復方七芍降壓片對自發(fā)性高血壓大鼠腎動脈重塑的影響

曾勇， 文愛珍， 符艷， 柳玉佳， 李弘， 范伏元， 游海

（1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學，湖南長沙 410208）

高血壓病是一種嚴重危害人類健康的常見心血管系統(tǒng)疾病，我國成人高血壓病患病率達到27.9%[1]。隨著研究的不斷深入，高血壓病不再被認為僅僅是血液動力學的改變，而是伴隨著炎癥水平上升和心血管重塑等的病理過程[2]。血管重塑是高血壓病靶器官損害的病理基礎，也是患者心血管事件發(fā)生率和死亡率上升的主要原因[3]。因此，開發(fā)有效治療高血壓病血管重塑的藥物具有重要的臨床意義。中醫(yī)藥立足于辨證論治，可多層次、多靶點進行整體調(diào)節(jié)，且作用溫和、療效確切，在高血壓病血管重塑的防治中，其作用受到越來越多的關注。高血壓病歸屬于中醫(yī)學“眩暈”“頭痛”的范疇。復方七芍降壓片具有養(yǎng)陰柔肝、活血通脈的功效，前期研究發(fā)現(xiàn)復方七芍降壓片能降低高血壓患者及自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）血壓[4]，對SHR血管重塑有較好的調(diào)節(jié)作用[5-6]，但其具體機制尚不清楚。本研究以SHR 為研究對象，采用在體實驗，探討復方七芍降壓片干預逆轉SHR 腎動脈重塑的可能機制?，F(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1. 1動物SPF 級雄性SHR 30 只，6 ～7 周齡，體質(zhì)量130 ～150 g；SPF 級雄性WKY 大鼠10 只，6 ～7 周齡，體質(zhì)量130～150 g。均由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。動物質(zhì)量合格證號：11400700359571；動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-006；實驗動物環(huán)境設施合格證號：SYXK（湘）2015-0003。

1.2 藥物復方七芍降壓片由三七、白芍、天麻、丹參、桑寄生、杜仲、羅芙木、地龍、葛根、炒香附、甘草組成，0.46 g/片，由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院制劑室制備，批號：20181026，人臨床日用量為12 片，相當于含生藥量97 g；厄貝沙坦片，75 mg/片，由揚子江藥業(yè)集團北京海燕藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：17122111，人臨床日用量為300 mg。

1. 3試劑與儀器Ⅰ型膠原（COⅠ）、Ⅲ型膠原（COⅢ）抗體（北京Bioss公司）；免疫球蛋白（IgG）-辣根過氧化物酶（HRP）標記抗體（長沙麗欣生物有限公司）。H1850型低速臺式離心機（湖南湘儀儀器有限公司）；超低溫冰箱（杭州旭清科技有限公司）；BMJ-1n型病理組織包埋機和包埋冷凍臺（上海珂淮儀器有限公司）；TS-12F 型生物組織自動脫水機（上海華巖儀器設備有限公司）；LKB-Ⅲ型超薄切片機（廣州華俊科技有限公司）；倒置顯微鏡和照相裝置（日本Olympus公司）；KS400 型圖像分析儀（德國Zisse公司）。

1.4 分組與給藥30只SHR根據(jù)給藥前血壓和體質(zhì)量，隨機分為模型對照組、厄貝沙坦片組、復方七芍降壓片組，每組10 只；另設10 只WKY 大鼠為正常對照組。厄貝沙坦片組給予相當于臨床等效劑量的厄貝沙坦片混懸液（27 mg·kg-1·d-1）灌胃；復方七芍降壓片組給予相當于臨床等效劑量的復方七芍降壓片混懸液（496.8 mg·kg-1·d-1）灌胃；正常對照組和模型對照組給予等體積蒸餾水（10 mL·kg-1）灌胃。每天1 次，連續(xù)給藥6周。每周測量1次血壓和體質(zhì)量，根據(jù)每周體質(zhì)量調(diào)整下周給藥量。

1.5 蘇木素-伊紅染色法觀察腎動脈組織病理形態(tài)麻醉大鼠后，開腹，迅速分離腎動脈，生理鹽水沖洗干凈，于40 g/L多聚甲醛中固定，梯度乙醇脫水，浸蠟包埋，切厚度為4 μm 的切片，蘇木素-伊紅染色，中性樹膠封片，光鏡下觀察、拍照。運用計算機圖像分析系統(tǒng)測量管壁厚度、血管中膜厚度及相同位置的管腔直徑，計算血管中膜厚度與管腔直徑的比值。

1.6 免疫組織化學法檢測腎動脈組織COⅠ、COⅢ表達蠟塊常規(guī)切片，脫蠟至水，分別加入COⅠ、COⅢ抗體孵育（37 ℃，2 h），IgG-HRP標記抗體孵育30 min。DAB 顯色，脫水封片，于光鏡顯微鏡下拍照，并釆用MOTIC 圖像分析軟件對所取圖片定量分析，測定陽性反應產(chǎn)物的平均光密度，COⅠ、COⅢ陽性著色表現(xiàn)為散在或片狀的棕黃色或棕褐色顆粒。

1.7 統(tǒng)計方法采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示。多組比較采用重復測量方差分析和單因素方差分析，各組間兩兩比較采用LSD法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠腎動脈組織病理形態(tài)學比較經(jīng)藥物干預6周后，與正常對照組比較，模型對照組大鼠的腎動脈內(nèi)膜粗糙不平，甚至有內(nèi)膜脫落情況，平滑肌細胞數(shù)量增加、分布不均勻、排列紊亂；與模型對照組比較，厄貝沙坦片組大鼠腎動脈內(nèi)膜欠平整，無明顯內(nèi)膜脫落情況，血管平滑肌細胞數(shù)量增多、分布不均勻、排列不同程度紊亂，而復方七芍降壓片組大鼠腎動脈內(nèi)膜欠平整，無內(nèi)膜脫落情況，血管平滑肌細胞數(shù)量無增多、分布尚均勻、排列無明顯紊亂。具體結果見圖1。結果表明，復方七芍降壓片能夠改善高血壓大鼠受損的腎動脈組織形態(tài)。

圖1 各組大鼠腎動脈組織病理形態(tài)學特征比較（HE染色法，×400）Figure 1 Comparison of pathemorphological features of renal artery between various groups of rats（by HE staining method，×400）

將獲得的圖片應用計算機圖像分析系統(tǒng)測量其血管管壁厚度、中膜厚度及相同位置的管腔直徑，并計算后二者比值。與正常對照組比較，模型對照組大鼠血管管壁厚度、中膜厚度/管腔直徑比值明顯升高（P＜0.01）；藥物干預后，與模型對照組比較，厄貝沙坦片組和復方七芍降壓片組大鼠血管管壁厚度、中膜厚度/管腔直徑比值明顯降低（P＜0.05）。具體結果見表1。

表1 各組大鼠腎動脈管壁厚度和中膜厚度/管腔直徑比值比較Table 1 Comparison of renal arterial wall thickness and ratio of mid-membrane thickness/lumen diameter between various groups of rats （±s，n=3）

表1 各組大鼠腎動脈管壁厚度和中膜厚度/管腔直徑比值比較Table 1 Comparison of renal arterial wall thickness and ratio of mid-membrane thickness/lumen diameter between various groups of rats （±s，n=3）

①P＜0.01，與正常對照組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型對照組比較

組別正常對照組模型對照組厄貝沙坦片組復方七芍降壓片組中膜厚度/管腔直徑比值0.221±0.036 0.545±0.119①0.385±0.015②0.358±0.017②鼠數(shù)/只10 10 10 10管壁厚度/μm 422.938±63.772 631.120±13.939①513.410±50.865②440.585±18.748②中膜厚度/μm 91.241±14.911 105.323±12.915①116.669±28.941②109.046±20.190②管腔直徑/μm 421.422±94.994 225.303±77.544①303.489±61.249③297.017±57.096③

2.2 各組大鼠腎動脈中COⅠ、COⅢ蛋白表達的比較光鏡下可見：正常對照組大鼠腎動脈組織呈弱陽性染色，內(nèi)膜光滑；模型對照組大鼠腎動脈組織呈強陽性染色，內(nèi)膜損傷明顯，平滑肌細胞數(shù)目增多，排列紊亂；厄貝沙坦片組和復方七芍降壓片組大鼠腎動脈組織呈弱陽性染色，內(nèi)膜損傷較模型對照組得到改善。COⅠ、COⅢ陽性表達主要定位于細胞漿。結果見圖2、圖3。

圖2 各組大鼠腎動脈COⅠ陽性表達的比較（免疫組織化學法，×400）Figure 2 Comparison of COⅠpositive expression in renal artery between various groups of rats（by immunohistochemistry，×400）

圖3 各組大鼠腎動脈COⅢ陽性表達的比較（免疫組織化學法，×400）Figure 3 Comparison of COⅢpositive expression in renal artery between various groups of rats（by immunohistochemistry，×400）

與正常對照組比較，模型對照組大鼠腎動脈中COⅠ、COⅢ蛋白表達的平均光密度均明顯增加（P＜0.01）；藥物干預后，與模型對照組比較，厄貝沙坦片組和復方七芍降壓片組大鼠腎動脈中COⅠ、COⅢ蛋白表達的平均光密度均明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01）。結果見表2。

表2 各組大鼠腎動脈CO I和CO Ⅲ平均光密度值的比較Table 2 Comparison of mean optical density values of CO I and CO Ⅲin renal artery between various groups of rats （±s）

表2 各組大鼠腎動脈CO I和CO Ⅲ平均光密度值的比較Table 2 Comparison of mean optical density values of CO I and CO Ⅲin renal artery between various groups of rats （±s）

①P＜0.01，與正常對照組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型對照組比較

COⅢ0.391±0.042 0.436±0.034①0.397±0.088③0.415±0.066③組別正常對照組模型對照組厄貝沙坦片組復方七芍降壓片組鼠數(shù)/只10 10 10 10 COⅠ0.504±0.060 0.530±0.054①0.526±0.030②0.529±0.035③

3 討論

高血壓病引發(fā)的血管重塑進一步發(fā)展會導致一系列的靶器官損傷[7]。小動脈、微動脈和毛細血管的結構與功能改變也是心腦血管疾病形成靶器官損害的重要病理基礎[8]。而腎動脈作為阻力血管，其功能和結構改變會誘導血管重塑的發(fā)生，造成血液中舒血管活性物質(zhì)的減少，使血壓進一步升高，出現(xiàn)靶器官損傷，形成惡性循環(huán)[9]，且這種表現(xiàn)比主動脈表現(xiàn)得更加顯著[10]。而厄貝沙坦降壓的同時可以改善血管重塑[11]。因此，本研究以厄貝沙坦片為陽性對照藥，針對SHR 腎動脈的重塑機制及中藥干預作用進行實驗研究。

血管重塑最典型的特征為內(nèi)膜內(nèi)皮細胞腫脹，血管中膜平滑肌細胞（VSMC）增生和外膜細胞外基質(zhì)（ECM）COⅠ、COⅢ等沉積。VSMC 發(fā)生增生、肥大和向內(nèi)膜遷移時，會造成血管壁肥厚、管腔減小，這是導致血管重塑的關鍵機制之一[12]。在生理狀態(tài)下，VSMC 通常處于收縮型的靜止狀態(tài)；當處于高血壓等病理狀態(tài)時，VSMC會由收縮型向合成型轉變，呈現(xiàn)高增殖速率、遷移率，導致管腔比率下降，中膜比率升高，引發(fā)血管重塑[13-15]。高血壓病整個病程中伴隨著血管重塑。早期由于體內(nèi)交感神經(jīng)末梢合成、釋放去甲腎上腺素增多，小動脈（如腎動脈）平滑肌細胞內(nèi)Na+-K+-ATP酶活性降低，胞內(nèi)游離Ca2+水平升高，表現(xiàn)為小動脈平滑肌對各種刺激反應性增強，引起小動脈重塑，隨著病程進展合并出現(xiàn)中、大動脈血管重塑[16]。本研究通過HE 染色觀察，結果顯示，與正常對照組比較，模型對照組大鼠腎動脈內(nèi)膜損傷，中膜VSMC 數(shù)量增加、排列紊亂，管壁肥厚，管腔減小，提示處于高血壓等病理狀態(tài)時，腎動脈管壁肥厚、管腔減小，可能引發(fā)動脈重塑。給予復方七芍降壓片干預后，上述現(xiàn)象得到了改善。通過免疫組織化學法檢測發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，模型對照組大鼠腎動脈中COⅠ、COⅢ表達水平均升高，提示高血壓腎動脈管壁中COⅠ、COⅢ膠原產(chǎn)生，導致血管重塑。復方七芍降壓片干預后，與模型對照組比較，大鼠腎動脈COⅠ、COⅢ表達水平均降低，提示復方七芍降壓片可減少膠原生成，緩解血管重塑。

綜上所述，復方七芍降壓片可改善SHR 腎動脈重塑，抑制腎動脈重塑的機制與抑制平滑肌細胞的增殖、遷移及COⅠ、COⅢ膠原蛋白沉積有關。