因?yàn)橐汗瘫戎饾u增加會讓溶液黏度變低，使分子擴(kuò)散速率加快，此時(shí)體系內(nèi)各物質(zhì)分散均勻，可以很好地促進(jìn)龍須菜蛋白質(zhì)的溶出。然而繼續(xù)增加溶劑的量，蛋白質(zhì)提取率出現(xiàn)了緩慢下降的趨勢，可能是由于內(nèi)容物的大量溶出導(dǎo)致溶液黏度升高，分子擴(kuò)散速率變緩，導(dǎo)致蛋白質(zhì)提取率效果不理想。由單因素方差分析，各處理組之間存在顯著性差異(<0.05，圖1-C)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用25∶1(mL·g)的液固比。

隨著堿濃度增加，龍須菜蛋白提取率不斷增加，堿濃度為0.2 mol·L時(shí)的蛋白質(zhì)提取率最高。這是由于堿濃度的增加，龍須菜的致密結(jié)構(gòu)松散程度變大，同時(shí)促進(jìn)了氨基酸極性基團(tuán)的解離程度，使其表面具有同樣的電荷，增加溶出效果。另外蛋白質(zhì)分子上的氨根離子也會被電離，使游離蛋白質(zhì)增加，大多數(shù)水溶性蛋白的溶解程度也會加大。但是堿濃度偏高的情況下會使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)遭到破壞，分子內(nèi)部疏水性基團(tuán)被暴露，蛋白質(zhì)的溶解性降低，有蛋白沉淀生成(脫氨脫羧反應(yīng)的結(jié)果)，這也是堿濃度逐漸加大后蛋白質(zhì)提取率下降的原因。由單因素方差分析，各處理組之間存在顯著性差異(<0.05，圖1-D)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用0.2 mol·L的堿濃度。

點(diǎn)線圖上無相同小寫字母的表示各處理間差異顯著(P<0.05)。

2.2 響應(yīng)面分析

2.2.1 實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)與顯著性分析

以龍須菜蛋白提取率為值，堿濃度(A)、液固比(B)、超聲時(shí)間(C)、超聲功率(D)為自變量，根據(jù)Design-Expert 10.0.3軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析擬合后得出四元二次回歸模型方程

(%)=74.52-1.47A-2.19B+0.96C-1.01D+1.42AB+1.97AC-0.17AD+3.43BC+6.03BD-5.06CD-3.47A-6.33B-9.25C-7.21D。

表3 模型回歸方程方差分析

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化及工藝驗(yàn)證

經(jīng)Design-Expert 10.0.3軟件對堿濃度(A)、液固比(B)、超聲時(shí)間(C)、超聲功率(D)的交互作用進(jìn)行分析，得到響應(yīng)面3D圖及等高線圖，該圖組可反映各因素及其交互作用對龍須菜蛋白提取率的影響。具體如圖2-圖4所示。

圖2 液固比與超聲時(shí)間交互作用的響應(yīng)面3D圖及等高線圖

圖3 液固比與超聲功率交互作用的響應(yīng)面3D圖及等高線圖

圖4 超聲時(shí)間與超聲功率交互作用的響應(yīng)面3D圖及等高線圖

由Design-Expert 10.0.3軟件分析得到龍須菜蛋白質(zhì)的最優(yōu)提取工藝為堿濃度0.19 mol·L、液固比23.94∶1(mL·g)、超聲時(shí)間70.46 min、超聲功率482.22 W，此條件下的提取率預(yù)測值為75.14%。根據(jù)實(shí)際操作可行性，龍須菜蛋白提取工藝條件調(diào)整為堿濃度0.2 mol·L、液固比24∶1(mL·g)、超聲時(shí)間70 min、超聲功率482 W，3次平行試驗(yàn)后得到龍須菜蛋白提取率為(73.78±1.36)%，與理論值比較接近，表明此響應(yīng)面模型優(yōu)化得到的龍須菜蛋白提取工藝可靠，可將其應(yīng)用于實(shí)踐中。

2.3 龍須菜蛋白質(zhì)氨基酸分析

由表4可知，龍須菜蛋白質(zhì)中包含了人體所需的8種必需氨基酸。其中Glu、Cys含量較高，Asp、Leu的含量次之。必需氨基酸占比為36.71%，非必需氨基酸占比為63.29%，這與FAO/WHO理想氨基酸標(biāo)準(zhǔn)接近，表明龍須菜蛋白質(zhì)氨基酸組成合理。同時(shí)采用FAO/WHO聯(lián)合推薦的必需氨基酸模式和雞蛋蛋白模式評估蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值。賴氨酸為第一限制性氨基酸。龍須菜蛋白質(zhì)中的Val、Met、Leu、Phe+Tyr、Ile、Thr均高于FAO/WHO氨基酸標(biāo)準(zhǔn)模式；Val、Leu、Phe+Tyr、Ile、Thr高于雞蛋蛋白氨基酸模式，表明龍須菜蛋白質(zhì)氨基酸組成符合人體需求模式，是一種理想植物蛋白源。

表4 龍須菜蛋白氨基酸組成及必需氨基酸分析

2.4 龍須菜蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物特性分析

2.4.1 抗氧化能力

龍須菜蛋白質(zhì)經(jīng)不同蛋白酶水解后其酶解產(chǎn)物抗氧化活性如圖5所示。由圖5可知，提取得到的龍須菜蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為2 mg·mL時(shí)，其鐵離子還原能力(FRAP)、DPPH自由基清除率和ABTS自由基清率分別為51.58 μg·mL、40.67%、50.10%。這與蔡苗苗等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果接近，其對超聲輔助水提法提取出的舌狀蜈蚣藻()粗蛋白質(zhì)進(jìn)行抗氧化活性測定，結(jié)果表明其還原力、DPPH自由基清除能力及 ABTS自由基清除能力均存在劑量依賴，證明藻類蛋白具有一定抗氧化活性。龍須菜蛋白質(zhì)經(jīng)不同蛋白酶水解后，其抗氧化活性均有不同程度的提升。當(dāng)酶解產(chǎn)物質(zhì)量濃度為2 mg·mL時(shí)，堿性蛋白酶的龍須菜酶解產(chǎn)物DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率和鐵離子還原能力(FRAP)均顯著高于其他4種蛋白酶的酶解產(chǎn)物和同濃度下的龍須菜蛋白質(zhì)。這與陳洪彬等對龍須菜多肽的體外抗氧化活性研究結(jié)果相近，表明龍須菜抗氧化肽具有一定清除DPPH自由基能力和還原力。酶解產(chǎn)物抗氧化活性的提高可能是由于大分子物質(zhì)在與自由基反應(yīng)時(shí)會存在較大的空間位阻，導(dǎo)致抗氧化活性低下。而經(jīng)進(jìn)一步酶解后，大分子蛋白質(zhì)在酶的作用下被剪切為更小的肽片段，能夠與自由基充分反應(yīng)。

酶種類E1、E2、E3、E4、E5分別為木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、植物蛋白復(fù)合酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶，P表示龍須菜蛋白質(zhì)。柱狀圖上無相同小寫字母的表示各處理間差異顯著(P <0.05)。

2.4.2 分子量分布分析

龍須菜蛋白質(zhì)不同酶解產(chǎn)物的分子量分布如表5所示。由表5可知，在龍須菜蛋白質(zhì)5種酶解產(chǎn)物中，分子量<1 500 u的組分占比均可達(dá)到50%以上，其中木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物其分子量>5 000 u的組分含量最多，而胃蛋白酶酶解產(chǎn)物<500 u的組分含量最多。Chai等的研究表明，大多數(shù)抗氧化肽的分子量在500～1 800 u，且通常認(rèn)為分子量較小的肽抗氧化活性較好。同時(shí)Aleman等的研究表明，酶解產(chǎn)物分子量過小可能會因含有大量的游離氨基酸而使其抗氧化活性降低。在龍須菜蛋白質(zhì)不同酶解產(chǎn)物中，堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物其分子量在500～1 500 u組分含量均高于其他4種酶解產(chǎn)物，其酶解產(chǎn)物抗氧化活性也最高。

表5 酶解產(chǎn)物的分子量分布

2.5 傅里葉紅外光譜分析

龍須菜蛋白質(zhì)及其堿性蛋白酶酶解后產(chǎn)物的傅里葉紅外光譜見圖6。由圖6所示，酶解產(chǎn)物的圖譜相對于蛋白質(zhì)而言發(fā)生了一定遷移。兩種物質(zhì)的紅外光譜由酰胺A、B和酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ帶組成。酰胺A帶處于波長3 300～3 340 cm，反映了N-H與O-H中氫鍵的伸縮振動(dòng)吸收。位于1 600～1 660 cm波長范圍內(nèi)的酰胺Ⅰ帶是C=O鍵的特征譜帶， 能夠有效地反映三螺旋結(jié)構(gòu)。酰胺Ⅰ帶對分子幾何結(jié)構(gòu)和氫鍵模式的微小變化非常敏感，因此每種類型的二級結(jié)構(gòu)都會產(chǎn)生不同的C=O拉伸頻率。從圖譜中可以看出，龍須菜蛋白質(zhì)在1 645 cm有強(qiáng)烈的伸縮振動(dòng)，酶解產(chǎn)物則遷移到1 649 cm處發(fā)生伸縮振動(dòng)，表明蛋白質(zhì)具有更為完整的三螺旋結(jié)構(gòu)。酰胺Ⅱ帶中1 530～1 510 cm區(qū)域與1 550～1 530 cm區(qū)域分別表明反平行β-折疊結(jié)構(gòu)與平行β-折疊結(jié)構(gòu)的存在，龍須菜蛋白質(zhì)在1 537 cm處具有吸收峰，表明龍須菜蛋白質(zhì)存在平行β-折疊結(jié)構(gòu)；酶解產(chǎn)物在1 511 cm處具有吸收峰，表明酶解產(chǎn)物有反平行β-折疊結(jié)構(gòu)存在。龍須菜蛋白質(zhì)在1 030 cm處產(chǎn)生強(qiáng)烈的吸收峰，極可能是由于C-N鍵發(fā)生的伸縮振動(dòng)。紅外光譜分析初步表明，龍須菜蛋白質(zhì)經(jīng)堿性蛋白酶酶解后結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定變化，蛋白質(zhì)中完整的三螺旋結(jié)構(gòu)被水解破壞，平行β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榉雌叫笑?折疊結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)的變化可能會將蛋白質(zhì)中原本被緊密包裹的活性基團(tuán)暴露，使得酶解產(chǎn)物更易被自由基奪取電子，具備更好的抗氧化能力。

圖6 龍須菜蛋白與酶解產(chǎn)物紅外光譜掃描圖

3 結(jié)論

本研究以龍須菜為原料，采用超聲輔助堿提酸沉法制備龍須菜蛋白質(zhì)，在單因素實(shí)驗(yàn)的前提下，運(yùn)用響應(yīng)面法對龍須菜蛋白質(zhì)的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，建立了方程擬合度良好且顯著的響應(yīng)面模型。研究得到龍須菜蛋白質(zhì)的最佳提取工藝條件為堿濃度0.2 mol·L、液固比24∶1(mL·g)、超聲時(shí)間70 min、超聲功率482 W，實(shí)際提取率達(dá)到73.78%與理論值大致相近。對龍須菜蛋白質(zhì)進(jìn)行氨基酸分析結(jié)果表明，龍須菜蛋白是一種優(yōu)質(zhì)理想的植物蛋白源。此外，分別采用木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、植物蛋白復(fù)合酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶對龍須菜蛋白質(zhì)進(jìn)行了酶解。該5種酶解產(chǎn)物在抗氧化活性和分子量分布上均呈現(xiàn)出一定差異?？偟膩碚f，龍須菜蛋白酶解物的抗氧化活性均高于同濃度下的龍須菜蛋白，且堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的抗氧化活性最高，其分子量主要集中在1 500 u以下。傅里葉紅外光譜掃描表明龍須菜蛋白與其酶解物具有不同結(jié)構(gòu)特性。本文可為龍須菜蛋白的提取及高值化利用提供一定參考。